仓鼠到大鼠原位肝移植38例
作者：谈景旺 张绍庚 钱光相 吴孟超
单位：谈景旺 张绍庚 福州总医院普外科 福建省福州市 350025; 钱光相 吴孟超 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 上海市 200433
关键词：仓鼠；大鼠；肝移植；动物模型
世界华人消化杂志991030 中国图书馆分类号 R574
Subject headings hamster; rat; liver transplantation; animal model
近年来，由于同种肝移植的巨大进步，供肝来源不足的矛盾日益尖锐，人们的兴趣重新转向异种移植，兴起了异种移植研究的热潮[1]. 仓鼠到大鼠肝脏移植为协调性异种移植[2]，因其排斥反应稳定，来源丰富，价格便宜，是开展异种肝移植基础研究较好模型之一，但手术难度较大，限制了使用. 本实验在参考Harihara et al、Kamada et al[3，4]所介绍的方法的基础上，加以改进，简化了手术操作，缩短了手术时间，并探索出预防各种并发症的有效措施，提高了手术成功率，为广泛开展异种肝移植基础研究提供了良好稳定的实验模型.
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1 材料和方法
1.1 材料 仓鼠(上海计划生育研究所动物中心提供).♀，40～60天龄，体重90g～120g. 受体：Wistar大鼠(中科院上海分院动物中心提供). ♂，50天龄～60天龄，体重180g～220g，供受体相差约100g，术前12h禁食，给水. 肉眼清洁手术.
1.2 方法
1.2.1 供体手术 氯胺酮腹腔麻醉(100mg/kg)，持续面罩给氧，“+”字切口进腹. 自镰状韧带顺时针方向游离肝周韧带，遇食管静脉、左肾上腺静脉分别结扎之. 下腔静脉游离：先处理左肾静脉，靠下腔结扎并切断，暴露右肾动脉并结扎之，接着依次结扎、切断右肾静脉、卵巢静脉及2～4支腰静脉，使肝下下腔静脉(IVC)有足够的长度可利用. 游离胆管，距肝总管约5mm处剪开前壁，顺此口缓缓插入外径0.96mm，长5mm的聚乙烯管，结扎固定. 门静脉游离：结扎切断幽门静脉支，远离主干单结结扎脾静脉，最后结扎肝动脉. 自肠系膜上静脉置管，缓缓注入20mL(含肝素20kU/L)乳酸盐液，随即自左肾静脉平面下约0.5cm处剪断下腔静脉，并用4℃生理盐水不断浇淋肝脏 ，使肝脏迅速降温，温度维持在较低水平. 连同大部分膈肌剪断肝上下静脉(SVC)、肝下下腔静脉、门静脉等各侧支血管，置入4℃乳酸盐水中.
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1.2.2 血管袖套准备 在冰浴中进行，IVC和PV袖套分别选用外径2.8mm，1.8mm左右聚乙烯管，PV可利用脾静脉汇合处作一嗽叭口，外翻固定[5](见图1). 用丝线结扎胆囊颈部，剪除残余胆囊. SVC选用外径5.0mm，内径3.8mm的聚乙烯管，体长2.0mm，柄长1.0mm，体部中央刻有浅槽. 袖套前，修剪好SVC胸腔开口处，使SVC腔口扩大，自套管口完整穿出，外翻，3/0丝线双重结扎固定，剪除残余膈肌[3](见图2).
图1 肝下腔静脉、门静脉袖套制作方法
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图2 肝上腔静脉袖套制作及吻合方法.
1.2.3 受体手术 术前15min，阿托品0.03mg，im； 乙醚麻醉，仰卧位，正中切口入腹，锐性分离肝周韧带，遇食管静脉支及右肾上腺静脉支分别结扎之，游离下腔静脉至右肾静脉上缘. 游离PV至脾静脉上缘，结扎肝动脉，依次阻断下腔静脉、PV，自肝门PV穿剌注入生理盐水2mL，驱除肝脏余血至肝脏变白. 用Satinsky钳夹SVC入胸腔处小部分膈肌阻断SVC，自肝中叶下剪开下腔静脉膨大处，保留SVC背侧壁，作一结扎线牵引，向下剪除中肝叶外肝组织，在SVC近膈肌处垫一1/0丝线以备结扎套管[3]. 将供肝SVC套管套入受体SVC中，牢固结扎，剪除残余中肝叶，然后自门静脉驱除腔静脉驱除残余空气，套好门静脉，松开上述两处血管夹，结束无肝期. 再依次套入IVC、胆管，结扎固定. 分别于术后1，3，5，7d处死动物，取小块肝组织用100mL/L福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察.
2 结果
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1996-08/1996-12用该法行仓鼠到大鼠原位肝移植38例，供体血管袖套准备时间35min±4min，受体手术时间40min±4.5min，无肝期9min～13min，平均10.8min±3.0min，手术死亡4例，2例死于出血，1例死于原发性移植肝无功能，1例死于胆漏，手术成功率(34/38)为89.5%，生存时间6d～8d，平均7.3d±0.5d. 术后1d，组织结构基本正常，无明显淋巴细胞浸润. 术后d3，肝组织轻微的屑样坏死，但结构基本正常，汇管区出现许多淋巴细胞浸润，术后5d，肝组织大片状坏死，但仍可见正常的肝组织结构，伴有单核淋巴细胞大量浸润；术后7d，肝组织坏死，难找到正常肝组织结构，单核淋巴细胞遍布，汇管区大量单核淋巴细胞浸润.
3 讨论
与大鼠不同，仓鼠有其独自的特点：解剖结构较大鼠复杂，其下腔静脉鞘周围脂肪较多，静脉被脂肪包埋其中，难于分离；血管大小与大鼠不匹配，尤其是肝上下腔静脉(SVC)较大鼠明显小；仓鼠对各种麻醉剂如氯胺酮、乙醚耐受差，呼吸易受抑制，肝组织较脆，容易出血等. 由于这些原因，仓鼠到大鼠异种肝移植较大鼠同种肝移植难度明显增加. 本实验针对异种肝移植的特点，参考其他作者所使用的各种同种大鼠肝移植方法的基础上，加以改进，同时又采取一系列预防并发症措施，所建立起来的异种肝移植模型，排斥反应稳定，其手术方法也有较明显的优越性.
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3.1 模型实用性 ①简化了血管吻合技术：由于肝移植血管吻合部位深，操作空间小，SVC缝合吻合较困难，且异种肝脏血管大小不匹配，更增加缝合方法吻合的难度，易发生吻合口漏血，无可挽救，袖套法吻合则简单、省时，血管大小不匹配也不影响效果. 且不妥时可重新套，提高了手术成功机会. ②各血管吻合口血流通畅良好：与其他三袖套法相比[6]，该种袖套的内径为3.8cm，SVC有足够大的血流通道，不存在狭窄. 该套管体部较短，约2mm，不会压迫肝静脉，袖套完成后，三支肝静脉的开口清晰可见. 对于门静脉套管，我们利用了脾静脉残端作一喇叭口整形，使其口径得到扩大，能比较容易地外翻套在内径1.8mm的套管上. 无肝期明显缩短：其他方法无肝期均在20min左右[4，6]. 本组无肝期明显缩短，最快8min即可结束无肝期，平均11min，大大缩短无肝期，结果可减少血流动力学对全身的影响；减轻供肝植入时相对热缺血损伤以及减轻胃肠道瘀血对肝脏及全身的影响[7].
3.2 预防各种并发症的措施 ①出血：术后出血为初学者早期常见并发症. 主要预防措施：注意避免操作粗暴，取供肝及植肝过程中，尽量减少接触肝脏. 本实验采用顺时针一次性游离肝周韧带，动作轻柔，极大限度地减少肝脏损伤；因SVC套管外套有膈肌后，套入受体SVC时，必须用丝线牢固结扎才不致留有空隙而漏血. 本实验中死于出血的其中一例正是SVC吻合时结扎欠牢而致出血死亡. ②胆漏：胆漏大多是因为胆管支架管的另一端未插入胆总管内，而误插在受体软组织中所致. 因此，胆道重建时，必须看清受体胆管开口，顺入口处缓慢插入，避免损伤胆管壁，甚至穿通. 另由于肝动脉未重建，供肝胆管残端不宜太长，以防缺血坏死致胆漏. ③原发性移植肝无功能：仓鼠肝脏明显较大鼠小，且仓鼠对麻醉耐受力差，呼吸容易呈抑制状态，供体手术时容易造成缺氧损伤，因此，较大鼠同种肝移植易致原发性移植肝无功能. 表现为恢复血流后，胆汁很少，有的甚至见不到胆汁流出. 初期预实验时，供体手术未予吸氧，仓鼠因麻醉呼吸受到抑制，供肝始终呈暗红色，处于缺氧状态，供肝植入后，胆汁流出很少甚至没有，很少有存活超过24h者. 后经术中持续给氧，调整好麻醉深度，供肝质量明显好转，手术才获得成功. 另外，供肝开始灌注后，应不停用4℃生理盐水浇灌肝脏，最后游离门静脉，结扎肝动脉；术前禁食，减少胃肠道耗氧量等措施，可极大限度减轻肝脏缺血再灌注损伤，避免移植肝无功能的发生.
, 百拇医药
此外，门静脉、腔静脉气栓也是初学者容易犯的错误. 灌注液内必须避免气泡. 植肝时，SVC吻合好后，必须经门静脉灌注，清除供肝内腔静脉残留气泡，门、腔静脉套管吻合时，最好注入一些生理盐水，在水中操作，另外，由于异种肝脏上、下径较大鼠短，IVC游离要有足够长度，血管吻合后，不至于形成张力致血管管径缩小，影响血流.
通讯作者：谈景旺
参考文献
1 Calne RY. The xenograft. In: Calne RY. Xenograft. Netherlands: Elsevier, 1990:3-7
2 Remp E, Andersen G, Barfort P. The concordant xenograft. In: Calne RY, Xenograft, Netherlands, Elsevier, 1990:17-31
, 百拇医药
3 Harihara Y, Sanjo R, Idesuki Y. A modified cuff technique for superahepatic vena cava anastomosis. Transplantation, 1992；53：707-710
4 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation, 1979;28:47-48
5 严以群，杨甲梅，王轩，吴孟超. 大鼠减体积性肝移植模型的初步研究. 中华器官移植杂志，1996；4：55-57
6 Miyata N, Fischer IM, Fuhs M. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation, 1980;30:335
7 曾祺华，孙君泓，吴孟超. 三袖套法大鼠原位肝移植术. 中华器官移植杂志，1989；10：159-161
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-26, 百拇医药
单位：谈景旺 张绍庚 福州总医院普外科 福建省福州市 350025; 钱光相 吴孟超 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 上海市 200433
关键词：仓鼠；大鼠；肝移植；动物模型
世界华人消化杂志991030 中国图书馆分类号 R574
Subject headings hamster; rat; liver transplantation; animal model
近年来，由于同种肝移植的巨大进步，供肝来源不足的矛盾日益尖锐，人们的兴趣重新转向异种移植，兴起了异种移植研究的热潮[1]. 仓鼠到大鼠肝脏移植为协调性异种移植[2]，因其排斥反应稳定，来源丰富，价格便宜，是开展异种肝移植基础研究较好模型之一，但手术难度较大，限制了使用. 本实验在参考Harihara et al、Kamada et al[3，4]所介绍的方法的基础上，加以改进，简化了手术操作，缩短了手术时间，并探索出预防各种并发症的有效措施，提高了手术成功率，为广泛开展异种肝移植基础研究提供了良好稳定的实验模型.
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1 材料和方法
1.1 材料 仓鼠(上海计划生育研究所动物中心提供).♀，40～60天龄，体重90g～120g. 受体：Wistar大鼠(中科院上海分院动物中心提供). ♂，50天龄～60天龄，体重180g～220g，供受体相差约100g，术前12h禁食，给水. 肉眼清洁手术.
1.2 方法
1.2.1 供体手术 氯胺酮腹腔麻醉(100mg/kg)，持续面罩给氧，“+”字切口进腹. 自镰状韧带顺时针方向游离肝周韧带，遇食管静脉、左肾上腺静脉分别结扎之. 下腔静脉游离：先处理左肾静脉，靠下腔结扎并切断，暴露右肾动脉并结扎之，接着依次结扎、切断右肾静脉、卵巢静脉及2～4支腰静脉，使肝下下腔静脉(IVC)有足够的长度可利用. 游离胆管，距肝总管约5mm处剪开前壁，顺此口缓缓插入外径0.96mm，长5mm的聚乙烯管，结扎固定. 门静脉游离：结扎切断幽门静脉支，远离主干单结结扎脾静脉，最后结扎肝动脉. 自肠系膜上静脉置管，缓缓注入20mL(含肝素20kU/L)乳酸盐液，随即自左肾静脉平面下约0.5cm处剪断下腔静脉，并用4℃生理盐水不断浇淋肝脏 ，使肝脏迅速降温，温度维持在较低水平. 连同大部分膈肌剪断肝上下静脉(SVC)、肝下下腔静脉、门静脉等各侧支血管，置入4℃乳酸盐水中.
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1.2.2 血管袖套准备 在冰浴中进行，IVC和PV袖套分别选用外径2.8mm，1.8mm左右聚乙烯管，PV可利用脾静脉汇合处作一嗽叭口，外翻固定[5](见图1). 用丝线结扎胆囊颈部，剪除残余胆囊. SVC选用外径5.0mm，内径3.8mm的聚乙烯管，体长2.0mm，柄长1.0mm，体部中央刻有浅槽. 袖套前，修剪好SVC胸腔开口处，使SVC腔口扩大，自套管口完整穿出，外翻，3/0丝线双重结扎固定，剪除残余膈肌[3](见图2).
图1 肝下腔静脉、门静脉袖套制作方法
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图2 肝上腔静脉袖套制作及吻合方法.
1.2.3 受体手术 术前15min，阿托品0.03mg，im； 乙醚麻醉，仰卧位，正中切口入腹，锐性分离肝周韧带，遇食管静脉支及右肾上腺静脉支分别结扎之，游离下腔静脉至右肾静脉上缘. 游离PV至脾静脉上缘，结扎肝动脉，依次阻断下腔静脉、PV，自肝门PV穿剌注入生理盐水2mL，驱除肝脏余血至肝脏变白. 用Satinsky钳夹SVC入胸腔处小部分膈肌阻断SVC，自肝中叶下剪开下腔静脉膨大处，保留SVC背侧壁，作一结扎线牵引，向下剪除中肝叶外肝组织，在SVC近膈肌处垫一1/0丝线以备结扎套管[3]. 将供肝SVC套管套入受体SVC中，牢固结扎，剪除残余中肝叶，然后自门静脉驱除腔静脉驱除残余空气，套好门静脉，松开上述两处血管夹，结束无肝期. 再依次套入IVC、胆管，结扎固定. 分别于术后1，3，5，7d处死动物，取小块肝组织用100mL/L福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察.
2 结果
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1996-08/1996-12用该法行仓鼠到大鼠原位肝移植38例，供体血管袖套准备时间35min±4min，受体手术时间40min±4.5min，无肝期9min～13min，平均10.8min±3.0min，手术死亡4例，2例死于出血，1例死于原发性移植肝无功能，1例死于胆漏，手术成功率(34/38)为89.5%，生存时间6d～8d，平均7.3d±0.5d. 术后1d，组织结构基本正常，无明显淋巴细胞浸润. 术后d3，肝组织轻微的屑样坏死，但结构基本正常，汇管区出现许多淋巴细胞浸润，术后5d，肝组织大片状坏死，但仍可见正常的肝组织结构，伴有单核淋巴细胞大量浸润；术后7d，肝组织坏死，难找到正常肝组织结构，单核淋巴细胞遍布，汇管区大量单核淋巴细胞浸润.
3 讨论
与大鼠不同，仓鼠有其独自的特点：解剖结构较大鼠复杂，其下腔静脉鞘周围脂肪较多，静脉被脂肪包埋其中，难于分离；血管大小与大鼠不匹配，尤其是肝上下腔静脉(SVC)较大鼠明显小；仓鼠对各种麻醉剂如氯胺酮、乙醚耐受差，呼吸易受抑制，肝组织较脆，容易出血等. 由于这些原因，仓鼠到大鼠异种肝移植较大鼠同种肝移植难度明显增加. 本实验针对异种肝移植的特点，参考其他作者所使用的各种同种大鼠肝移植方法的基础上，加以改进，同时又采取一系列预防并发症措施，所建立起来的异种肝移植模型，排斥反应稳定，其手术方法也有较明显的优越性.
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3.1 模型实用性 ①简化了血管吻合技术：由于肝移植血管吻合部位深，操作空间小，SVC缝合吻合较困难，且异种肝脏血管大小不匹配，更增加缝合方法吻合的难度，易发生吻合口漏血，无可挽救，袖套法吻合则简单、省时，血管大小不匹配也不影响效果. 且不妥时可重新套，提高了手术成功机会. ②各血管吻合口血流通畅良好：与其他三袖套法相比[6]，该种袖套的内径为3.8cm，SVC有足够大的血流通道，不存在狭窄. 该套管体部较短，约2mm，不会压迫肝静脉，袖套完成后，三支肝静脉的开口清晰可见. 对于门静脉套管，我们利用了脾静脉残端作一喇叭口整形，使其口径得到扩大，能比较容易地外翻套在内径1.8mm的套管上. 无肝期明显缩短：其他方法无肝期均在20min左右[4，6]. 本组无肝期明显缩短，最快8min即可结束无肝期，平均11min，大大缩短无肝期，结果可减少血流动力学对全身的影响；减轻供肝植入时相对热缺血损伤以及减轻胃肠道瘀血对肝脏及全身的影响[7].
3.2 预防各种并发症的措施 ①出血：术后出血为初学者早期常见并发症. 主要预防措施：注意避免操作粗暴，取供肝及植肝过程中，尽量减少接触肝脏. 本实验采用顺时针一次性游离肝周韧带，动作轻柔，极大限度地减少肝脏损伤；因SVC套管外套有膈肌后，套入受体SVC时，必须用丝线牢固结扎才不致留有空隙而漏血. 本实验中死于出血的其中一例正是SVC吻合时结扎欠牢而致出血死亡. ②胆漏：胆漏大多是因为胆管支架管的另一端未插入胆总管内，而误插在受体软组织中所致. 因此，胆道重建时，必须看清受体胆管开口，顺入口处缓慢插入，避免损伤胆管壁，甚至穿通. 另由于肝动脉未重建，供肝胆管残端不宜太长，以防缺血坏死致胆漏. ③原发性移植肝无功能：仓鼠肝脏明显较大鼠小，且仓鼠对麻醉耐受力差，呼吸容易呈抑制状态，供体手术时容易造成缺氧损伤，因此，较大鼠同种肝移植易致原发性移植肝无功能. 表现为恢复血流后，胆汁很少，有的甚至见不到胆汁流出. 初期预实验时，供体手术未予吸氧，仓鼠因麻醉呼吸受到抑制，供肝始终呈暗红色，处于缺氧状态，供肝植入后，胆汁流出很少甚至没有，很少有存活超过24h者. 后经术中持续给氧，调整好麻醉深度，供肝质量明显好转，手术才获得成功. 另外，供肝开始灌注后，应不停用4℃生理盐水浇灌肝脏，最后游离门静脉，结扎肝动脉；术前禁食，减少胃肠道耗氧量等措施，可极大限度减轻肝脏缺血再灌注损伤，避免移植肝无功能的发生.
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此外，门静脉、腔静脉气栓也是初学者容易犯的错误. 灌注液内必须避免气泡. 植肝时，SVC吻合好后，必须经门静脉灌注，清除供肝内腔静脉残留气泡，门、腔静脉套管吻合时，最好注入一些生理盐水，在水中操作，另外，由于异种肝脏上、下径较大鼠短，IVC游离要有足够长度，血管吻合后，不至于形成张力致血管管径缩小，影响血流.
通讯作者：谈景旺
参考文献
1 Calne RY. The xenograft. In: Calne RY. Xenograft. Netherlands: Elsevier, 1990:3-7
2 Remp E, Andersen G, Barfort P. The concordant xenograft. In: Calne RY, Xenograft, Netherlands, Elsevier, 1990:17-31
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3 Harihara Y, Sanjo R, Idesuki Y. A modified cuff technique for superahepatic vena cava anastomosis. Transplantation, 1992；53：707-710
4 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation, 1979;28:47-48
5 严以群，杨甲梅，王轩，吴孟超. 大鼠减体积性肝移植模型的初步研究. 中华器官移植杂志，1996；4：55-57
6 Miyata N, Fischer IM, Fuhs M. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation, 1980;30:335
7 曾祺华，孙君泓，吴孟超. 三袖套法大鼠原位肝移植术. 中华器官移植杂志，1989；10：159-161
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-26, 百拇医药