L-arg对高胆固醇血症兔血管反应性的影响
作者：樊燕蓉 陈进贵 薜龙增 刘 虹 卢匙月
单位：南京海军医学高等专科学校(210099) 海军基因工程中心
关键词：一氧化氮；动脉粥样硬化；内皮素
心肺血管病杂志9901224 摘要 本研究观察NO前体物L-arg的抗动脉粥样硬化作用机理。将16只雄性新西兰白兔按体重随机分为3组：正常对照组(D组，n=5)，单纯胆固醇组(C组，n=6)和复合组(L组，n=5)。实验开始前及实验第5周和第10周抽血检测血浆总胆固醇，第10周处死动物，检测血浆和胸主动脉组织中内皮素-1(ET-1)、环-磷酸鸟苷(cGMP)含量，并测试了胸主动脉环对去甲肾上腺素(NE)的反应性。结果发现L-精氨酸对血浆总胆固醇无明显影响，但可使血浆及组织中ET-1含量显著下降，cGMP含量上升，补充NO前体物可改善胸主动脉环对缩血管物质去甲肾上腺素的反应性。由此可见，补充L-arg可纠正高胆固醇引起的ET-1/cGMP失衡，具有一定的抗动脉粥样硬化作用。
, 百拇医药
The Effect and Its Mechanism of L-arginine on the Responses of
thoracic Aorta in Hypercholesterolemic Rabbits
Fan Yanrong,Chen Jingui,Xue Longzeng,et al.
Naval Medical College of PLA,Nanjing,(210099)
Abstract This study was to seek the affect of L-arginine in the prevention of atherosclerosis in rabbit.Sixteen male rabbits were randomly divided into three groups:normal control group(D,n=5,fed with normal rabbit forage),cholesterol control group(C,n=6,received forage enriched with 1% cholesterol) and complex group(L,n=5, 1% cholesterol diet supplemented with 2.25%L-arginine).Before the initiation of and the fifth week and the tenth week,blood samples were collected from all of the rabbits for measurement of plasma total cholesterol(TC).At the end of the experiment,the rabbits were sacrificed and blood samples were collected in order to measure the level of plasma endothlin-1(ET-1)and cGMP,and aortas were harvested from all of the rabbits for measurement of the responses to norepinephine and the level of ET-1 and cGMP in aorta tissues.Compared with the C group,there was no significant alteration in plasma TC in complex group,but the level of ET-1 in plasma and tissues were lowered obviously(P<0.05),the level of cGMP increased significantly in the aorta and plasma(P<0.05),and the responses to NE attenuated.All those suggested that L-arginine could regulated imbalance between ET-1 and cGMP in plasma and aorta tissues,and it inhibit atherosclerosis.
, 百拇医药
Key words: NO; Atherosclerosis; Endothelin-1
EDRF/NO和ET-1分别是血管松弛因子和血管收缩因子的主要作用成分，在血管张力调节中处于重要地位。1988年，Furchgott证明一氧化氮就是EDRF，它可激活平滑肌细胞胞浆内可溶性鸟苷酸环化酶活性，增高cGMP水平而发挥舒血管作用[1]。大量研究观察到，高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化起始于血管内皮细胞的损伤及血管舒缩功能的失常，这可能与血管内皮细胞合成和释放血管舒张因子(EDRF/NO)障碍有关[2]。为此，我们观察了长期体外补充NO前体物L-精氨酸(L-arg)后，高胆固醇血症兔血浆和动脉组织中ET-1、cGMP含量变化，及胸主动脉环对去甲肾上腺素的反应性，以探讨NO抗动脉粥样硬化的机理。
材料和方法
1.动物分组 中科院皮肤病研究所提供健康成年雄性新西兰白兔(体重2kg左右)16只，分3组。①正常对照组5只(D)，喂普通饲料。②单纯胆固醇组6只(C)，饲料中含1%胆固醇(购自上海生化试剂厂)。③复合组5只(L)，饲料中含1%胆固醇和2.25%L-arg(购自上海伯奥生物科技有限公司)。动物分笼饲养，进食量每只控制在每日100g左右，3组均喂满10周。
, 百拇医药
2.取材 饲养10周后，击昏兔，迅速开胸摘取胸主动脉。仔细剔除其周围脂肪和结缔组织，先剪下2～3mm长的血管环，置于kreb's液中平衡，用于肌张力测定，另外分别称取50、100mg组织用于cGMP、ET-1测定。再取部分组织做常规切片，HE染色后镜下观察。
3.指标测定 ⑴血浆胆固醇测定： 采用邻苯二甲醛直接显色法。⑵胸主动脉血管环肌张力测定：胸主动脉血管环用自制金属钩置于器官浴槽中，槽内盛有kreb's液，通以95%O2、5%CO2饱和，浴槽内保持恒温37℃，通过张力传感器与生理信号处理仪连接记录血管张力。调节静息张力2g，平衡60min，以累积给药方式给予不同浓度的去甲肾上腺素，记录动脉环最大张力(以mg表示)。⑶血浆和组织cGMP的测定：动脉条称重后投于1ml 0.05mol/L的醋酸缓冲液(PH4.75，含EDTA 4mmol/L),经玻璃匀浆器匀浆、无水乙醇提取，离心(3500rpm,15min),取上清液置于一洁净的试管中，并于60℃水浴中吹干。血浆和处理后的组织标本严格按cGMP放免测定盒(上海中医学院出品)测定。⑷血浆和组织ET-1的测定：称重后动脉条尽快放入1NHAC 1ml略做碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，匀浆后，4℃、3000rpm离心15min，取上清用于测定。血浆和处理后的组织标本严格按ET放免测定盒(北京解放军总医院出品)操作。
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4.数据处理和结果 数据均用均值±标准差(
±sx)表示，方差分析用组间q检验。
结果
1.不同时期各组血浆胆固醇测定结果(表1)。喂食高胆固醇饮食后，复合组和单纯胆固醇组血浆胆固醇含量比正常组均大大增加，比较2组血浆胆固醇含量无显著差异。
提示：补充L-arg不影响血浆胆固醇含量。
表1 不同时期3组血浆胆固醇含量(mmol/L) 组别
n
0周
5周
, 百拇医药
10周
D
5
1.196±0.267
1.276±0.267
1.270±0.219
C
6
1.085±0.360
17.394±5.111**
18.686±4.180**
L
, 百拇医药
5
1.230±0.542
15.716±5.237**
17.696±4.915**
注：**与正常对照组比较P<0.01
2. 10周时3组主动脉血管环对NE的反应 由表2可见，单纯胆固醇组无论在2.5×10-8M、10-7M NE时，血管收缩程度均比复合组更大，即反应性大(P<0.01)。此外，在实验中发现在较低的NE浓度(10-11M、10-9M)时，单纯胆固醇组血管环就产生收缩，而在正常对照组、复合组大部分无反应。说明，单纯胆固醇组动脉环对NE缩血管物质更加敏感，而补充L-arg后可降低此敏感性。
, 百拇医药
表2 NE(2.5×10-8M、10-7M)引起血管环张力(mg)的变化 组别
n
2.5×10-8M
10-7M
D
5
408.5±55.66
75.4±137.4
C
6
1257.7±263.6**
, 百拇医药
1512.5±205.8**
L
5
395.6±102.0##
698.4±186.9##
注：**与正常对照组比较P<0.01，##与单纯胆固醇组比较P<0.01
3.血浆cGMP、ET-1、ET-1/cGMP测定结果(表3)。可见，在饲料中补加L-arg后，与单纯胆固醇组比较，cGMP含量显著上升(P<0.05)、ET值减小(P<0.05)、ET/cGMP值趋于正常对照组，与正常组无差异。
表3 血浆cGMP(pmol/ml)、ET-1(pg/ml)、ET-1/cGMP(pmol/pg)的变化 组别
, 百拇医药
n
cGMP
ET
ET/cGMP
D
5
43.08±5.54
96.9±14.74
2.28±0.45
C
6
35.78±3.57*
, 百拇医药 150.02±16.33*
4.21±0.44**
L
5
46.18±5.14#
100.18±11.77#
2.20±0.41##
注：*与正常对照组比较P<0.05,**与正常对照组比较P<0.01；
#与单纯胆固醇组比较P<0.05
4.血管条cGMP、ET-1、ET-1/cGMP测定结果(表4)。可见，复合组与单纯胆固醇组相比在饲料中补加L-arg后，组织中cGMP含量显著上升(P<0.05),ET-1值减小(P<0.05),ET-1/cGMP值与正常对照组无差异，而与单纯胆固醇组有显著差异，组织中的结果与血浆中的结果相似。
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表4 组织cGMP(pmol/g)、ET-1(ng/g)、ET-1/cGMP(pmol/ng)的变化 组别
n
cGM
ET
ET/cGMP
D
5
33.36±7.98
39.56±4.76
1.22±0.16
C
6
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12.96±7.76*
66.22±21.92*
6.15±3.01**
L
5
35.96±14.76#
44.14±11.18#
1.30±0.29**
注：*与正常对照组比较P<0.05,**与正常对照组比较P<0.01,#与单纯胆固醇组比较P<0.05
, 百拇医药
讨论
大量实验报道，高胆固醇血症和动脉粥样硬化患者，冠脉对5-HT、NE等缩血管物质反应性增强，对乙酰胆碱的扩张反应明显减弱。但是，血管平滑肌对NO的扩张作用尚属正常，预先应用L-arg能改善患者减弱的舒张反应[3]。由此推测，可能其内皮合成和释放NO障碍。本实验中也观察到补充L-arg后高胆固醇血症兔胸主动脉环对NE的反应性明显小于单纯胆固醇组。进一步生化检测发现补充L-arg后血浆和组织中NO的效应产物cGMP含量比单纯胆固醇组高，而ET-1显著减少，光镜检查其动脉组织，发现其血管内皮细胞完整，内皮增生不明显。
大量研究表明，ET-1和NO不仅在调节血管张力上有拮抗效应，而且其它方面作用相反。NO可抑制血小板的粘附和聚集[4]。有报道，NO可抗血管内皮细胞损伤，cGMP与NO供体硝普钠(SNP)均可以阻止血管平滑肌的增生[5]。本实验中，L-arg虽不影响血浆胆固醇浓度，但可减轻内皮细胞的损伤，改善血管对NE的反应性，纠正动脉粥样硬化时的ET-1/cGMP失衡状态。而这可能是由于补充L-arg引起的体内ET-1和NO的反馈调节所致[6，7]。因此，推测在一些实验中补充L-arg表现出的动脉粥样硬化病变减轻，病变面积减少等抗动脉粥样硬化作用与其降低血浆和组织中ET-1含量，纠正ET-1/cGMP失衡、改善血管对缩血管物质的反应性有关。
, 百拇医药
参考文献
[1] Furchgott RF.Studies on relaxation of rabbit aorta sodium nitria:the basis for the proposal that the acidactivable factor from bovine retracter penis is in organic nirite and the endothelium-derived relaxing factor is nitrite oxide.In:Vanhotte PM,ed. Mechanisms of vasodilation.New York:Raven Press,1988,401.
[2] Tsao PS,McEvory LM,Drexler H,et al.Enhanced endothelial adhesiveness in hypercholesterolemic is attenuated by L-arginite. Circulation,1994,89:2176.
, 百拇医药
[3] Egashira K,Inou T,Hirooks Y,et al. Impaired coronary blood flow response to acetylcholine in patients with coronary risk factors and proximal atherosclerotic lesions.J Clin Invest, 1993,911:29.
[4] J.C.de Greaf,J.D.Banga,S.Moncada,et al.Nitric oxide formation as an inhibitor of platelet adhesion under flow conditions.Circulation 1992,85:2284.
[5] Xian Jie Yu,Yuan Jian LI,Yan Xiong.Increase of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in serum of high cholesterol fed rabbits.Life Sciences,1994,54:753
, 百拇医药
[6] Saijonmaa O,Ristimaki A,Fyhrquist F:Atrial natriuretic peptide;nitroglycerine,amd nitroprusside reduce basal and stimulated endothelin production from cultured endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1990,173:514～520.
[7] Yokokawa K,Kohno M,Yasunarik,et al.Endethelin-3 regulates endothelin-1 production in cultured human endothelial cells.Hypertension.1991,18:304～315.
(1998-06-24收稿)
(1998-08-04修回), http://www.100md.com
单位：南京海军医学高等专科学校(210099) 海军基因工程中心
关键词：一氧化氮；动脉粥样硬化；内皮素
心肺血管病杂志9901224 摘要 本研究观察NO前体物L-arg的抗动脉粥样硬化作用机理。将16只雄性新西兰白兔按体重随机分为3组：正常对照组(D组，n=5)，单纯胆固醇组(C组，n=6)和复合组(L组，n=5)。实验开始前及实验第5周和第10周抽血检测血浆总胆固醇，第10周处死动物，检测血浆和胸主动脉组织中内皮素-1(ET-1)、环-磷酸鸟苷(cGMP)含量，并测试了胸主动脉环对去甲肾上腺素(NE)的反应性。结果发现L-精氨酸对血浆总胆固醇无明显影响，但可使血浆及组织中ET-1含量显著下降，cGMP含量上升，补充NO前体物可改善胸主动脉环对缩血管物质去甲肾上腺素的反应性。由此可见，补充L-arg可纠正高胆固醇引起的ET-1/cGMP失衡，具有一定的抗动脉粥样硬化作用。
, 百拇医药
The Effect and Its Mechanism of L-arginine on the Responses of
thoracic Aorta in Hypercholesterolemic Rabbits
Fan Yanrong,Chen Jingui,Xue Longzeng,et al.
Naval Medical College of PLA,Nanjing,(210099)
Abstract This study was to seek the affect of L-arginine in the prevention of atherosclerosis in rabbit.Sixteen male rabbits were randomly divided into three groups:normal control group(D,n=5,fed with normal rabbit forage),cholesterol control group(C,n=6,received forage enriched with 1% cholesterol) and complex group(L,n=5, 1% cholesterol diet supplemented with 2.25%L-arginine).Before the initiation of and the fifth week and the tenth week,blood samples were collected from all of the rabbits for measurement of plasma total cholesterol(TC).At the end of the experiment,the rabbits were sacrificed and blood samples were collected in order to measure the level of plasma endothlin-1(ET-1)and cGMP,and aortas were harvested from all of the rabbits for measurement of the responses to norepinephine and the level of ET-1 and cGMP in aorta tissues.Compared with the C group,there was no significant alteration in plasma TC in complex group,but the level of ET-1 in plasma and tissues were lowered obviously(P<0.05),the level of cGMP increased significantly in the aorta and plasma(P<0.05),and the responses to NE attenuated.All those suggested that L-arginine could regulated imbalance between ET-1 and cGMP in plasma and aorta tissues,and it inhibit atherosclerosis.
, 百拇医药
Key words: NO; Atherosclerosis; Endothelin-1
EDRF/NO和ET-1分别是血管松弛因子和血管收缩因子的主要作用成分，在血管张力调节中处于重要地位。1988年，Furchgott证明一氧化氮就是EDRF，它可激活平滑肌细胞胞浆内可溶性鸟苷酸环化酶活性，增高cGMP水平而发挥舒血管作用[1]。大量研究观察到，高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化起始于血管内皮细胞的损伤及血管舒缩功能的失常，这可能与血管内皮细胞合成和释放血管舒张因子(EDRF/NO)障碍有关[2]。为此，我们观察了长期体外补充NO前体物L-精氨酸(L-arg)后，高胆固醇血症兔血浆和动脉组织中ET-1、cGMP含量变化，及胸主动脉环对去甲肾上腺素的反应性，以探讨NO抗动脉粥样硬化的机理。
材料和方法
1.动物分组 中科院皮肤病研究所提供健康成年雄性新西兰白兔(体重2kg左右)16只，分3组。①正常对照组5只(D)，喂普通饲料。②单纯胆固醇组6只(C)，饲料中含1%胆固醇(购自上海生化试剂厂)。③复合组5只(L)，饲料中含1%胆固醇和2.25%L-arg(购自上海伯奥生物科技有限公司)。动物分笼饲养，进食量每只控制在每日100g左右，3组均喂满10周。
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2.取材 饲养10周后，击昏兔，迅速开胸摘取胸主动脉。仔细剔除其周围脂肪和结缔组织，先剪下2～3mm长的血管环，置于kreb's液中平衡，用于肌张力测定，另外分别称取50、100mg组织用于cGMP、ET-1测定。再取部分组织做常规切片，HE染色后镜下观察。
3.指标测定 ⑴血浆胆固醇测定： 采用邻苯二甲醛直接显色法。⑵胸主动脉血管环肌张力测定：胸主动脉血管环用自制金属钩置于器官浴槽中，槽内盛有kreb's液，通以95%O2、5%CO2饱和，浴槽内保持恒温37℃，通过张力传感器与生理信号处理仪连接记录血管张力。调节静息张力2g，平衡60min，以累积给药方式给予不同浓度的去甲肾上腺素，记录动脉环最大张力(以mg表示)。⑶血浆和组织cGMP的测定：动脉条称重后投于1ml 0.05mol/L的醋酸缓冲液(PH4.75，含EDTA 4mmol/L),经玻璃匀浆器匀浆、无水乙醇提取，离心(3500rpm,15min),取上清液置于一洁净的试管中，并于60℃水浴中吹干。血浆和处理后的组织标本严格按cGMP放免测定盒(上海中医学院出品)测定。⑷血浆和组织ET-1的测定：称重后动脉条尽快放入1NHAC 1ml略做碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，匀浆后，4℃、3000rpm离心15min，取上清用于测定。血浆和处理后的组织标本严格按ET放免测定盒(北京解放军总医院出品)操作。
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4.数据处理和结果 数据均用均值±标准差(
±sx)表示，方差分析用组间q检验。结果
1.不同时期各组血浆胆固醇测定结果(表1)。喂食高胆固醇饮食后，复合组和单纯胆固醇组血浆胆固醇含量比正常组均大大增加，比较2组血浆胆固醇含量无显著差异。
提示：补充L-arg不影响血浆胆固醇含量。
表1 不同时期3组血浆胆固醇含量(mmol/L) 组别
n
0周
5周
, 百拇医药
10周
D
5
1.196±0.267
1.276±0.267
1.270±0.219
C
6
1.085±0.360
17.394±5.111**
18.686±4.180**
L
, 百拇医药
5
1.230±0.542
15.716±5.237**
17.696±4.915**
注：**与正常对照组比较P<0.01
2. 10周时3组主动脉血管环对NE的反应 由表2可见，单纯胆固醇组无论在2.5×10-8M、10-7M NE时，血管收缩程度均比复合组更大，即反应性大(P<0.01)。此外，在实验中发现在较低的NE浓度(10-11M、10-9M)时，单纯胆固醇组血管环就产生收缩，而在正常对照组、复合组大部分无反应。说明，单纯胆固醇组动脉环对NE缩血管物质更加敏感，而补充L-arg后可降低此敏感性。
, 百拇医药
表2 NE(2.5×10-8M、10-7M)引起血管环张力(mg)的变化 组别
n
2.5×10-8M
10-7M
D
5
408.5±55.66
75.4±137.4
C
6
1257.7±263.6**
, 百拇医药
1512.5±205.8**
L
5
395.6±102.0##
698.4±186.9##
注：**与正常对照组比较P<0.01，##与单纯胆固醇组比较P<0.01
3.血浆cGMP、ET-1、ET-1/cGMP测定结果(表3)。可见，在饲料中补加L-arg后，与单纯胆固醇组比较，cGMP含量显著上升(P<0.05)、ET值减小(P<0.05)、ET/cGMP值趋于正常对照组，与正常组无差异。
表3 血浆cGMP(pmol/ml)、ET-1(pg/ml)、ET-1/cGMP(pmol/pg)的变化 组别
, 百拇医药
n
cGMP
ET
ET/cGMP
D
5
43.08±5.54
96.9±14.74
2.28±0.45
C
6
35.78±3.57*
, 百拇医药 150.02±16.33*
4.21±0.44**
L
5
46.18±5.14#
100.18±11.77#
2.20±0.41##
注：*与正常对照组比较P<0.05,**与正常对照组比较P<0.01；
#与单纯胆固醇组比较P<0.05
4.血管条cGMP、ET-1、ET-1/cGMP测定结果(表4)。可见，复合组与单纯胆固醇组相比在饲料中补加L-arg后，组织中cGMP含量显著上升(P<0.05),ET-1值减小(P<0.05),ET-1/cGMP值与正常对照组无差异，而与单纯胆固醇组有显著差异，组织中的结果与血浆中的结果相似。
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表4 组织cGMP(pmol/g)、ET-1(ng/g)、ET-1/cGMP(pmol/ng)的变化 组别
n
cGM
ET
ET/cGMP
D
5
33.36±7.98
39.56±4.76
1.22±0.16
C
6
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12.96±7.76*
66.22±21.92*
6.15±3.01**
L
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35.96±14.76#
44.14±11.18#
1.30±0.29**
注：*与正常对照组比较P<0.05,**与正常对照组比较P<0.01,#与单纯胆固醇组比较P<0.05
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讨论
大量实验报道，高胆固醇血症和动脉粥样硬化患者，冠脉对5-HT、NE等缩血管物质反应性增强，对乙酰胆碱的扩张反应明显减弱。但是，血管平滑肌对NO的扩张作用尚属正常，预先应用L-arg能改善患者减弱的舒张反应[3]。由此推测，可能其内皮合成和释放NO障碍。本实验中也观察到补充L-arg后高胆固醇血症兔胸主动脉环对NE的反应性明显小于单纯胆固醇组。进一步生化检测发现补充L-arg后血浆和组织中NO的效应产物cGMP含量比单纯胆固醇组高，而ET-1显著减少，光镜检查其动脉组织，发现其血管内皮细胞完整，内皮增生不明显。
大量研究表明，ET-1和NO不仅在调节血管张力上有拮抗效应，而且其它方面作用相反。NO可抑制血小板的粘附和聚集[4]。有报道，NO可抗血管内皮细胞损伤，cGMP与NO供体硝普钠(SNP)均可以阻止血管平滑肌的增生[5]。本实验中，L-arg虽不影响血浆胆固醇浓度，但可减轻内皮细胞的损伤，改善血管对NE的反应性，纠正动脉粥样硬化时的ET-1/cGMP失衡状态。而这可能是由于补充L-arg引起的体内ET-1和NO的反馈调节所致[6，7]。因此，推测在一些实验中补充L-arg表现出的动脉粥样硬化病变减轻，病变面积减少等抗动脉粥样硬化作用与其降低血浆和组织中ET-1含量，纠正ET-1/cGMP失衡、改善血管对缩血管物质的反应性有关。
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参考文献
[1] Furchgott RF.Studies on relaxation of rabbit aorta sodium nitria:the basis for the proposal that the acidactivable factor from bovine retracter penis is in organic nirite and the endothelium-derived relaxing factor is nitrite oxide.In:Vanhotte PM,ed. Mechanisms of vasodilation.New York:Raven Press,1988,401.
[2] Tsao PS,McEvory LM,Drexler H,et al.Enhanced endothelial adhesiveness in hypercholesterolemic is attenuated by L-arginite. Circulation,1994,89:2176.
, 百拇医药
[3] Egashira K,Inou T,Hirooks Y,et al. Impaired coronary blood flow response to acetylcholine in patients with coronary risk factors and proximal atherosclerotic lesions.J Clin Invest, 1993,911:29.
[4] J.C.de Greaf,J.D.Banga,S.Moncada,et al.Nitric oxide formation as an inhibitor of platelet adhesion under flow conditions.Circulation 1992,85:2284.
[5] Xian Jie Yu,Yuan Jian LI,Yan Xiong.Increase of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in serum of high cholesterol fed rabbits.Life Sciences,1994,54:753
, 百拇医药
[6] Saijonmaa O,Ristimaki A,Fyhrquist F:Atrial natriuretic peptide;nitroglycerine,amd nitroprusside reduce basal and stimulated endothelin production from cultured endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1990,173:514～520.
[7] Yokokawa K,Kohno M,Yasunarik,et al.Endethelin-3 regulates endothelin-1 production in cultured human endothelial cells.Hypertension.1991,18:304～315.
(1998-06-24收稿)
(1998-08-04修回), http://www.100md.com