薄基底膜肾病患者基底膜Ⅳ型胶原α链的表达
作者：丁洁 柴青 刘景城 张英 杨霁云
单位：丁洁(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；柴青(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；刘景城(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；张英(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；杨霁云(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)
关键词：薄基底膜肾病；Ⅳ型胶原；Alport综合征
肾脏病与透折肾移植杂志000205 摘 要 目的：检测薄基底膜肾病(TBMN)患者基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达，探讨其发病机制；并与Alport综合征(AS)比较，为鉴别TBMN和AS提供帮助。 方法：用抗Ⅳ型胶原不同α链的单克隆抗体，采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法检测了6例TBMN、3例X连锁型AS男性患儿及2例正常对照肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链的表达；采用间接免疫荧光法检测了3例TBMN、4例X链锁型AS男性患儿及4例正常对照皮肤基底膜中α1(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链的表达。 结果：TBMN患儿肾小球基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3～5链表达同正常，均为沿基底膜连续线状沉积。X连锁型AS男性患儿肾小球基底膜显示Ⅳ型胶原α1链染色阳性，而α3～5链染色均为阴性。TBMN、AS患儿及正常对照皮肤基底膜中α1(Ⅳ)链染色均为沿基底膜连续线状沉积；而α5(Ⅳ)链染色仅在AS为阴性，在TBMN和正常对照均为连续线状沉积。 结论：TBMN患儿基底膜中α(Ⅳ)链表达不同于AS。
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EXPRESSIONS OF TYPE Ⅳ COLLAGEN α CHAINS IN BASEMENT MEMBRANES OF THIN BASEMENT MEMBRANE NEPHRITIS
DING Jie，CHAI Qing，LIU Jingchang，ZHANG Ying，YANG Jiyun
(Department of Pediatrics，First Hospital，Beijing Medical University，Beijing，100034)
OBJECTIVE To detect the basement membrane α(Ⅳ) chains expressions in thin basement membrane nephritis(TBMN)and Alport syndrome，and to find the difference of the expressions between the two diseases. METHODOLOGY The monoclonal antibodies against type Ⅳ collagen α chains were applied in the methods of streptavidin peroxidase conjugated staining(SP)and indirect immunofluorescence.The expressions of α(Ⅳ)chains in glomerular basement membrane(GBM) were detected by SP in 6 TBMN，2 X-linked AS male patients，and 2 normal controls.The expressions of α(Ⅳ)chains in epidermal basement membrane(EBM)were detected by IF in 3 TBMN，4 X-lined AS male patients and 4 normal controls. RESULTS The α1(Ⅳ) and α3-5(Ⅳ)chains expressions were found linear positive along the GBM in TBMN patients，in a same pattern as in the normal controls.In X-linked AS male patients，the expression of α1(Ⅳ)chain was positive while the expressions of α3-5(Ⅳ)chains were negative in GBM.The expressions of α1(Ⅳ)chains were found positive in a linear pattern along EBM in TBMN patients，while the expression of α5(Ⅳ) chain in EBM was found negative in X-linked AS male patients. CONCLUSION The expressions of α(Ⅳ) chains in EBM and GBM can be used in the differential diagnosis between TBMN and AS.
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Key words thin basement membrane nephritis collagen type Ⅳ alport syndrome Ⅳ alport syndrome
薄基底膜肾病(thin basement membrane nephritis，TBMN)指临床表现为良性家族性血尿，病理以肾小球基底膜弥漫性变薄为特征的遗传性肾脏病。多数学者认为TBMN主要为常染色体显性遗传，但其发病机制仍未澄清。国外曾有报道基因连锁分析定位TBMN基因在常染色体2q35-37，此处正是编码Ⅳ型胶原α3和α4链的基因COL4A3和COL4A4所在[1]。1996年芬兰的研究还曾显示，在一良性家族性血尿家系中检测出Ⅳ型胶原α4链基因的突变[2]。因此，我们设计并进行本研究，旨在检测COL4A3和COL4A4基因编码的Ⅳ型胶原α3和α4链在基底膜的表达，以助TBMN发病机制的研究；同时经与Alport综合征(AS)患儿的基底膜Ⅳ型胶原α链表达比较，试图为TBMN和AS的鉴别提供帮助。
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1 对象和方法
1.1 对象 1995年以来我院诊治的TBMN患儿9例，男6例，女3例，年龄5～11岁，平均病程1年，临床主要表现为血尿，肾功能均正常。2/9例有明确血尿家族史。9例患儿的肾活组织电镜检查均显示肾小球基底膜(GBM)弥漫或节段性变薄，符合TBMN诊断；而光镜和免疫荧光镜检查无特异性改变。实验中分别检测了6例患儿的肾脏组织和3例患儿的皮肤组织中Ⅳ型胶原α链的表达。
选取2例X连锁型AS男性患儿的肾组织以及4例X连锁型AS男性患儿的皮肤组织与TBMN进行比较。AS患儿平均年龄10岁，平均病程5年。患儿均表现为持续性镜下血尿，其中2例伴有蛋白尿；5/6例纯音测听显示感音神经性耳聋；5/6例家族史中均显示有男性成员肾功能衰竭。全部AS患儿均经肾活组织电镜检查显示GBM薄厚不均、分层以及断裂，因而确诊为AS。
正常对照取2例肾肿瘤切除时的正常肾组织和4例外科手术所取皮肤组织，分别作为本研究的肾脏和皮肤对照。
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1.2 方法
1.2.1 肾组织标本用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method，SP法)检测基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链的表达。肾组织病理标本经福尔马林固定、石蜡切片，以微波炉进行抗原修复以及SP染色，方法同我们以前的报道[3]。
1.2.2 皮肤组织标本用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IF)检测皮肤基底膜中Ⅳ型胶原α1和α5链的表达，实验方法同我们以前的报道[4]。
1.2.3 实验中所用抗Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链NC1片断的单克隆抗体均由美国明尼苏达大学Alfred Michael教授惠赠。其它主要试剂来源为：生物素标记马抗鼠IgG：Vector Laboratories；SA-HRP(Streptavidin Horseradish Peroxidase)：Vector Laboratories；DAB粉末：北京中山生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗小鼠IgG抗体：美国Jackson Immuno Research Laboratory，Inc.。
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2 结 果
2.1 肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达TBMN患儿肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原各α链的表达同正常对照，均为沿基底膜的连续线状沉积；但X连锁型AS男性患儿除α1(Ⅳ)染色同正常对照为阳性，α5(Ⅳ)、α3(Ⅳ)和α4(Ⅳ)链的染色均为阴性(附表)。
Table. The expressions of α(Ⅳ)chains in EBM and GBM GROUPS
GBM
EBM
n
α1
α3
α4
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α5
n
α1
α5
TBMN
6
+
+
+
+
3
+
+
X-linked AS male patients
, 百拇医药
2
+
-
-
-
4
+
-
Normal control
2
+
+
+
+
, 百拇医药
4
+
+
+：positive linear staining of the respective antibody along the basement membrane
-：negavive staining of the respective antibody along the basement membrane
2.2 皮肤组织基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达 TBMN患儿皮肤基底膜Ⅳ型胶原α1和α5链染色与正常对照相同，均为沿皮肤基底膜的连续线状沉积；而AS男性患儿抗Ⅳ型胶原α5链单抗在皮肤基底膜染色阴性(附表)。
3 讨 论
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多数学者认为，TBMN主要为常染色体显性遗传，但其发病机制仍未澄清。研究者们较早的推测认为，TBMN是由于肾小球基底膜不成熟所致。也有某些作者应用胶体金免疫电镜技术分析TBMN患者肾小球基底膜的成分，结果提示肾小球基底膜变薄主要在上皮侧(外疏松层)。还有些研究者证实，TBMN患者肾小球基底膜可与Goodpasture综合征患者血清(抗肾小球基底膜抗体)结合[5]。但是所有这些均未能揭示TBMN的发病机制。
芬兰和英国学者联手，应用基因连锁分析方法研究了一组荷兰人的TBMN患者，结果TBMN的遗传学图谱被定位于第二号常染色体，COL4A3和COL4A4基因区域，COL4A3和COL4A4基因为编码基底膜Ⅳ型胶原α3和α4链的基因[1]。1996年Lemmink等[2]首次在一荷兰良性家族性血尿家系中检测出Ⅳ型胶原α4链基因的突变。然而，其它的研究包括我们实验室的研究结果，均未显示TBMN患者肾小球及皮肤基底膜Ⅳ型胶原α3、α4和α5链蛋白质的表达异常，因而未能由此提示相应的基因存在明确的突变。
, 百拇医药
另外，TBMN在临床表现、肾脏病理表现方面又确实有与AS相似之处，如临床均表现为血尿，AS疾病早期患者肾脏病理可以仅表现为基底膜弥漫性变薄等，这些事实使我们有理由置疑：TBMN和AS很可能为同一疾病本质、临床表型不一的遗传性基底膜疾病。
有关TBMN的研究中，基因连锁分析曾提示与常染色体2q35-37位点有关，而此处正是编码Ⅳ型胶原α3和α4链的基因COL4A3和COL4A4所在；新近的研究又进一步检测到一良性家族性血尿家系COL4A4基因的突变。由此有学者提出，TBMN和AS可能均因Ⅳ型胶原基因突变所致，在这一点上应视二者相同，或者两个病的疾病本质属同类[6]；但两个病毕竟在临床、病理及预后等方面存在差异，所以我们认为TBMN为AS的变异型也许更客观。
TBMN在血尿的临床表现、肾小球基底膜变薄及有血尿家族史等方面，与AS确有相似之处，临床上大有鉴别TBMN和AS诊断的必要，因为按照目前对这两个疾病的定义和理解，TBMN为良性血尿，疾病极少进展，绝大多数患者肾功能保持正常，疾病为常染色体显性遗传型。但AS为进行性肾脏病，患者常于20～40岁便发展至终末期肾脏病，疾病多为X连锁显性遗传型，其突变基因为COL4A5，并因该突变基因所编码的产物——Ⅳ型胶原α5链表达亦异常：抗α5(Ⅳ)链单抗在GBM和皮肤基底膜上染色阴性。因此，即便有时TBMN与AS临床表型相似，尤其TBMN与AS的早期阶段肾脏病理均可表现为肾小球基底膜变薄，而此时肾穿刺活组织检查也难以确诊；本研究结果表明，TBMN患者肾脏和皮肤基底膜上Ⅳ型胶原α链的表达完全正常，有别于AS患者。因此，检测基底膜Ⅳ型胶原α链可为诊断TBMN、判断预后及遗传咨询提供重要线索。
, 百拇医药
国家自然科学基金(39770780)资助项目
参考文献
1，Schröder CH，Brunner HG，Monnens LAH.Genetic features of Alport syndrome，Contr Nephrol，1990，80：3
2，Lemmink HH，Nillesen WN，Mochizuki T et al.Benign familial hematuria due to mutation of the type Ⅳ collagen α4 gene.J Clin Invest，1996，98(5)：1114
3，柴 青，丁 洁，张 英等.胶原成分在儿童系膜增生性肾小球肾炎中的变化.中华儿科杂志，1998，36(4)：208
, 百拇医药
4，丁 洁，杨霁云，刘景城等.免疫荧光学方法检测皮肤组织Ⅳ型胶原α5链诊断Alport综合征.中华儿科杂志，1997，35(4)：177
5，Pettson E，Törnroth T，Wieslander J.Abnormally thin glomerular basement membrane and the Goodpasture epitope.Clin Nephrol，1990，33(3)：105
6，Saito A，Yamazaki H，Nakagawa Y et al.Molecular genetics of renal diseases.Internal Med，1997，36(2)：81
(1999-11-22收稿，1999-12-21修回), http://www.100md.com
单位：丁洁(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；柴青(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；刘景城(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；张英(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)；杨霁云(北京医科大学第一医院儿科 北京，100034)
关键词：薄基底膜肾病；Ⅳ型胶原；Alport综合征
肾脏病与透折肾移植杂志000205 摘 要 目的：检测薄基底膜肾病(TBMN)患者基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达，探讨其发病机制；并与Alport综合征(AS)比较，为鉴别TBMN和AS提供帮助。 方法：用抗Ⅳ型胶原不同α链的单克隆抗体，采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法检测了6例TBMN、3例X连锁型AS男性患儿及2例正常对照肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链的表达；采用间接免疫荧光法检测了3例TBMN、4例X链锁型AS男性患儿及4例正常对照皮肤基底膜中α1(Ⅳ)和α5(Ⅳ)链的表达。 结果：TBMN患儿肾小球基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3～5链表达同正常，均为沿基底膜连续线状沉积。X连锁型AS男性患儿肾小球基底膜显示Ⅳ型胶原α1链染色阳性，而α3～5链染色均为阴性。TBMN、AS患儿及正常对照皮肤基底膜中α1(Ⅳ)链染色均为沿基底膜连续线状沉积；而α5(Ⅳ)链染色仅在AS为阴性，在TBMN和正常对照均为连续线状沉积。 结论：TBMN患儿基底膜中α(Ⅳ)链表达不同于AS。
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EXPRESSIONS OF TYPE Ⅳ COLLAGEN α CHAINS IN BASEMENT MEMBRANES OF THIN BASEMENT MEMBRANE NEPHRITIS
DING Jie，CHAI Qing，LIU Jingchang，ZHANG Ying，YANG Jiyun
(Department of Pediatrics，First Hospital，Beijing Medical University，Beijing，100034)
OBJECTIVE To detect the basement membrane α(Ⅳ) chains expressions in thin basement membrane nephritis(TBMN)and Alport syndrome，and to find the difference of the expressions between the two diseases. METHODOLOGY The monoclonal antibodies against type Ⅳ collagen α chains were applied in the methods of streptavidin peroxidase conjugated staining(SP)and indirect immunofluorescence.The expressions of α(Ⅳ)chains in glomerular basement membrane(GBM) were detected by SP in 6 TBMN，2 X-linked AS male patients，and 2 normal controls.The expressions of α(Ⅳ)chains in epidermal basement membrane(EBM)were detected by IF in 3 TBMN，4 X-lined AS male patients and 4 normal controls. RESULTS The α1(Ⅳ) and α3-5(Ⅳ)chains expressions were found linear positive along the GBM in TBMN patients，in a same pattern as in the normal controls.In X-linked AS male patients，the expression of α1(Ⅳ)chain was positive while the expressions of α3-5(Ⅳ)chains were negative in GBM.The expressions of α1(Ⅳ)chains were found positive in a linear pattern along EBM in TBMN patients，while the expression of α5(Ⅳ) chain in EBM was found negative in X-linked AS male patients. CONCLUSION The expressions of α(Ⅳ) chains in EBM and GBM can be used in the differential diagnosis between TBMN and AS.
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Key words thin basement membrane nephritis collagen type Ⅳ alport syndrome Ⅳ alport syndrome
薄基底膜肾病(thin basement membrane nephritis，TBMN)指临床表现为良性家族性血尿，病理以肾小球基底膜弥漫性变薄为特征的遗传性肾脏病。多数学者认为TBMN主要为常染色体显性遗传，但其发病机制仍未澄清。国外曾有报道基因连锁分析定位TBMN基因在常染色体2q35-37，此处正是编码Ⅳ型胶原α3和α4链的基因COL4A3和COL4A4所在[1]。1996年芬兰的研究还曾显示，在一良性家族性血尿家系中检测出Ⅳ型胶原α4链基因的突变[2]。因此，我们设计并进行本研究，旨在检测COL4A3和COL4A4基因编码的Ⅳ型胶原α3和α4链在基底膜的表达，以助TBMN发病机制的研究；同时经与Alport综合征(AS)患儿的基底膜Ⅳ型胶原α链表达比较，试图为TBMN和AS的鉴别提供帮助。
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1 对象和方法
1.1 对象 1995年以来我院诊治的TBMN患儿9例，男6例，女3例，年龄5～11岁，平均病程1年，临床主要表现为血尿，肾功能均正常。2/9例有明确血尿家族史。9例患儿的肾活组织电镜检查均显示肾小球基底膜(GBM)弥漫或节段性变薄，符合TBMN诊断；而光镜和免疫荧光镜检查无特异性改变。实验中分别检测了6例患儿的肾脏组织和3例患儿的皮肤组织中Ⅳ型胶原α链的表达。
选取2例X连锁型AS男性患儿的肾组织以及4例X连锁型AS男性患儿的皮肤组织与TBMN进行比较。AS患儿平均年龄10岁，平均病程5年。患儿均表现为持续性镜下血尿，其中2例伴有蛋白尿；5/6例纯音测听显示感音神经性耳聋；5/6例家族史中均显示有男性成员肾功能衰竭。全部AS患儿均经肾活组织电镜检查显示GBM薄厚不均、分层以及断裂，因而确诊为AS。
正常对照取2例肾肿瘤切除时的正常肾组织和4例外科手术所取皮肤组织，分别作为本研究的肾脏和皮肤对照。
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1.2 方法
1.2.1 肾组织标本用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method，SP法)检测基底膜中Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链的表达。肾组织病理标本经福尔马林固定、石蜡切片，以微波炉进行抗原修复以及SP染色，方法同我们以前的报道[3]。
1.2.2 皮肤组织标本用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IF)检测皮肤基底膜中Ⅳ型胶原α1和α5链的表达，实验方法同我们以前的报道[4]。
1.2.3 实验中所用抗Ⅳ型胶原α1、α3、α4和α5链NC1片断的单克隆抗体均由美国明尼苏达大学Alfred Michael教授惠赠。其它主要试剂来源为：生物素标记马抗鼠IgG：Vector Laboratories；SA-HRP(Streptavidin Horseradish Peroxidase)：Vector Laboratories；DAB粉末：北京中山生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗小鼠IgG抗体：美国Jackson Immuno Research Laboratory，Inc.。
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2 结 果
2.1 肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达TBMN患儿肾脏组织基底膜中Ⅳ型胶原各α链的表达同正常对照，均为沿基底膜的连续线状沉积；但X连锁型AS男性患儿除α1(Ⅳ)染色同正常对照为阳性，α5(Ⅳ)、α3(Ⅳ)和α4(Ⅳ)链的染色均为阴性(附表)。
Table. The expressions of α(Ⅳ)chains in EBM and GBM GROUPS
GBM
EBM
n
α1
α3
α4
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α5
n
α1
α5
TBMN
6
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X-linked AS male patients
, 百拇医药
2
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Normal control
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, 百拇医药
4
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+：positive linear staining of the respective antibody along the basement membrane
-：negavive staining of the respective antibody along the basement membrane
2.2 皮肤组织基底膜中Ⅳ型胶原α链的表达 TBMN患儿皮肤基底膜Ⅳ型胶原α1和α5链染色与正常对照相同，均为沿皮肤基底膜的连续线状沉积；而AS男性患儿抗Ⅳ型胶原α5链单抗在皮肤基底膜染色阴性(附表)。
3 讨 论
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多数学者认为，TBMN主要为常染色体显性遗传，但其发病机制仍未澄清。研究者们较早的推测认为，TBMN是由于肾小球基底膜不成熟所致。也有某些作者应用胶体金免疫电镜技术分析TBMN患者肾小球基底膜的成分，结果提示肾小球基底膜变薄主要在上皮侧(外疏松层)。还有些研究者证实，TBMN患者肾小球基底膜可与Goodpasture综合征患者血清(抗肾小球基底膜抗体)结合[5]。但是所有这些均未能揭示TBMN的发病机制。
芬兰和英国学者联手，应用基因连锁分析方法研究了一组荷兰人的TBMN患者，结果TBMN的遗传学图谱被定位于第二号常染色体，COL4A3和COL4A4基因区域，COL4A3和COL4A4基因为编码基底膜Ⅳ型胶原α3和α4链的基因[1]。1996年Lemmink等[2]首次在一荷兰良性家族性血尿家系中检测出Ⅳ型胶原α4链基因的突变。然而，其它的研究包括我们实验室的研究结果，均未显示TBMN患者肾小球及皮肤基底膜Ⅳ型胶原α3、α4和α5链蛋白质的表达异常，因而未能由此提示相应的基因存在明确的突变。
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另外，TBMN在临床表现、肾脏病理表现方面又确实有与AS相似之处，如临床均表现为血尿，AS疾病早期患者肾脏病理可以仅表现为基底膜弥漫性变薄等，这些事实使我们有理由置疑：TBMN和AS很可能为同一疾病本质、临床表型不一的遗传性基底膜疾病。
有关TBMN的研究中，基因连锁分析曾提示与常染色体2q35-37位点有关，而此处正是编码Ⅳ型胶原α3和α4链的基因COL4A3和COL4A4所在；新近的研究又进一步检测到一良性家族性血尿家系COL4A4基因的突变。由此有学者提出，TBMN和AS可能均因Ⅳ型胶原基因突变所致，在这一点上应视二者相同，或者两个病的疾病本质属同类[6]；但两个病毕竟在临床、病理及预后等方面存在差异，所以我们认为TBMN为AS的变异型也许更客观。
TBMN在血尿的临床表现、肾小球基底膜变薄及有血尿家族史等方面，与AS确有相似之处，临床上大有鉴别TBMN和AS诊断的必要，因为按照目前对这两个疾病的定义和理解，TBMN为良性血尿，疾病极少进展，绝大多数患者肾功能保持正常，疾病为常染色体显性遗传型。但AS为进行性肾脏病，患者常于20～40岁便发展至终末期肾脏病，疾病多为X连锁显性遗传型，其突变基因为COL4A5，并因该突变基因所编码的产物——Ⅳ型胶原α5链表达亦异常：抗α5(Ⅳ)链单抗在GBM和皮肤基底膜上染色阴性。因此，即便有时TBMN与AS临床表型相似，尤其TBMN与AS的早期阶段肾脏病理均可表现为肾小球基底膜变薄，而此时肾穿刺活组织检查也难以确诊；本研究结果表明，TBMN患者肾脏和皮肤基底膜上Ⅳ型胶原α链的表达完全正常，有别于AS患者。因此，检测基底膜Ⅳ型胶原α链可为诊断TBMN、判断预后及遗传咨询提供重要线索。
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国家自然科学基金(39770780)资助项目
参考文献
1，Schröder CH，Brunner HG，Monnens LAH.Genetic features of Alport syndrome，Contr Nephrol，1990，80：3
2，Lemmink HH，Nillesen WN，Mochizuki T et al.Benign familial hematuria due to mutation of the type Ⅳ collagen α4 gene.J Clin Invest，1996，98(5)：1114
3，柴 青，丁 洁，张 英等.胶原成分在儿童系膜增生性肾小球肾炎中的变化.中华儿科杂志，1998，36(4)：208
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4，丁 洁，杨霁云，刘景城等.免疫荧光学方法检测皮肤组织Ⅳ型胶原α5链诊断Alport综合征.中华儿科杂志，1997，35(4)：177
5，Pettson E，Törnroth T，Wieslander J.Abnormally thin glomerular basement membrane and the Goodpasture epitope.Clin Nephrol，1990，33(3)：105
6，Saito A，Yamazaki H，Nakagawa Y et al.Molecular genetics of renal diseases.Internal Med，1997，36(2)：81
(1999-11-22收稿，1999-12-21修回), http://www.100md.com