氯硝安定抗惊厥耐受及停药后脑内苯二氮类受体的变化
作者：廖建湘 王丽 左启华
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(第一作者现在518026 广东省深圳市儿童医院)
关键词：氯硝西泮；药物耐受性；物质依赖；受体；GABA-A
中华儿科杂志/980510 【摘要】 目的 探讨氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性的受体机理。方法 采用放射自显影技术，观察了11只完全点燃大鼠对氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药后大鼠脑内苯二氮类受体的变化。结果 大鼠耐受时某些脑区苯二氮类受体数目减少，而停药7天时，一些脑区受体数目增多。结论 这种受体数目的变化可能与氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性有关。
Benzodiazepine receptors in amygdala-kindled rats with tolerance to the anticonvulsant effect of clonazepam
, http://www.100md.com
Liao Jianxiang, Wang Li, Zuo Qihua.
Department of Pediatrics, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract 】 Objective To probe into the mechanisms of tolerance to the anticonvulsant effect of clonazepam. Methods The authors observed benzodiazepine receptors in amygdala-kindled rats with tolerance to anticonvulsant effect of clonazepam by using autoradiography. Results With clonazepam tolerance decreased binding of benzodiazepine receptors to[3H]flunitrazepam was found in some brain regions, while on day 7 of clonazepam discontinuation the binding increased. Conclusion These changes may be responsible for the tolerance to and dependence on the anticonvulsant effect of clonazepam.
, 百拇医药
【Key words 】 Clonazepam Drug tolerance Substance dependence Receptors,GABA-A
氯硝安定抗惊厥作用的耐受性与依赖性机理目前仍不清楚，已知其对肝药酶的诱导作用不明显，耐受性的产生与药代动力学方面的因素关系不大[1]，苯二氮类(BZs)药耐受性机理中，γ-氨基丁酸/苯二氮类受体(GABA/BZR)的功能也渐引起关注。氯硝安定主要通过作用于脑内GABA/BZR而发挥抗惊厥作用。我们用放射自显影法(ARG)，观察氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药后大鼠脑内苯二氮类受体的变化，以期对氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性的机理进行探讨。
材料和方法
一、材料
1.大鼠杏仁核电点燃癫痫模型的建立：Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，参考Rosenberg等[2]的方法，自制双极锰、镍、铜、硅、铬合金电极，电刺激参数：单相方波，80 Hz，波宽5 ms，强度为100 μA，持续时间2秒。每日上午8时及下午6时各刺激1次，直至获连续5次5期惊厥，即被完全点燃。获完全点燃大鼠11只。
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2.主要试剂和实验材料：[3H]氟硝基安定，3085.8 GBq/mmol，NEN○ R，购自美国Du Pont公司。氚片购自瑞典LKB公司。原子核乳胶(核-4型)由北京原子能研究所提供。
二、方法
1.氯硝安定处理：用完全点燃大鼠7只，作为氯硝安定处理组，每日上午8时、下午2时和7时用氯硝安定灌胃，每次1 mg/kg。用完全点燃大鼠4只作为对照组，用溶剂丙二醇每日3次，每次2 ml/kg灌胃。边处理边检测上述两组的抗惊厥耐受性，观察惊厥等级及后放电时间，检测方法参见Rosenberg等[2]的实验。处理共4周后，氯硝安定处理组大鼠形成抗惊厥作用耐受，表现为相同剂量的氯硝安定原有预防电刺激诱发惊厥的作用明显减弱或消失，大鼠接受电刺激(参数同上)后惊厥等级升高，后放电时间延长，与完全点燃大鼠惊厥情况无异。作为对照组的4只大鼠对氯硝安定的抗惊厥作用未产生
, 百拇医药
表1 氯硝安定耐受及停药后各脑区BZR的分布(宏观ARG，吸光度) 脑区
耐受组
(n=4)
对照组
(n=4)
停药时
(n=3)
停药7天时
(n=3)
纹状体左侧
0.225±0.412
0.255±0.047
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0.177±0.015
0.220±0.021*
右侧
0.238±0.029
0.268±0.030
0.158±0.023
0.203±0.041
听皮质左侧
0.233±0.050
0.278±0.045
0.197±0.207
, http://www.100md.com
0.207±0.022
右侧
0.255±0.044
0.273±0.030
0.178±0.024
0.233±0.019*
CA1左侧
0.255±0.010*
0.288±0.016
0.207±0.031
0.207±0.045
, 百拇医药
右侧
0.260±0.000
0.295±0.041
0.218±0.086
0.230±0.056
CA2左侧
0.225±0.065
0.218±0.021
0.167±0.031
0.205±0.032
右侧
0.233±0.059
, 百拇医药
0.263±0.042
0.186±0.026
0.218±0.027
CA3左侧
0.190±0.070
0.198±0.040
0.152±0.047
0.180±0.064
右侧
0.245±0.050
0.223±0.069
, 百拇医药 0.134±0.015
0.215±0.827**
CA4左侧
0.230±0.022
0.235±0.037
0.170±0.018
0.235±0.024**
右侧
0.233±0.037
0.238±0.031
0.160±0.037
, 百拇医药
0.227±0.042
DG左侧
0.139±0.015
0.146±0.008
0.210±0.037
0.285±0.036*
右侧
0.123±0.014*
0.168±0.025
0.228±0.034
0.297±0.034*
, 百拇医药
注：耐受与对照组相比较，停药时与停药7天相比较，* P<0.05，**P<0.01；CA为海马，DG为齿状回耐受。将氯硝安定处理组中4只鼠作为耐受组与对照组对比BZR的变化；并取部分脑切片作为“停药时”组，与停药7天时对比BZR的变化；对氯硝安定处理组另3只鼠停氯硝安定后观察其抗惊厥耐受性有无变化，结果停药7天时与停药时耐受性无异，同时观察停药7天时BZR变化。
2.BZR检测：采用放射自显影术。(1)BZR结合：断头处死大鼠，冰上完整取出其脑组织，速冻，恒冷箱切片机切片，片厚10 μm，根据参考文献[3]及预实验获得的理想受体结合孵育条件，用8 nmol/L[3H]氟硝基安定、0℃、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、pH值7.4，孵育30分钟。每张载玻片用15 ml冷缓冲液20秒钟内洗涤完毕，冷风吹干备用。受体结合特异性检验：取部分脑切片，受体结合孵育条件如上，但加入氯硝安定(BZR特异性激动剂)，作为[3H]氟硝基安定与BZR结合的竞争性抑制剂，当氯硝安定浓度远远高于[3H]氟硝基安定时，[3H]氟硝基安定与BZR结合量应可忽略(将孵育后洗涤过的脑切片刮下进行液体闪烁计数时，受体结合量与对照无异；将脑切片进行放射自显影时，底片显影为空白)，以此证实[3H]氟硝基安定与BZR结合的特异性。氯硝安定终浓度200 μmol/L。(2)自显影制备[4]：宏观自显影(宏观ARG)，用接触法，感光材料用氚片。微观光学显微镜自显影(微观ARG)，用绞链接触法，感光材料用“核-4”乳胶。将脑切片自显影制备曝光，D-19b显影液显影，F-5定影液定影，切片固定，克紫染色，封固。在自显影制备过程中，耐受组与对照组同等条件下进行，停药时与停药7天时同等条件下进行。
, 百拇医药
3.统计学处理
宏观ARG：用IBAS 20000图像分析系统(德国)检测氚片吸光度，结果以均值加减标准差表示。微观ARG：目镜中放已知面积的网格，低倍镜下辨认组织结构，油镜下计数每100 μm2面积上的银粒数，变异系数控制在1%～2%。统计学处理用t检验。
结果
一、宏观ARG观察BZR的变化(表1)
宏观ARG见各脑区BZR分布密度不一致，海马1区，齿状回，大脑及小脑皮质分布密度高。耐受时左侧海马1区及右侧齿状回较对照组的BZR数目明显减少。停药7天时各脑区BZR数目增多，与停药时比较差异有显著意义的脑区有：左侧纹状皮质、右侧听皮质、右侧海马3区、左侧海马4区、两侧齿状回。
二、微观ARG观察BZR的变化(表2)
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微观ARG见氯硝安定抗惊厥作用耐受时各脑区BZR数目减少，与对照组比较差异有显著意义的有：左侧纹状皮质、左颞叶皮质听区、右侧海马1区多形层、左侧海马1区分子层、右侧海马3区多形细胞层、右齿状回分子层，小脑蚓部及袢状叶分子层，停药7天时各脑区BZR数目增多，与停药时比较差异有显著意义的脑区有：左侧纹状皮质、右侧颞叶皮质听区、右海马1区、右侧海马2区、左、右海马3区分子层、左齿状回分子层、右齿状回颗粒层。
表2 氯硝安定耐受及停药后各脑区BZR的变化(微观ARG，银粒数/100 μm2) 脑区
耐受组
(n=4)
对照组
(n=3)
停药时
, 百拇医药
(n=3)
停药7天
(n=3)
纹状皮质左侧
9.6±3.0*
15.4±2.1
6.6±1.7
11.4±2.1**
右侧
11.1±2.7
14.0±1.3
11.3±1.3
, 百拇医药
15.3±4.1
听皮质左侧
8.3±2.5*
12.5±0.9
8.6±2.2
9.4±3.6
右侧
11.3±1.4
16.0±2.8
8.8±1.3
18.7±2.3*
CA1多形层左侧
, 百拇医药
11.4±3.3
12.6±2.1
12.9±1.6
15.6±3.7
右侧
8.4±2.8*
13.9±1.3
11.6±1.4
15.1±6.1
CA1分子层左侧
11.1±2.1*
, http://www.100md.com 14.7±0.8
13.8±0.6
15.7±5.2
右侧
10.0±2.8
14.0±1.8
12.5±0.8
17.1±2.6*
CA2多形层左侧
8.1±1.7
10.8±1.3
11.2±1.9
, 百拇医药
12.3±3.8
右侧
10.0±1.3
11.4±2.4
10.5±1.2
13.6±5.6
CA2分子层左侧
9.1±1.4
11.5±3.8
10.2±1.2
11.3±3.0
右侧
, 百拇医药
9.7±0.6
10.9±2.4
9.7±0.6
13.6±2.0*
CA3多形层左侧
8.4±1.7
12.6±3.2
10.5±0.7
12.7±5.1
右侧
8.8±0.7*
12.1±1.9
, http://www.100md.com
10.4±0.5
11.2±5.3
CA3分子层左侧
8.8±2.2
11.5±3.6
10.9±1.9
16.4±3.0*
右侧
8.5±1.2
12.0±5.8
8.7±1.3
13.7±1.4**
, 百拇医药
CA4多形层左侧
10.5±2.4
11.9±4.7
11.8±1.8
19.1±6.5
右侧
9.4±3.0
12.8±1.6
10.5±2.2
14.2±6.4
CA4分子层左侧
11.0±3.6
, 百拇医药
13.3±3.5
13.9±1.3
16.2±3.2
右侧
8.9±3.0
11.5±2.4
10.4±2.3
13.1±1.6
DG分子层左侧
19.7±4.7
19.1±3.4
18.4±3.0
, 百拇医药
29.5±6.5*
右侧
16.4±3.8*
26.4±4.2
19.1±2.4
29.6±6.4
DG颗粒层左侧
12.4±2.8
14.0±3.0
14.8±1.2
17.1±3.0
, http://www.100md.com 右侧
10.2±2.3
15.5±3.4
12.6±0.8
19.4±4.9*
蚓部分子层
7.7±1.9**
12.7±0.9
10.8±2.7
11.1±0.6
蚓部颗粒层
3.4±1.2
, 百拇医药
4.3±1.7
4.8±2.1
4.6±0.9
半球分子层
9.2±2.1*
13.1±1.0
10.6±3.2
11.5±0.9
半球颗粒层
3.4±0.6
4.0±1.6
5.5±3.8
, http://www.100md.com
4.6±0.8
注：耐受与对照组相比较，停药7天时与停药时相比较，* P<0.05，** P<0.01；CA为海马，DG为齿状回；蚓部，半球分别指小脑蚓部及小脑半球，小脑半球未分左、右侧讨论
宏观ARG能很直观地看到BZR分布特点，各脑区分布不均，海马1区、齿状回、大脑及小脑皮质分布密度高，与文献报道[3]相同，同时采用微观ARG，不但可以更精确地定位，而且更敏感地反映受体数目的变化；宏观法与微观法还可以相互印证，相互补充，是值得推广和发展的研究方法。
我们用BZR放射自显影技术在大鼠杏仁核电点燃癫痫模型上观察了氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药7天时BZR的变化，发现耐受时一些脑区BZR数目减少，而停药7天时，BZR数目增多。BZR在这些脑区发生变化，提示这些脑区在氯硝安定抗惊厥作用耐受时其抑制功能可能减弱，而停药7天时其抑制功能可能较停药时增强。
, 百拇医药
临床上氯硝安定抗惊厥作用耐受性及撤药症状都表现有癫痫发作频率增加，提示中枢神经系统在某种条件时兴奋性增强。脑内GABA/BZR氯离子通道复合物是中枢神经系统抑制功能的重要组成部分，我们曾推测在氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药时，中枢神经抑制系统功能相对减低。我们的结果显示，耐受时BZR的变化与我们的预想一致，而停药时则与预想结果相反。推测这种现象是机体中枢神经系统维持其功能于某一稳态的适应性反应。氯硝安定抗惊厥作用耐受性和依赖性与GABA/BZR氯离子通道复合物关系密切。当中枢神经系统接受外源抑制剂(如氯硝安定)时内源性抑制系统(如GABA/BZR系统)相应会减弱，而外源抑制剂撤离时，内源抑制系统相应功能增强，这样，中枢神经系统抑制功能可维持动态平衡，但其更详细的机理尚待深入研究。
小鼠对BZR部分激动剂Ro16-6028的行为活动抑制不耐受[5]，其脑BZR结合、[35S]TBPS与氯离子通道结合和GABA受体结合都无变化，BZR拮抗剂氯马西尼(flumazenil)可使部分性癫痫发作患者对氯硝安定的抗癫痫作用耐受重新敏感[6]，并可纠正BZs撤药的焦虑症状和依赖症状[7]；进一步说明BZs耐受性及依赖性与GABA/BZR氯离子通道复合物功能关系密切。我们用BZR完全激动剂氯硝安定的实验结果提示，用BZR部分激动和拮抗剂来对抗BZs耐受性与依赖性值得进一步探索，从而为临床解决氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性问题提供有效途径。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Miller LG. Chronic benzodiazepine administration: from the patient to the gene. J Clin Pharmacol, 1991, 3:492-495.
2 Rosenberg HC, Tietz EI, Chiu TH. Tolerance to anticonvulsant effects of diazepam, clonazepam and clobazam in amygdala kindled rats. Epilepsia, 1989, 3:276-285.
3 Nobrega JN, Kish SJ, Burnham WM. Autoradiographic analysis of benzodiazepine binding in entorhinal-kindled rat brains. Brain Res, 1989, 498:315-322.
, 百拇医药
4 刘鼎新.放射自显影技术.北京：科学出版社，1986，55-58.
5 Hernandez TD, Heninger C, Wilson MA, et al. Relationship of agonist efficacy to changes in GABA sensitivity and anticonvulsant tolerance following chronic benzodiazepine ligand exposure. Eur J Pharmacol, 1989, 170:145-155.
6 Savic I, Widen L, Stone-Elander S. Feasibility of reversing benzodiazipine tolerance with flumazenil. Lancet, 1991, 337:133-137.
7 Baldwin LG. File SE. Flumazenil Prevents the development of chlordiazepoxide withdrawal in the social interaction test of anxiety. Psychopharmacology, 1989, 97:424-426., http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(第一作者现在518026 广东省深圳市儿童医院)
关键词：氯硝西泮；药物耐受性；物质依赖；受体；GABA-A
中华儿科杂志/980510 【摘要】 目的 探讨氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性的受体机理。方法 采用放射自显影技术，观察了11只完全点燃大鼠对氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药后大鼠脑内苯二氮类受体的变化。结果 大鼠耐受时某些脑区苯二氮类受体数目减少，而停药7天时，一些脑区受体数目增多。结论 这种受体数目的变化可能与氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性有关。
Benzodiazepine receptors in amygdala-kindled rats with tolerance to the anticonvulsant effect of clonazepam
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Liao Jianxiang, Wang Li, Zuo Qihua.
Department of Pediatrics, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract 】 Objective To probe into the mechanisms of tolerance to the anticonvulsant effect of clonazepam. Methods The authors observed benzodiazepine receptors in amygdala-kindled rats with tolerance to anticonvulsant effect of clonazepam by using autoradiography. Results With clonazepam tolerance decreased binding of benzodiazepine receptors to[3H]flunitrazepam was found in some brain regions, while on day 7 of clonazepam discontinuation the binding increased. Conclusion These changes may be responsible for the tolerance to and dependence on the anticonvulsant effect of clonazepam.
, 百拇医药
【Key words 】 Clonazepam Drug tolerance Substance dependence Receptors,GABA-A
氯硝安定抗惊厥作用的耐受性与依赖性机理目前仍不清楚，已知其对肝药酶的诱导作用不明显，耐受性的产生与药代动力学方面的因素关系不大[1]，苯二氮类(BZs)药耐受性机理中，γ-氨基丁酸/苯二氮类受体(GABA/BZR)的功能也渐引起关注。氯硝安定主要通过作用于脑内GABA/BZR而发挥抗惊厥作用。我们用放射自显影法(ARG)，观察氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药后大鼠脑内苯二氮类受体的变化，以期对氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性的机理进行探讨。
材料和方法
一、材料
1.大鼠杏仁核电点燃癫痫模型的建立：Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，参考Rosenberg等[2]的方法，自制双极锰、镍、铜、硅、铬合金电极，电刺激参数：单相方波，80 Hz，波宽5 ms，强度为100 μA，持续时间2秒。每日上午8时及下午6时各刺激1次，直至获连续5次5期惊厥，即被完全点燃。获完全点燃大鼠11只。
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2.主要试剂和实验材料：[3H]氟硝基安定，3085.8 GBq/mmol，NEN○ R，购自美国Du Pont公司。氚片购自瑞典LKB公司。原子核乳胶(核-4型)由北京原子能研究所提供。
二、方法
1.氯硝安定处理：用完全点燃大鼠7只，作为氯硝安定处理组，每日上午8时、下午2时和7时用氯硝安定灌胃，每次1 mg/kg。用完全点燃大鼠4只作为对照组，用溶剂丙二醇每日3次，每次2 ml/kg灌胃。边处理边检测上述两组的抗惊厥耐受性，观察惊厥等级及后放电时间，检测方法参见Rosenberg等[2]的实验。处理共4周后，氯硝安定处理组大鼠形成抗惊厥作用耐受，表现为相同剂量的氯硝安定原有预防电刺激诱发惊厥的作用明显减弱或消失，大鼠接受电刺激(参数同上)后惊厥等级升高，后放电时间延长，与完全点燃大鼠惊厥情况无异。作为对照组的4只大鼠对氯硝安定的抗惊厥作用未产生
, 百拇医药
表1 氯硝安定耐受及停药后各脑区BZR的分布(宏观ARG，吸光度) 脑区
耐受组
(n=4)
对照组
(n=4)
停药时
(n=3)
停药7天时
(n=3)
纹状体左侧
0.225±0.412
0.255±0.047
, http://www.100md.com
0.177±0.015
0.220±0.021*
右侧
0.238±0.029
0.268±0.030
0.158±0.023
0.203±0.041
听皮质左侧
0.233±0.050
0.278±0.045
0.197±0.207
, http://www.100md.com
0.207±0.022
右侧
0.255±0.044
0.273±0.030
0.178±0.024
0.233±0.019*
CA1左侧
0.255±0.010*
0.288±0.016
0.207±0.031
0.207±0.045
, 百拇医药
右侧
0.260±0.000
0.295±0.041
0.218±0.086
0.230±0.056
CA2左侧
0.225±0.065
0.218±0.021
0.167±0.031
0.205±0.032
右侧
0.233±0.059
, 百拇医药
0.263±0.042
0.186±0.026
0.218±0.027
CA3左侧
0.190±0.070
0.198±0.040
0.152±0.047
0.180±0.064
右侧
0.245±0.050
0.223±0.069
, 百拇医药 0.134±0.015
0.215±0.827**
CA4左侧
0.230±0.022
0.235±0.037
0.170±0.018
0.235±0.024**
右侧
0.233±0.037
0.238±0.031
0.160±0.037
, 百拇医药
0.227±0.042
DG左侧
0.139±0.015
0.146±0.008
0.210±0.037
0.285±0.036*
右侧
0.123±0.014*
0.168±0.025
0.228±0.034
0.297±0.034*
, 百拇医药
注：耐受与对照组相比较，停药时与停药7天相比较，* P<0.05，**P<0.01；CA为海马，DG为齿状回耐受。将氯硝安定处理组中4只鼠作为耐受组与对照组对比BZR的变化；并取部分脑切片作为“停药时”组，与停药7天时对比BZR的变化；对氯硝安定处理组另3只鼠停氯硝安定后观察其抗惊厥耐受性有无变化，结果停药7天时与停药时耐受性无异，同时观察停药7天时BZR变化。
2.BZR检测：采用放射自显影术。(1)BZR结合：断头处死大鼠，冰上完整取出其脑组织，速冻，恒冷箱切片机切片，片厚10 μm，根据参考文献[3]及预实验获得的理想受体结合孵育条件，用8 nmol/L[3H]氟硝基安定、0℃、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、pH值7.4，孵育30分钟。每张载玻片用15 ml冷缓冲液20秒钟内洗涤完毕，冷风吹干备用。受体结合特异性检验：取部分脑切片，受体结合孵育条件如上，但加入氯硝安定(BZR特异性激动剂)，作为[3H]氟硝基安定与BZR结合的竞争性抑制剂，当氯硝安定浓度远远高于[3H]氟硝基安定时，[3H]氟硝基安定与BZR结合量应可忽略(将孵育后洗涤过的脑切片刮下进行液体闪烁计数时，受体结合量与对照无异；将脑切片进行放射自显影时，底片显影为空白)，以此证实[3H]氟硝基安定与BZR结合的特异性。氯硝安定终浓度200 μmol/L。(2)自显影制备[4]：宏观自显影(宏观ARG)，用接触法，感光材料用氚片。微观光学显微镜自显影(微观ARG)，用绞链接触法，感光材料用“核-4”乳胶。将脑切片自显影制备曝光，D-19b显影液显影，F-5定影液定影，切片固定，克紫染色，封固。在自显影制备过程中，耐受组与对照组同等条件下进行，停药时与停药7天时同等条件下进行。
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3.统计学处理
宏观ARG：用IBAS 20000图像分析系统(德国)检测氚片吸光度，结果以均值加减标准差表示。微观ARG：目镜中放已知面积的网格，低倍镜下辨认组织结构，油镜下计数每100 μm2面积上的银粒数，变异系数控制在1%～2%。统计学处理用t检验。
结果
一、宏观ARG观察BZR的变化(表1)
宏观ARG见各脑区BZR分布密度不一致，海马1区，齿状回，大脑及小脑皮质分布密度高。耐受时左侧海马1区及右侧齿状回较对照组的BZR数目明显减少。停药7天时各脑区BZR数目增多，与停药时比较差异有显著意义的脑区有：左侧纹状皮质、右侧听皮质、右侧海马3区、左侧海马4区、两侧齿状回。
二、微观ARG观察BZR的变化(表2)
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微观ARG见氯硝安定抗惊厥作用耐受时各脑区BZR数目减少，与对照组比较差异有显著意义的有：左侧纹状皮质、左颞叶皮质听区、右侧海马1区多形层、左侧海马1区分子层、右侧海马3区多形细胞层、右齿状回分子层，小脑蚓部及袢状叶分子层，停药7天时各脑区BZR数目增多，与停药时比较差异有显著意义的脑区有：左侧纹状皮质、右侧颞叶皮质听区、右海马1区、右侧海马2区、左、右海马3区分子层、左齿状回分子层、右齿状回颗粒层。
表2 氯硝安定耐受及停药后各脑区BZR的变化(微观ARG，银粒数/100 μm2) 脑区
耐受组
(n=4)
对照组
(n=3)
停药时
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(n=3)
停药7天
(n=3)
纹状皮质左侧
9.6±3.0*
15.4±2.1
6.6±1.7
11.4±2.1**
右侧
11.1±2.7
14.0±1.3
11.3±1.3
, 百拇医药
15.3±4.1
听皮质左侧
8.3±2.5*
12.5±0.9
8.6±2.2
9.4±3.6
右侧
11.3±1.4
16.0±2.8
8.8±1.3
18.7±2.3*
CA1多形层左侧
, 百拇医药
11.4±3.3
12.6±2.1
12.9±1.6
15.6±3.7
右侧
8.4±2.8*
13.9±1.3
11.6±1.4
15.1±6.1
CA1分子层左侧
11.1±2.1*
, http://www.100md.com 14.7±0.8
13.8±0.6
15.7±5.2
右侧
10.0±2.8
14.0±1.8
12.5±0.8
17.1±2.6*
CA2多形层左侧
8.1±1.7
10.8±1.3
11.2±1.9
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12.3±3.8
右侧
10.0±1.3
11.4±2.4
10.5±1.2
13.6±5.6
CA2分子层左侧
9.1±1.4
11.5±3.8
10.2±1.2
11.3±3.0
右侧
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9.7±0.6
10.9±2.4
9.7±0.6
13.6±2.0*
CA3多形层左侧
8.4±1.7
12.6±3.2
10.5±0.7
12.7±5.1
右侧
8.8±0.7*
12.1±1.9
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10.4±0.5
11.2±5.3
CA3分子层左侧
8.8±2.2
11.5±3.6
10.9±1.9
16.4±3.0*
右侧
8.5±1.2
12.0±5.8
8.7±1.3
13.7±1.4**
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CA4多形层左侧
10.5±2.4
11.9±4.7
11.8±1.8
19.1±6.5
右侧
9.4±3.0
12.8±1.6
10.5±2.2
14.2±6.4
CA4分子层左侧
11.0±3.6
, 百拇医药
13.3±3.5
13.9±1.3
16.2±3.2
右侧
8.9±3.0
11.5±2.4
10.4±2.3
13.1±1.6
DG分子层左侧
19.7±4.7
19.1±3.4
18.4±3.0
, 百拇医药
29.5±6.5*
右侧
16.4±3.8*
26.4±4.2
19.1±2.4
29.6±6.4
DG颗粒层左侧
12.4±2.8
14.0±3.0
14.8±1.2
17.1±3.0
, http://www.100md.com 右侧
10.2±2.3
15.5±3.4
12.6±0.8
19.4±4.9*
蚓部分子层
7.7±1.9**
12.7±0.9
10.8±2.7
11.1±0.6
蚓部颗粒层
3.4±1.2
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4.3±1.7
4.8±2.1
4.6±0.9
半球分子层
9.2±2.1*
13.1±1.0
10.6±3.2
11.5±0.9
半球颗粒层
3.4±0.6
4.0±1.6
5.5±3.8
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4.6±0.8
注：耐受与对照组相比较，停药7天时与停药时相比较，* P<0.05，** P<0.01；CA为海马，DG为齿状回；蚓部，半球分别指小脑蚓部及小脑半球，小脑半球未分左、右侧讨论
宏观ARG能很直观地看到BZR分布特点，各脑区分布不均，海马1区、齿状回、大脑及小脑皮质分布密度高，与文献报道[3]相同，同时采用微观ARG，不但可以更精确地定位，而且更敏感地反映受体数目的变化；宏观法与微观法还可以相互印证，相互补充，是值得推广和发展的研究方法。
我们用BZR放射自显影技术在大鼠杏仁核电点燃癫痫模型上观察了氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药7天时BZR的变化，发现耐受时一些脑区BZR数目减少，而停药7天时，BZR数目增多。BZR在这些脑区发生变化，提示这些脑区在氯硝安定抗惊厥作用耐受时其抑制功能可能减弱，而停药7天时其抑制功能可能较停药时增强。
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临床上氯硝安定抗惊厥作用耐受性及撤药症状都表现有癫痫发作频率增加，提示中枢神经系统在某种条件时兴奋性增强。脑内GABA/BZR氯离子通道复合物是中枢神经系统抑制功能的重要组成部分，我们曾推测在氯硝安定抗惊厥作用耐受及停药时，中枢神经抑制系统功能相对减低。我们的结果显示，耐受时BZR的变化与我们的预想一致，而停药时则与预想结果相反。推测这种现象是机体中枢神经系统维持其功能于某一稳态的适应性反应。氯硝安定抗惊厥作用耐受性和依赖性与GABA/BZR氯离子通道复合物关系密切。当中枢神经系统接受外源抑制剂(如氯硝安定)时内源性抑制系统(如GABA/BZR系统)相应会减弱，而外源抑制剂撤离时，内源抑制系统相应功能增强，这样，中枢神经系统抑制功能可维持动态平衡，但其更详细的机理尚待深入研究。
小鼠对BZR部分激动剂Ro16-6028的行为活动抑制不耐受[5]，其脑BZR结合、[35S]TBPS与氯离子通道结合和GABA受体结合都无变化，BZR拮抗剂氯马西尼(flumazenil)可使部分性癫痫发作患者对氯硝安定的抗癫痫作用耐受重新敏感[6]，并可纠正BZs撤药的焦虑症状和依赖症状[7]；进一步说明BZs耐受性及依赖性与GABA/BZR氯离子通道复合物功能关系密切。我们用BZR完全激动剂氯硝安定的实验结果提示，用BZR部分激动和拮抗剂来对抗BZs耐受性与依赖性值得进一步探索，从而为临床解决氯硝安定抗惊厥作用耐受性及依赖性问题提供有效途径。
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参考文献
1 Miller LG. Chronic benzodiazepine administration: from the patient to the gene. J Clin Pharmacol, 1991, 3:492-495.
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3 Nobrega JN, Kish SJ, Burnham WM. Autoradiographic analysis of benzodiazepine binding in entorhinal-kindled rat brains. Brain Res, 1989, 498:315-322.
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4 刘鼎新.放射自显影技术.北京：科学出版社，1986，55-58.
5 Hernandez TD, Heninger C, Wilson MA, et al. Relationship of agonist efficacy to changes in GABA sensitivity and anticonvulsant tolerance following chronic benzodiazepine ligand exposure. Eur J Pharmacol, 1989, 170:145-155.
6 Savic I, Widen L, Stone-Elander S. Feasibility of reversing benzodiazipine tolerance with flumazenil. Lancet, 1991, 337:133-137.
7 Baldwin LG. File SE. Flumazenil Prevents the development of chlordiazepoxide withdrawal in the social interaction test of anxiety. Psychopharmacology, 1989, 97:424-426., http://www.100md.com