板蓝根二酮 B 体外抗癌活性研究
作者：梁永红 侯华新 黎丹戎 秦箐 邱莉 吴华慧
单位：梁永红 侯华新 秦箐 邱莉 吴华慧(广西医科大学 南宁 530021)；黎丹戎(广西肿瘤防治研究所)
关键词：板蓝根二酮B；抗肿瘤活性；肝癌；卵巢癌
中草药000729摘 要 目的：板蓝根二酮 B 抗人肝癌 BEL-7402细胞、卵巢癌 A2780 细胞体外活性研究。方法：MTT 法测定板蓝根二酮 B 对肝癌 BEL-7402 细胞和卵巢癌 A2780 细胞的抑制作用，集落形成实验观察药物的诱导分化作用，PCR-ELISA 试剂盒测定细胞的端粒酶活性。结果：板蓝根二酮 B 具有抑制肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞增殖的能力，其 IC50 分别为 8.2 μg/mL 和 7.8 μg/mL；且具有诱导分化作用，可降低端粒酶活性的表达。结论：研究结果提示板蓝根二酮 B 具有体外抗肿瘤活性。
, http://www.100md.com
Studies on in vitro Anticancer Activity of Tryptanthrin B
Liang Yonghong
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Hou Huaxin
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Li Danrong
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
, 百拇医药
Qin Jing
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Qiu Li
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Wu Huahui
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Abstrast To study the in vitro anticancer activity of tryptanthrin B, one of the active constituent of the root of Isatis tinctoria L. on BEL-7402 human hepatocellular carcinoma cell and A2780 human ovarian cancer cell. Cytotoxicity assay was tested by MTT method. Signs of induction differentiation was observed by colony forming units assay. Telomerase activity in cell was determined by PCR-ELISA method. IC50 of tryptanthrin B on BEL-7402 and A2780 cell lines were 8.2 μg/mL and 7.8 μg/mL respectively. Telomerase activity was dramatically declined and defferentiation of both cancer cell lines was observed. Tryptanthrin B possesed antitumor activity in vitro.
, http://www.100md.com
Key words Isatis tinctoria L. tryptanthrin B hepatocellular carcinoma BEL-7402 ovarian cancer A2780
板蓝根为菘蓝 Isatis tinctoria L.的根，有镇痛、凉血和解毒之功效。从80年代开始，已从板蓝根中分离、提取出几十种脂溶性组分，并发现这些组分具有抗内毒素、活血、降血压、抗炎等作用[1，2]。而板蓝根的抗癌活性国内外尚未见报道。我们课题组在筛选抗肿瘤药物过程中发现，脂溶性板蓝根提取物——板蓝根二酮 B在体外对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞有较强的杀伤力。
1 材料
1.1 受试药物：板蓝根二酮B，吲哚并[2，16]喹唑啉酮-6，12-二酮，其结构式如图1。板蓝根二酮 B 由本课题组分离提纯鉴定。MTT(噻唑蓝)为 Sigma 公司产品，RPMI1640 为 Gibco 公司产品，端粒酶 PCR-ELISA 检测试剂盒购自德国 Boehringerr Manheiman 公司。MR-300 酶标仪为美国产。黑马 480DNA 扩增仪为珠海产。
图1 板蓝根二酮B(tryptanthrin)
, 百拇医药
1.2 细胞株：人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞由广西肿瘤防治研究所免疫室传代保株。
2 实验方法和结果
2.1 细胞毒实验：取对数生长的人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞 1.0×105 /mL，分装于 96 孔板，每孔 0.1 mL，细胞板内的细胞常规培养于含 10% 小牛血清，10 mg/L 青霉素和 10 mg/L 链霉素的 RPMI-1640 培养液中，37 ℃、5%CO2 下培养 24 h后，分别加入不同浓度的板蓝根二酮 B，各组设 3 个平行孔，空白对照为生理盐水。加药完毕继续孵育 48 h，实验终止前加入 2 mg/mL MTT 液，再培养 4 h，测试前加入 DMSO，充分振匀后，测定每孔 490 nm 下的吸光度(A)值，按下列公式求出生长抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50)。
, http://www.100md.com
从表1可见，在3.10，6.20，12.5，25.0，50.0 μg/mL 浓度下，板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞生长抑制率随药物浓度的升高而升高，IC50 分别为 8.2 和 7.8 mg/L。
表1 板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌
细胞 A2780 的 IR 及IC50值(n=3) 药物浓度
(mg/L)
抑制率(%)
IC50(μg/mL)
BEL-7402
A2780
, http://www.100md.com
BEL-7402
A2780
3.0
34.26
36.12
6.2
40.38
47.20
12.5
74.22
78.12
8.2
7.8
, http://www.100md.com
25.0
82.38
85.22
50.0
88.02
89.16
2.2 端粒酶活性测定：肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞用半数抑制浓度的板蓝根二酮 B 处理不同时间后，制备端粒酶提取液。取细胞提取液 5 μL 加入 25 μL TRAP PCR 扩增液，在 PCR 扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25 ℃ 30 min、90 ℃ 5 min 循环一个周期，再以 94 ℃ 30 s 变性，50 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s 延伸，共循环 30 个周期，平衡 72 ℃ 10 min。取上述 PCR 产物 5 μL 加变性液 20 μL 混匀，置室温 10 min，加入杂交液 225 μL 混匀后取出 100 μL 包被于抗地高辛的酶标板中，室温作用 2 h，加入过氧化物酶并与底物显色作用 30 min 后终止反应，测定 450 nm 和 690 nm 的吸光值(A)。结果经板蓝根二酮 B 处理的 BEL-7402 细胞和 A2780 细胞分别培养 1，3，5 d 后，进行端粒酶活性测定，其 A 值分别为 0.381，0.276，0 和 0.341，0.277，0，而未经药物处理的肝癌细胞、卵巢癌细胞其 A 值为 1.60 和 1.46。
, 百拇医药
2.3 集落形成实验：实验组和对照组各 3 例，前者加入一定浓度的药物，后者加入等量溶剂，接种于培养瓶中，每瓶 5 万个细胞，加培养液 1 mL，于 37 ℃，5% CO2 培养 1～3 d，瑞士染色，记数集落数，多于 50 个细胞者记为集落，按下式计算集落抑制率，经相应的半数抑制浓度板蓝根二酮 B 处理后的肝癌 BEL-7402细胞、卵巢癌 A2780 细胞集落形成数明显少于空白细胞的集落。结果见表2。
表2 板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌
细胞 A2780 集落形成的影响 t
(d)
空白细胞集落
(个)
, http://www.100md.com 给药组集落
(个)
集落抑制率
(%)
BEL-7402
A2780
BEL-7402
A2780
BEL-7402
A2780
0
76
66
, 百拇医药
—
—
1
109
98
86
74
21.10
24.48
2
234
219
46
37
, 百拇医药
80.34
83.10
3
388
298
19
10
95.10
96.64
3 讨论
3.1 从板蓝根二酮 B 抗肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞活性表明，板蓝根二酮 B 有体外抑制肝癌 BEL-7402 细胞和卵巢癌 A2780 细胞的能力，抑制作用均与浓度呈梯度关系，且抑制卵巢癌 A2780 细胞的能力比肝癌 BEL-7402 细胞强，这可能是由于肝癌 BEL-7402 细胞为诸多恶性肿瘤细胞中增殖速度最快且又难以控制的种类之一，与许多临床结果相一致[3]。
, 百拇医药
3.2 板蓝根是临床上常用的药物，但目前从板蓝根中提取的化合物为数不多，尤其是象板蓝根二酮 B 这类具有抗肿瘤作用的活性物质尚未见报道。MTT 实验结果表明，板蓝根二酮 B 对肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞具有较强的体外杀伤能力，其半数抑制量分别为 8.2 μg/mL 和 7.8 μg/mL，符合 IC50<10 μg/mL 被认为有研究价值的要求[4]。同时集落形成实验也表明：板蓝根二酮 B 具有逆转肿瘤细胞向正常细胞转化的能力。
3.3 端粒酶的激活是恶性肿瘤学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种恶性肿瘤细胞的一个共同的分子标志物，大多数肿瘤细胞的增殖与端粒酶的活化有关，抑制端粒酶的活性可以影响肿瘤的生物学行为。大量实验表明，端粒酶的作用是在 DNA 复制期线性染色体末端添加 TTAGGG 重复序列，从而使细胞无限增殖，导致肿瘤发生和细胞永生化[5，6]。本实验结果表明 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞具有非常高的端粒酶活性，而板蓝根二酮 B 能抑制 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞的端粒酶活性，且随着板蓝根二酮 B 作用时间越长，其端粒酶表达越弱。提示板蓝根二酮 B 可能具有抑制肿瘤活性能力，在临床抗肿瘤方面有潜在价值。对我们正在进行板蓝根二酮 B 构效关系的研究具有积极意义。
, 百拇医药
本课题为广西教育科研资助项目，桂1999[383]-5
梁永红 大学本科毕业，理学学士，高校讲师，现从事天然药物化学方面研究工作。
参考文献
1，刘云海.中国药科大学学报，1995，26(5)：297
2，Honda G. Planta Med，1980,38(Mar):275
3，李连弟，鲁凤珠，张思维，等.中华肿瘤杂志，1997，19(1)：4
4，徐叔云主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：1443
5，赵冬兵，张 伟，金顺钱，等.中华肿瘤杂志，1998，20(3)：199
6，Jerry W S,Woodring E W.Curr Opin Onconl,1996,8:66
(2000-01-27收稿), http://www.100md.com
单位：梁永红 侯华新 秦箐 邱莉 吴华慧(广西医科大学 南宁 530021)；黎丹戎(广西肿瘤防治研究所)
关键词：板蓝根二酮B；抗肿瘤活性；肝癌；卵巢癌
中草药000729摘 要 目的：板蓝根二酮 B 抗人肝癌 BEL-7402细胞、卵巢癌 A2780 细胞体外活性研究。方法：MTT 法测定板蓝根二酮 B 对肝癌 BEL-7402 细胞和卵巢癌 A2780 细胞的抑制作用，集落形成实验观察药物的诱导分化作用，PCR-ELISA 试剂盒测定细胞的端粒酶活性。结果：板蓝根二酮 B 具有抑制肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞增殖的能力，其 IC50 分别为 8.2 μg/mL 和 7.8 μg/mL；且具有诱导分化作用，可降低端粒酶活性的表达。结论：研究结果提示板蓝根二酮 B 具有体外抗肿瘤活性。
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Studies on in vitro Anticancer Activity of Tryptanthrin B
Liang Yonghong
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Hou Huaxin
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Li Danrong
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
, 百拇医药
Qin Jing
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Qiu Li
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Wu Huahui
(Guangxi University of Medical Sciences Nanning 530021)
Abstrast To study the in vitro anticancer activity of tryptanthrin B, one of the active constituent of the root of Isatis tinctoria L. on BEL-7402 human hepatocellular carcinoma cell and A2780 human ovarian cancer cell. Cytotoxicity assay was tested by MTT method. Signs of induction differentiation was observed by colony forming units assay. Telomerase activity in cell was determined by PCR-ELISA method. IC50 of tryptanthrin B on BEL-7402 and A2780 cell lines were 8.2 μg/mL and 7.8 μg/mL respectively. Telomerase activity was dramatically declined and defferentiation of both cancer cell lines was observed. Tryptanthrin B possesed antitumor activity in vitro.
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Key words Isatis tinctoria L. tryptanthrin B hepatocellular carcinoma BEL-7402 ovarian cancer A2780
板蓝根为菘蓝 Isatis tinctoria L.的根，有镇痛、凉血和解毒之功效。从80年代开始，已从板蓝根中分离、提取出几十种脂溶性组分，并发现这些组分具有抗内毒素、活血、降血压、抗炎等作用[1，2]。而板蓝根的抗癌活性国内外尚未见报道。我们课题组在筛选抗肿瘤药物过程中发现，脂溶性板蓝根提取物——板蓝根二酮 B在体外对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞有较强的杀伤力。
1 材料
1.1 受试药物：板蓝根二酮B，吲哚并[2，16]喹唑啉酮-6，12-二酮，其结构式如图1。板蓝根二酮 B 由本课题组分离提纯鉴定。MTT(噻唑蓝)为 Sigma 公司产品，RPMI1640 为 Gibco 公司产品，端粒酶 PCR-ELISA 检测试剂盒购自德国 Boehringerr Manheiman 公司。MR-300 酶标仪为美国产。黑马 480DNA 扩增仪为珠海产。
图1 板蓝根二酮B(tryptanthrin), 百拇医药
1.2 细胞株：人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞由广西肿瘤防治研究所免疫室传代保株。
2 实验方法和结果
2.1 细胞毒实验：取对数生长的人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞 1.0×105 /mL，分装于 96 孔板，每孔 0.1 mL，细胞板内的细胞常规培养于含 10% 小牛血清，10 mg/L 青霉素和 10 mg/L 链霉素的 RPMI-1640 培养液中，37 ℃、5%CO2 下培养 24 h后，分别加入不同浓度的板蓝根二酮 B，各组设 3 个平行孔，空白对照为生理盐水。加药完毕继续孵育 48 h，实验终止前加入 2 mg/mL MTT 液，再培养 4 h，测试前加入 DMSO，充分振匀后，测定每孔 490 nm 下的吸光度(A)值，按下列公式求出生长抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50)。
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从表1可见，在3.10，6.20，12.5，25.0，50.0 μg/mL 浓度下，板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞生长抑制率随药物浓度的升高而升高，IC50 分别为 8.2 和 7.8 mg/L。
表1 板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌
细胞 A2780 的 IR 及IC50值(n=3) 药物浓度
(mg/L)
抑制率(%)
IC50(μg/mL)
BEL-7402
A2780
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BEL-7402
A2780
3.0
34.26
36.12
6.2
40.38
47.20
12.5
74.22
78.12
8.2
7.8
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25.0
82.38
85.22
50.0
88.02
89.16
2.2 端粒酶活性测定：肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌 A2780 细胞用半数抑制浓度的板蓝根二酮 B 处理不同时间后，制备端粒酶提取液。取细胞提取液 5 μL 加入 25 μL TRAP PCR 扩增液，在 PCR 扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25 ℃ 30 min、90 ℃ 5 min 循环一个周期，再以 94 ℃ 30 s 变性，50 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s 延伸，共循环 30 个周期，平衡 72 ℃ 10 min。取上述 PCR 产物 5 μL 加变性液 20 μL 混匀，置室温 10 min，加入杂交液 225 μL 混匀后取出 100 μL 包被于抗地高辛的酶标板中，室温作用 2 h，加入过氧化物酶并与底物显色作用 30 min 后终止反应，测定 450 nm 和 690 nm 的吸光值(A)。结果经板蓝根二酮 B 处理的 BEL-7402 细胞和 A2780 细胞分别培养 1，3，5 d 后，进行端粒酶活性测定，其 A 值分别为 0.381，0.276，0 和 0.341，0.277，0，而未经药物处理的肝癌细胞、卵巢癌细胞其 A 值为 1.60 和 1.46。
, 百拇医药
2.3 集落形成实验：实验组和对照组各 3 例，前者加入一定浓度的药物，后者加入等量溶剂，接种于培养瓶中，每瓶 5 万个细胞，加培养液 1 mL，于 37 ℃，5% CO2 培养 1～3 d，瑞士染色，记数集落数，多于 50 个细胞者记为集落，按下式计算集落抑制率，经相应的半数抑制浓度板蓝根二酮 B 处理后的肝癌 BEL-7402细胞、卵巢癌 A2780 细胞集落形成数明显少于空白细胞的集落。结果见表2。
表2 板蓝根二酮 B 对人肝癌细胞 BEL-7402、卵巢癌细胞 A2780 集落形成的影响 t
(d)
空白细胞集落
(个)
, http://www.100md.com 给药组集落
(个)
集落抑制率
(%)
BEL-7402
A2780
BEL-7402
A2780
BEL-7402
A2780
0
76
66
, 百拇医药
—
—
1
109
98
86
74
21.10
24.48
2
234
219
46
37
, 百拇医药
80.34
83.10
3
388
298
19
10
95.10
96.64
3 讨论
3.1 从板蓝根二酮 B 抗肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞活性表明，板蓝根二酮 B 有体外抑制肝癌 BEL-7402 细胞和卵巢癌 A2780 细胞的能力，抑制作用均与浓度呈梯度关系，且抑制卵巢癌 A2780 细胞的能力比肝癌 BEL-7402 细胞强，这可能是由于肝癌 BEL-7402 细胞为诸多恶性肿瘤细胞中增殖速度最快且又难以控制的种类之一，与许多临床结果相一致[3]。
, 百拇医药
3.2 板蓝根是临床上常用的药物，但目前从板蓝根中提取的化合物为数不多，尤其是象板蓝根二酮 B 这类具有抗肿瘤作用的活性物质尚未见报道。MTT 实验结果表明，板蓝根二酮 B 对肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞具有较强的体外杀伤能力，其半数抑制量分别为 8.2 μg/mL 和 7.8 μg/mL，符合 IC50<10 μg/mL 被认为有研究价值的要求[4]。同时集落形成实验也表明：板蓝根二酮 B 具有逆转肿瘤细胞向正常细胞转化的能力。
3.3 端粒酶的激活是恶性肿瘤学上的一个共同途径，而端粒酶则是各种恶性肿瘤细胞的一个共同的分子标志物，大多数肿瘤细胞的增殖与端粒酶的活化有关，抑制端粒酶的活性可以影响肿瘤的生物学行为。大量实验表明，端粒酶的作用是在 DNA 复制期线性染色体末端添加 TTAGGG 重复序列，从而使细胞无限增殖，导致肿瘤发生和细胞永生化[5，6]。本实验结果表明 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞具有非常高的端粒酶活性，而板蓝根二酮 B 能抑制 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细胞的端粒酶活性，且随着板蓝根二酮 B 作用时间越长，其端粒酶表达越弱。提示板蓝根二酮 B 可能具有抑制肿瘤活性能力，在临床抗肿瘤方面有潜在价值。对我们正在进行板蓝根二酮 B 构效关系的研究具有积极意义。
, 百拇医药
本课题为广西教育科研资助项目，桂1999[383]-5
梁永红 大学本科毕业，理学学士，高校讲师，现从事天然药物化学方面研究工作。
参考文献
1，刘云海.中国药科大学学报，1995，26(5)：297
2，Honda G. Planta Med，1980,38(Mar):275
3，李连弟，鲁凤珠，张思维，等.中华肿瘤杂志，1997，19(1)：4
4，徐叔云主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：1443
5，赵冬兵，张 伟，金顺钱，等.中华肿瘤杂志，1998，20(3)：199
6，Jerry W S,Woodring E W.Curr Opin Onconl,1996,8:66
(2000-01-27收稿), http://www.100md.com