巢式聚合酶链反应检测血液中恙虫病立克次体56kDa抗原基因
作者：陈永平 于强 陈香蕊 吴伟文 李庆兴 吴新
单位：温州医学院附属第一医院感染内科(325000)
关键词：恙虫病立克次体；巢式聚合酶链反应；抗原基因
温州医学院学报/990203 摘 要 目的 通过恙虫病立克次体56kDa抗原基因片段检测，探讨早期病原诊断的方法。方法 采用巢式聚合酶链反应(NPCR)对11例确诊及10例疑诊恙虫病患者血液标本进行检测，并以血清IgG抗体间接免疫荧光试验(IF)对比分析。结果 11份IF检测阳性的标本，NPCR均阳性；10份IF阴性的标本，7例NPCR检测阳性，总阳性率为85.7%。而作为阴性对照的10份血标本则无阳性。结论 本法用于临床血液标本中恙虫病立克次体DNA的快速检测，具有敏感性高、特异性强的优点。
Detection of 56kDa antigen gene of rickettsia tsutsugamushi in blood samples of the patients with scrub typhus by nested polymerase chain reaction
, 百拇医药
Chen Yongping,Yu Qiang,Chen Xiangrui,et al.
Department of Infectious Disease,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou,325000
Abstract Objective To explore the means of an earlier etiologic diagnosis of scrub typhus through detection of 56kDa antigen gene fraction of Rickettsia tsutsugamushi(Rt).Methods The nested polymerase chain reaction(NPCR) technique was used to detect the blood samples of patients with scrub typhus and compared with serologic(IF test) detection of Rt.Results The amplification protocol gave positive results in 11 of 11 cases which were positive by IF test as well as in 7 of 10 cases which were negative by IF test (overall sensitivity 85.7%).The control samples obtained from 10 cases with typhoid fever,bacillary dysentery or systemic lupus erythematosus,not a single one was positive.Conclusion The detection of Rt 56kDa antigen gene in clinical samples seems to be more specific and sensitive.It is benificial for earlier diagnosis of scrub typhus.
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Key words Rickettsia tsutsugamushi Nested polymerase chain reaction Antigen gene
恙虫病的实验诊断依赖于血清学检测及病原体分离。然而血清学检查阳性需1～2周以后出现，难以早期诊断。病原体分离则耗时更长，阳性率较低，且一般实验室难以进行[1]。因此，多年来人们致力于寻找一种快速、敏感而又特异的检测方法。我院采用巢式聚合酶链反应(NPCR)技术测定恙虫病患者血液中56kDa主要抗原基因片段，并与血清间接免疫荧光染色(IF)法进行对比，结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 血液标本 取自1998年4月～11月温州医学院附属第一医院及丽水地区医院疑诊为恙虫病的住院患者，共21例。采全血21份离心分离血清和血凝块，-20℃保存待测。
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1.1.2 对照组标本 阳性对照为恙虫病立克次体Karp株感染鸡胚卵黄囊膜，由军事医学科学院微生物流行病研究所赠送。阴性对照取自同期住入温州医学院附属一院的非恙虫病患者10例，共10份血液标本，其中伤寒7例，菌痢2例，SLE 1例。
1.1.3 恙虫病患者的临床情况 可区分为3组：A组 患者共11例，留取血液标本11份。确诊依据：①有草地频繁接触史；②临床症状典型；③IF检测阳性。B组 共7例，留取7份血液标本。临床诊断情况：有草地接触史及野外作业史，临床症状典型，但IF检测阴性。C组 3例，留取血液标本3份。属临床疑诊病例，有淋巴结肿大、皮疹及相应流行病学史，无血清学证据。
1.1.4 引物 从恙虫病立克次体56kDa抗原基因序列中选取四段，用做巢式PCR。引物由军事医学科学院微生物流行病研究所合成，引物核苷酸序列为：
1.5，-AAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTG-3
, 百拇医药
2.5，-CTAGAAGTTATAGCGTACACCTGCACTTGC-3
3.5，-GATCAAGCTTCCTCAGCCTACTATAATGCC-3
4.5，-CTAGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC-3
其扩增后产物为509bp。
1.1.5 PCR试剂 Taq DNA聚合酶，购自宝泰生物公司。4×d NTP，购自华美生物工程公司。
1.1.6 Marker pBR 322 DNA/Bst NI Markers：购自同正生物公司。Lambda DNA/Eco RI+Hind Ⅲ Markers：购自华美生物工程公司。
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1.1.7 其它试剂 ①HaeⅢ酶：购自宝泰生物公司；②2X裂解液：1mg/ml蛋白酶K，4%SDS，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA，本室配制；③饱和酚：华美公司产品；④氯仿、石蜡油和无水乙醇：常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 模板的制备 取21份血块及阴、阳性对照样品分别加1/3体积蒸馏水，用玻璃研磨器将样品磨碎，0.5ml悬液加0.5ml的2X裂解液，50℃作用4h。混悬液在4℃下10 000r/min离心20min，上清液用饱和酚抽取一次，酚和氯仿混合液(v/v为50/50)抽提一次，用乙醇沉淀提取液，70%乙醇洗涤一次，沉淀溶于50μl TE buf中留作模板。
1.2.2 NPCR ①第一次PCR：加蒸馏水38μl，缓冲液5μl，2.5mmol/L 4X dNTP 2μl，50μmol/L引物1、2各1μl，Taq DNA聚合酶1u，上述制备的模板2μl。加完上述样品后，上加石蜡油50μl。于95℃预变性180s，94℃变性45s，66℃退火60s，72℃延伸120s，循环35次，最后，延伸5min，取PCR产物1μl进行第二次PCR。②第2次PCR：用引物3、4再次扩增上次PCR产物。方法基本同第一次PCR，只是模板用1μl的前一次PCR产物，蒸馏水加39μl。PCR产物在1%琼脂糖70V电泳1h，以509bp处出现条带者为阳性，每次实验同时做阳性对照和阴性对照。③重复实验：重复上述模板制备、第一次及第二次PCR实验、电泳，结果同前次实验完全相同。
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1.2.3 酶切分析 取PCR产物5μl，加HaeⅢ内切酶2μl，HaeⅢ内切酶缓冲液5μl，蒸馏水38μl。混匀后，37℃温浴2h。酶切产物与未酶切产物在1%琼脂糖中70V电泳1h。观察PCR产物被HaeⅢ内切酶消化，产生305bp和204bp扩增带。
2 结果
临床标本中如有恙虫病立克次体56kDa抗原基因片段存在，其扩增产物在琼脂糖凝胶上509bp处出现条带为本PCR特异产物。我们对21例恙虫病患者血液标本进行NPCR检测，结果阳性者18例，总阳性率为85.7%，根据其DNA片段的大小，证明为特异性扩增带。阳性对照标本可见明显特异性扩增带，阴性对照标本10份均无扩增带。A组(确诊组)11份标本PCR均为阳性，其血清学IF检测也呈阳性。IF呈阴性反应的10例有7例NPCR阳性，其中B组(临床诊断组)PCR阳性率为85.7%(6/7)，C组(疑诊病人)阳性率为33.3%(1/3)。限制性内切酶酶切分析，PCR产物被HaeⅢ消化，并产生305bp和204bp的条带，证明PCR产物为特异性扩增带。
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3 讨论
自从1990年Stover等[2]克隆了编码恙虫病立克次体热敏蛋白的Sta58主要抗原基因以来，PCR技术对恙虫病立克次体DNA序列的检测方法已开始建立并应用于病原诊断[3～6]。我院选择了最能反映恙虫病立克次体(Rt)本质差异的56kDa抗原基因片段的部分序列作为Rt检测的靶序列，采用NPCR技术进行扩增，经DNA碱基对照及HaeⅢ酶切分析，证实特异性扩增条带。
我们利用NPCR技术对疑诊恙虫病的21例患者血液标本进行检测，其中11份经IF检测阳性的标本，其PCR检测均为阳性；10份IF检测阴性的标本有7例PCR阳性，总阳性率达85.7%。作为对照的10例非恙虫病患者的血液标本，PCR检测均为阴性。对于IF阴性的10例恙虫病患者，因其病程较短(发病后10天内采血)，虽然血清学检测不能早期诊断，但B组NPCR6/7阳性，C组1/3阳性。说明NPCR检测Rt的敏感性高，具有早期诊断价值。
, 百拇医药
临床采集的血标本进行PCR检测时，其敏感性较细胞纯培养标本的DNA扩增稍差，可能与血液标本中存有大量的DNA多聚酶抑制物有关。通常增加酚、氯仿的抽提次数可减少这些抑制物，但抽提过多使标本中恙虫病DNA丢失过多，影响其敏感性，笔者认为以1～2次为宜。为进一步提高敏感性，我们采用重复扩增(NPCR)，获得了满意的效果。
本组-20℃保存的血液标本半数在3个月以上，最长达6个月，仍能检测到Rt，说明PCR技术对恙虫病患者的标本送检时间及保存条件并不严格，这样将有利于此项技术的开展。NPCR对血液标本的检测较Rt分离培养的时间明显缩短，且特异性高，为恙虫病立克次体的病原诊断提供了快速、便捷、可靠的检测手段。
*温州市科技发展计划基金资助项目
4 参考文献
[1] 张惠君，陈燕，黄松如等.应用抗恙虫立克次体的单抗检测恙虫立克次体抗原.中华流行病学杂志，1993，14(1)∶49
, 百拇医药
[2] Stover CK,Marana DP,Dasch GA,et al.Molecular cloning and sequence analysis of the Sta58 major antigen gene of Rickettsia tsutsugamushi:sequence homology and antigenic comparison of Sta58 to the 60- kilodalton family of stress proteins.Infect Immun,1990,58(5)∶1360
[3] Furuya Y,Yoshida Y,Katayama T,et al.Specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA from clinical specimens by polymerase chain reaction. Clin Microbiol,1991,29(11)∶2628
, 百拇医药
[4] Sugita Y,Nagatani T,Okuda K,et al.Diagnosis of typhus infection with Rickettsia tsutsugamushi by polymerase chain reaction.J Mol Microbiol,1992,37∶357
[5] Hokee SUN,Hakchol IN,Sikchol MYUXG,et al.Detection of Rickettsia tsutsugamushi in experimentally infected mice by PCR.J Clin Microbiol,1994,32(6)∶1435
[6] Ohash N,Tamura A，Ohta M，et al.Diversity of immunodominat 56kDa type specific antigen(TSA) of Rickettsia Tsutsugamushi.J Biolo Chem，1992，267(18)：12728
(收稿：1999-01-13，修回：1999-03-1), 百拇医药
单位：温州医学院附属第一医院感染内科(325000)
关键词：恙虫病立克次体；巢式聚合酶链反应；抗原基因
温州医学院学报/990203 摘 要 目的 通过恙虫病立克次体56kDa抗原基因片段检测，探讨早期病原诊断的方法。方法 采用巢式聚合酶链反应(NPCR)对11例确诊及10例疑诊恙虫病患者血液标本进行检测，并以血清IgG抗体间接免疫荧光试验(IF)对比分析。结果 11份IF检测阳性的标本，NPCR均阳性；10份IF阴性的标本，7例NPCR检测阳性，总阳性率为85.7%。而作为阴性对照的10份血标本则无阳性。结论 本法用于临床血液标本中恙虫病立克次体DNA的快速检测，具有敏感性高、特异性强的优点。
Detection of 56kDa antigen gene of rickettsia tsutsugamushi in blood samples of the patients with scrub typhus by nested polymerase chain reaction
, 百拇医药
Chen Yongping,Yu Qiang,Chen Xiangrui,et al.
Department of Infectious Disease,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou,325000
Abstract Objective To explore the means of an earlier etiologic diagnosis of scrub typhus through detection of 56kDa antigen gene fraction of Rickettsia tsutsugamushi(Rt).Methods The nested polymerase chain reaction(NPCR) technique was used to detect the blood samples of patients with scrub typhus and compared with serologic(IF test) detection of Rt.Results The amplification protocol gave positive results in 11 of 11 cases which were positive by IF test as well as in 7 of 10 cases which were negative by IF test (overall sensitivity 85.7%).The control samples obtained from 10 cases with typhoid fever,bacillary dysentery or systemic lupus erythematosus,not a single one was positive.Conclusion The detection of Rt 56kDa antigen gene in clinical samples seems to be more specific and sensitive.It is benificial for earlier diagnosis of scrub typhus.
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Key words Rickettsia tsutsugamushi Nested polymerase chain reaction Antigen gene
恙虫病的实验诊断依赖于血清学检测及病原体分离。然而血清学检查阳性需1～2周以后出现，难以早期诊断。病原体分离则耗时更长，阳性率较低，且一般实验室难以进行[1]。因此，多年来人们致力于寻找一种快速、敏感而又特异的检测方法。我院采用巢式聚合酶链反应(NPCR)技术测定恙虫病患者血液中56kDa主要抗原基因片段，并与血清间接免疫荧光染色(IF)法进行对比，结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 血液标本 取自1998年4月～11月温州医学院附属第一医院及丽水地区医院疑诊为恙虫病的住院患者，共21例。采全血21份离心分离血清和血凝块，-20℃保存待测。
, http://www.100md.com
1.1.2 对照组标本 阳性对照为恙虫病立克次体Karp株感染鸡胚卵黄囊膜，由军事医学科学院微生物流行病研究所赠送。阴性对照取自同期住入温州医学院附属一院的非恙虫病患者10例，共10份血液标本，其中伤寒7例，菌痢2例，SLE 1例。
1.1.3 恙虫病患者的临床情况 可区分为3组：A组 患者共11例，留取血液标本11份。确诊依据：①有草地频繁接触史；②临床症状典型；③IF检测阳性。B组 共7例，留取7份血液标本。临床诊断情况：有草地接触史及野外作业史，临床症状典型，但IF检测阴性。C组 3例，留取血液标本3份。属临床疑诊病例，有淋巴结肿大、皮疹及相应流行病学史，无血清学证据。
1.1.4 引物 从恙虫病立克次体56kDa抗原基因序列中选取四段，用做巢式PCR。引物由军事医学科学院微生物流行病研究所合成，引物核苷酸序列为：
1.5，-AAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTG-3
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2.5，-CTAGAAGTTATAGCGTACACCTGCACTTGC-3
3.5，-GATCAAGCTTCCTCAGCCTACTATAATGCC-3
4.5，-CTAGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC-3
其扩增后产物为509bp。
1.1.5 PCR试剂 Taq DNA聚合酶，购自宝泰生物公司。4×d NTP，购自华美生物工程公司。
1.1.6 Marker pBR 322 DNA/Bst NI Markers：购自同正生物公司。Lambda DNA/Eco RI+Hind Ⅲ Markers：购自华美生物工程公司。
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1.1.7 其它试剂 ①HaeⅢ酶：购自宝泰生物公司；②2X裂解液：1mg/ml蛋白酶K，4%SDS，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA，本室配制；③饱和酚：华美公司产品；④氯仿、石蜡油和无水乙醇：常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 模板的制备 取21份血块及阴、阳性对照样品分别加1/3体积蒸馏水，用玻璃研磨器将样品磨碎，0.5ml悬液加0.5ml的2X裂解液，50℃作用4h。混悬液在4℃下10 000r/min离心20min，上清液用饱和酚抽取一次，酚和氯仿混合液(v/v为50/50)抽提一次，用乙醇沉淀提取液，70%乙醇洗涤一次，沉淀溶于50μl TE buf中留作模板。
1.2.2 NPCR ①第一次PCR：加蒸馏水38μl，缓冲液5μl，2.5mmol/L 4X dNTP 2μl，50μmol/L引物1、2各1μl，Taq DNA聚合酶1u，上述制备的模板2μl。加完上述样品后，上加石蜡油50μl。于95℃预变性180s，94℃变性45s，66℃退火60s，72℃延伸120s，循环35次，最后，延伸5min，取PCR产物1μl进行第二次PCR。②第2次PCR：用引物3、4再次扩增上次PCR产物。方法基本同第一次PCR，只是模板用1μl的前一次PCR产物，蒸馏水加39μl。PCR产物在1%琼脂糖70V电泳1h，以509bp处出现条带者为阳性，每次实验同时做阳性对照和阴性对照。③重复实验：重复上述模板制备、第一次及第二次PCR实验、电泳，结果同前次实验完全相同。
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1.2.3 酶切分析 取PCR产物5μl，加HaeⅢ内切酶2μl，HaeⅢ内切酶缓冲液5μl，蒸馏水38μl。混匀后，37℃温浴2h。酶切产物与未酶切产物在1%琼脂糖中70V电泳1h。观察PCR产物被HaeⅢ内切酶消化，产生305bp和204bp扩增带。
2 结果
临床标本中如有恙虫病立克次体56kDa抗原基因片段存在，其扩增产物在琼脂糖凝胶上509bp处出现条带为本PCR特异产物。我们对21例恙虫病患者血液标本进行NPCR检测，结果阳性者18例，总阳性率为85.7%，根据其DNA片段的大小，证明为特异性扩增带。阳性对照标本可见明显特异性扩增带，阴性对照标本10份均无扩增带。A组(确诊组)11份标本PCR均为阳性，其血清学IF检测也呈阳性。IF呈阴性反应的10例有7例NPCR阳性，其中B组(临床诊断组)PCR阳性率为85.7%(6/7)，C组(疑诊病人)阳性率为33.3%(1/3)。限制性内切酶酶切分析，PCR产物被HaeⅢ消化，并产生305bp和204bp的条带，证明PCR产物为特异性扩增带。
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3 讨论
自从1990年Stover等[2]克隆了编码恙虫病立克次体热敏蛋白的Sta58主要抗原基因以来，PCR技术对恙虫病立克次体DNA序列的检测方法已开始建立并应用于病原诊断[3～6]。我院选择了最能反映恙虫病立克次体(Rt)本质差异的56kDa抗原基因片段的部分序列作为Rt检测的靶序列，采用NPCR技术进行扩增，经DNA碱基对照及HaeⅢ酶切分析，证实特异性扩增条带。
我们利用NPCR技术对疑诊恙虫病的21例患者血液标本进行检测，其中11份经IF检测阳性的标本，其PCR检测均为阳性；10份IF检测阴性的标本有7例PCR阳性，总阳性率达85.7%。作为对照的10例非恙虫病患者的血液标本，PCR检测均为阴性。对于IF阴性的10例恙虫病患者，因其病程较短(发病后10天内采血)，虽然血清学检测不能早期诊断，但B组NPCR6/7阳性，C组1/3阳性。说明NPCR检测Rt的敏感性高，具有早期诊断价值。
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临床采集的血标本进行PCR检测时，其敏感性较细胞纯培养标本的DNA扩增稍差，可能与血液标本中存有大量的DNA多聚酶抑制物有关。通常增加酚、氯仿的抽提次数可减少这些抑制物，但抽提过多使标本中恙虫病DNA丢失过多，影响其敏感性，笔者认为以1～2次为宜。为进一步提高敏感性，我们采用重复扩增(NPCR)，获得了满意的效果。
本组-20℃保存的血液标本半数在3个月以上，最长达6个月，仍能检测到Rt，说明PCR技术对恙虫病患者的标本送检时间及保存条件并不严格，这样将有利于此项技术的开展。NPCR对血液标本的检测较Rt分离培养的时间明显缩短，且特异性高，为恙虫病立克次体的病原诊断提供了快速、便捷、可靠的检测手段。
*温州市科技发展计划基金资助项目
4 参考文献
[1] 张惠君，陈燕，黄松如等.应用抗恙虫立克次体的单抗检测恙虫立克次体抗原.中华流行病学杂志，1993，14(1)∶49
, 百拇医药
[2] Stover CK,Marana DP,Dasch GA,et al.Molecular cloning and sequence analysis of the Sta58 major antigen gene of Rickettsia tsutsugamushi:sequence homology and antigenic comparison of Sta58 to the 60- kilodalton family of stress proteins.Infect Immun,1990,58(5)∶1360
[3] Furuya Y,Yoshida Y,Katayama T,et al.Specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA from clinical specimens by polymerase chain reaction. Clin Microbiol,1991,29(11)∶2628
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[4] Sugita Y,Nagatani T,Okuda K,et al.Diagnosis of typhus infection with Rickettsia tsutsugamushi by polymerase chain reaction.J Mol Microbiol,1992,37∶357
[5] Hokee SUN,Hakchol IN,Sikchol MYUXG,et al.Detection of Rickettsia tsutsugamushi in experimentally infected mice by PCR.J Clin Microbiol,1994,32(6)∶1435
[6] Ohash N,Tamura A，Ohta M，et al.Diversity of immunodominat 56kDa type specific antigen(TSA) of Rickettsia Tsutsugamushi.J Biolo Chem，1992，267(18)：12728
(收稿：1999-01-13，修回：1999-03-1), 百拇医药