ras p21癌基因在涎腺肿瘤中表达的定量研究
作者：朱声荣 王秀丽 邵乐南 陈卫民 陈新明 吴慧华
单位：430030武汉，同济医科大学附属同济医院(朱声荣，邵乐南，陈卫民，吴慧华)，湖北医科大学口腔医学院(王秀丽，陈新民)
关键词：涎腺肿瘤；ras p21；癌基因
临床口腔医学杂志990407 提 要 目的 为了探明ras p21癌基因在涎腺良恶性肿瘤生物学行为中的作用，方法 采用LSAB免疫组化染色技术及CMIASWIN免疫组化图像分析系统，镜下定量判断正常涎腺，良恶性肿瘤ras p21癌基因表达的阳性单位(PU值)，通过t检验和方差分析，结果 正常涎腺组，良性肿瘤组、恶性肿瘤组均有ras p21表达，良恶性肿瘤组PU值明显高于正常组(P<0.01)。胞浆中PU值明显强于胞核、阳性细胞最多见于腺管样区，恶性肿瘤及瘤旁腺泡分别为强阳性和弱阳性表达，复发性腮腺深叶包膜不完整的肿瘤其PU值明显高于原发性腮腺浅叶包膜完整的肿瘤。结论 实验结果表明ras p21癌基因的激活在涎腺良恶性肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用。
, 百拇医药
A quantitative study on ras oncogene p21 expression in salivary gland tumors
Zhu Shengrong, wang xiuli, shao Lenan et al
Department of Stomatology Tongji Hospital Tongji Medical University Wuhan 430030.
Abstract To determine the role of ras oncogene p21 in biological behaviour of salivary gland neoplasms, the expression of ras p21 in normal salivary acini, benign tumors and carcinomas were microscopically observed by immunohistochemistry. Dealed with quantitative analysis under analysis system of CMIASWIN map, by analysis of variance and student-t test. The results indicated that the expression of ras p21 were discoreved in all three groups which the possitive unit(PU)is higher in benign and malignant groups than that in normal group (P<0.01). Meanwhile the PU of p21 is stronger in cytoplasm than in nucleus, that most of PU cells are seen is salivary duct (intercalated or striated duct) region and appeared possitive cells in the place of infiltration of cancer simultaneously, as well as the PU of ras p21 is stronger in deep lobe of recurrent parotid neoplasm which the coating is incomplete than in shallow lobe of primary parotid neoplasm which the coating is complete. So we consider that activation of ras oncogene p21 may play an inportant roles in the tumorigenesis and the development of the salivary neoplasms.
, 百拇医药
Key words Salivary gland neoplasm. Oncogene ras p21.
有关ras基因的研究表明，它是人体的一个重要原癌基因，已见有关ras p21癌基因在人体各部位肿瘤中表达的报道〔1，2〕。本研究应用免疫组化技术对涎腺瘤中ras p21表达进行定量分析，探讨ras p21癌基因在涎腺良恶性肿瘤中的表达及其临床意义。
材料与方法
病例选择：从1990～1997年本院存档的石蜡标本中，分别选出腮腺多形性腺瘤(包括复发病例)，基底细胞腺瘤、恶性多形性腺瘤、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺泡细胞癌、腺癌等68例，其中良性肿瘤38例，恶性肿瘤30例，良恶性肿瘤中各选2块局部淋巴结标本。另选正常涎腺组织标本8例。男性36例，女性32例，年龄为12～73岁，平均38岁。肿瘤直径最大者8cm，最小者1cm。肿瘤位于腮腺深叶者29例，位于浅叶者39例。包膜完整者39例，不完整者29例，原发者58例，复发者10例。
, 百拇医药
染色方法：鼠抗人p21蛋白多克降抗体购自美国Santa cruz公司。4μ组织切片→PBS冲洗5分钟→室温下加1%H2O2阻断内源酶10分钟→PBS冲洗→微波处理、自然冷却至室温→PBS冲洗→加一抗4℃过液→PBS冲洗→加二抗37℃30分钟→PAP 37℃ 30分钟→PBS冲洗→SAB显色→苏木素复染→梯度脱水→透明→封片镜检。
结果判定：评分标准，采用定量评估法凡胞浆，胞核内棕色表达颗粒均为阳性目标，其阳性目标PU值0分者为阴性，5分以下者为弱阳，5分以上者为阳性，10分以上者为强阳。随机选4个高视野(400×)，以平均数为分值。
④ 统计处理：在CMIASWIN真彩色病理图像分析系统上计录目标总个数，搜寻阳性目标总个数，测量阳性目标总面积，统计面密度和数密度，根据表达强度，测定阳性目标单位(PU值)，将所获资料进行方差分析，q检验和t检验，检验水准取双侧a=0.05。
, 百拇医药
结 果
正常腺体，良性肿瘤，恶性肿瘤p21蛋白表达免疫组化图像统计分析示表1。
表1 P 21蛋白表达图像统计分析(um)
阳性细胞数
阳性细胞面积
面密度
数密度
正常腺体
1144±526
650±358
, http://www.100md.com
0.137±0.07
0.241±0.11
良性肿瘤
1046±332
676±296
0.143±0.06
0.221±0.07
恶性肿瘤
854±185
528±230
0.111±0.04
0.180±0.03
, 百拇医药
F=1.26
F=0.65
F=0.62
F=1.25
P>0.05
P>0.05
P>0.05
P>0.05
表1所示，免疫组化图像分析提示、阳性细胞数、阳性细胞面积以及面密度，数密度在正常腺体，良恶性肿瘤之间微有差别，经方差分析，均无显著性(P>0.05)表明观察方法和手段在三组中是一致的。
正常腺体，良性肿瘤，恶性肿瘤p21蛋白表达免疫组比PU值示表2。表2 p21蛋白表达图像PU值比较
, 百拇医药
组数
q值
P
1.正常腺体
4.531±2.963
1与2
29.17
<0.01
2.良性肿瘤
12.00±2.246
1与3
44.99
<0.01
, 百拇医药
3.恶性肿瘤
16.05±3.663
2与3
15.82
<0.01
F=31.43 P<0.01
表2所示，p21蛋白表达PU值在恶性肿瘤中最高，良性肿瘤次之，正常腺体最低，经方差分析及q检验，三组之间具有高度显著性差异(P<0.01)，按PU值等级分析，恶性肿瘤阳性以上占90%，弱阳性以下占10%，良性肿瘤阳性以上占75%，弱阳性以下占25%，正常腺体阳性以上占20%，弱阳性以下占80%。镜下所见，p21蛋白主要在胞浆内表达，亦可见胞核表达。其表达部位主要在腺管样区腺泡，其次为肌上使团块区，鳞状化生区及粘液软骨样区的阳性表达。部分恶性肿瘤浸润至瘤旁腺泡p21蛋白分别为强阳性和弱阳性表达。良恶性肿瘤区域内淋巴结呈阴性表达。
, http://www.100md.com
涎腺肿瘤发生，部位，包膜不同情况p21表达(表3)。
表3 涎腺肿瘤发生部位包膜情况p21表达比较(PU值)
t
P
原 发
10.73±3.40
2.611
<0.05
复 发
15.59±3.76
, http://www.100md.com
浅 叶
10.96±3.73
2.021
<0.05
深 叶
15.77±4.69
完 整
10.89±3.64
3.227
<0.01
不完整
16.18±3.55
, 百拇医药 表3所示，复发性腮腺深叶包膜不完整者p21蛋白PU值高于原发性腮腺浅叶包膜完整者(P<0.05)(图1～4)。
图1 腮腺多形性腺瘤腺泡，腺管，鳞状化生及粘液软骨样区均可见p21阳性表达 LSAB法 ×100
图2 腮腺多形性腺瘤恶变大部分腺泡区p21呈阳性表达 LSAB法 ×400
图3 腮腺腺样囊性癌可见p21强阳性表达以腺管样区腺泡阳性表达最为明显 LSAB法 ×100
, 百拇医药
图4 腮腺腺样囊性癌可见P21强阳性表达 LSAB法 ×400
讨 论
有关ras p21蛋白在涎腺肿瘤中表达的报道不多，本研究结果显示①涎腺组织、良性肿瘤、恶性肿瘤中均有p21蛋白表达，图像统计及方差分析表明三组之间PU值有显著性差异(P<0.01)，良恶性肿瘤组p21蛋白阳性表达明显高于正常组。②涎腺良恶性肿瘤细胞胞浆p21蛋白表达明显强于(或多于)细胞核的表达，亦可见部分区域呈强阳性表达，部分区域呈弱阳性甚至阴性表达。③涎腺肿瘤p21蛋白阳性表达特征主要在腺管样区，亦可见其他区域。④部分恶性肿瘤及瘤旁腺泡p21蛋白分别为强阳性和弱阳性表达的征象。⑤良恶性肿瘤区域内淋巴结呈阴性表达。⑥无论良恶性肿瘤，其复发性腮腺深叶包膜不完整的肿瘤，PU值高于原发性腮腺浅叶包膜完整的肿瘤(P<0.05)。
, 百拇医药 关于涎腺多形性瘤ras p21的表达率在24～100之间〔3，4〕。王洁等〔5〕的表达率为78%，本文良性肿瘤阳性以上表达率为75%，与之接近。提示ras基因的激活在很大程度上参与了多形性腺瘤的发生和发展，我们推测ras p21癌基因在肿瘤细胞生长增殖过程中起着重要的调控作用。
(致谢本研究承蒙同济医院实验中心赵西平及病理学教研室周晟协助。)
参考文献
1 Viola MV. Fromowitz F,Oravez S et al. Expression of ras oncogene p21 in prostate cancer. New England J Medicine. 1986;314:133.
2 Hand PH, Vilasi V, Thor A et al. Quantitation of Havey ras p21 enhanced expression in human breast and colon carcinomas. J Natl cancer Inst, 1987;79:59.
, 百拇医药
3 Deguchi H, Hamano H, Hayashi Y c-myc, ras p21 and p53 expression in pleomorphic adenoma and its malignant form of the human salivary glands. Acta Pathol Jpn. 1993;43:413.
4 Okutsu S, Takeda A, Suzuki T et al. Expression of ras p21 and ras gene alteration in pleomorphic adenomas. J Nihon Univ Sch Dent 1993;35:200.
5 王洁，董福生，王小玲等，ras p21 与P53在涎腺多形性腺瘤中表达的定量研究.中华口腔医学杂志1997；23：208.
(收稿：1999—02—05), http://www.100md.com
单位：430030武汉，同济医科大学附属同济医院(朱声荣，邵乐南，陈卫民，吴慧华)，湖北医科大学口腔医学院(王秀丽，陈新民)
关键词：涎腺肿瘤；ras p21；癌基因
临床口腔医学杂志990407 提 要 目的 为了探明ras p21癌基因在涎腺良恶性肿瘤生物学行为中的作用，方法 采用LSAB免疫组化染色技术及CMIASWIN免疫组化图像分析系统，镜下定量判断正常涎腺，良恶性肿瘤ras p21癌基因表达的阳性单位(PU值)，通过t检验和方差分析，结果 正常涎腺组，良性肿瘤组、恶性肿瘤组均有ras p21表达，良恶性肿瘤组PU值明显高于正常组(P<0.01)。胞浆中PU值明显强于胞核、阳性细胞最多见于腺管样区，恶性肿瘤及瘤旁腺泡分别为强阳性和弱阳性表达，复发性腮腺深叶包膜不完整的肿瘤其PU值明显高于原发性腮腺浅叶包膜完整的肿瘤。结论 实验结果表明ras p21癌基因的激活在涎腺良恶性肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用。
, 百拇医药
A quantitative study on ras oncogene p21 expression in salivary gland tumors
Zhu Shengrong, wang xiuli, shao Lenan et al
Department of Stomatology Tongji Hospital Tongji Medical University Wuhan 430030.
Abstract To determine the role of ras oncogene p21 in biological behaviour of salivary gland neoplasms, the expression of ras p21 in normal salivary acini, benign tumors and carcinomas were microscopically observed by immunohistochemistry. Dealed with quantitative analysis under analysis system of CMIASWIN map, by analysis of variance and student-t test. The results indicated that the expression of ras p21 were discoreved in all three groups which the possitive unit(PU)is higher in benign and malignant groups than that in normal group (P<0.01). Meanwhile the PU of p21 is stronger in cytoplasm than in nucleus, that most of PU cells are seen is salivary duct (intercalated or striated duct) region and appeared possitive cells in the place of infiltration of cancer simultaneously, as well as the PU of ras p21 is stronger in deep lobe of recurrent parotid neoplasm which the coating is incomplete than in shallow lobe of primary parotid neoplasm which the coating is complete. So we consider that activation of ras oncogene p21 may play an inportant roles in the tumorigenesis and the development of the salivary neoplasms.
, 百拇医药
Key words Salivary gland neoplasm. Oncogene ras p21.
有关ras基因的研究表明，它是人体的一个重要原癌基因，已见有关ras p21癌基因在人体各部位肿瘤中表达的报道〔1，2〕。本研究应用免疫组化技术对涎腺瘤中ras p21表达进行定量分析，探讨ras p21癌基因在涎腺良恶性肿瘤中的表达及其临床意义。
材料与方法
病例选择：从1990～1997年本院存档的石蜡标本中，分别选出腮腺多形性腺瘤(包括复发病例)，基底细胞腺瘤、恶性多形性腺瘤、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺泡细胞癌、腺癌等68例，其中良性肿瘤38例，恶性肿瘤30例，良恶性肿瘤中各选2块局部淋巴结标本。另选正常涎腺组织标本8例。男性36例，女性32例，年龄为12～73岁，平均38岁。肿瘤直径最大者8cm，最小者1cm。肿瘤位于腮腺深叶者29例，位于浅叶者39例。包膜完整者39例，不完整者29例，原发者58例，复发者10例。
, 百拇医药
染色方法：鼠抗人p21蛋白多克降抗体购自美国Santa cruz公司。4μ组织切片→PBS冲洗5分钟→室温下加1%H2O2阻断内源酶10分钟→PBS冲洗→微波处理、自然冷却至室温→PBS冲洗→加一抗4℃过液→PBS冲洗→加二抗37℃30分钟→PAP 37℃ 30分钟→PBS冲洗→SAB显色→苏木素复染→梯度脱水→透明→封片镜检。
结果判定：评分标准，采用定量评估法凡胞浆，胞核内棕色表达颗粒均为阳性目标，其阳性目标PU值0分者为阴性，5分以下者为弱阳，5分以上者为阳性，10分以上者为强阳。随机选4个高视野(400×)，以平均数为分值。
④ 统计处理：在CMIASWIN真彩色病理图像分析系统上计录目标总个数，搜寻阳性目标总个数，测量阳性目标总面积，统计面密度和数密度，根据表达强度，测定阳性目标单位(PU值)，将所获资料进行方差分析，q检验和t检验，检验水准取双侧a=0.05。
, 百拇医药
结 果
正常腺体，良性肿瘤，恶性肿瘤p21蛋白表达免疫组化图像统计分析示表1。
表1 P 21蛋白表达图像统计分析(um)
阳性细胞数
阳性细胞面积
面密度
数密度
正常腺体
1144±526
650±358
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0.137±0.07
0.241±0.11
良性肿瘤
1046±332
676±296
0.143±0.06
0.221±0.07
恶性肿瘤
854±185
528±230
0.111±0.04
0.180±0.03
, 百拇医药
F=1.26
F=0.65
F=0.62
F=1.25
P>0.05
P>0.05
P>0.05
P>0.05
表1所示，免疫组化图像分析提示、阳性细胞数、阳性细胞面积以及面密度，数密度在正常腺体，良恶性肿瘤之间微有差别，经方差分析，均无显著性(P>0.05)表明观察方法和手段在三组中是一致的。
正常腺体，良性肿瘤，恶性肿瘤p21蛋白表达免疫组比PU值示表2。表2 p21蛋白表达图像PU值比较
, 百拇医药
组数
q值
P
1.正常腺体
4.531±2.963
1与2
29.17
<0.01
2.良性肿瘤
12.00±2.246
1与3
44.99
<0.01
, 百拇医药
3.恶性肿瘤
16.05±3.663
2与3
15.82
<0.01
F=31.43 P<0.01
表2所示，p21蛋白表达PU值在恶性肿瘤中最高，良性肿瘤次之，正常腺体最低，经方差分析及q检验，三组之间具有高度显著性差异(P<0.01)，按PU值等级分析，恶性肿瘤阳性以上占90%，弱阳性以下占10%，良性肿瘤阳性以上占75%，弱阳性以下占25%，正常腺体阳性以上占20%，弱阳性以下占80%。镜下所见，p21蛋白主要在胞浆内表达，亦可见胞核表达。其表达部位主要在腺管样区腺泡，其次为肌上使团块区，鳞状化生区及粘液软骨样区的阳性表达。部分恶性肿瘤浸润至瘤旁腺泡p21蛋白分别为强阳性和弱阳性表达。良恶性肿瘤区域内淋巴结呈阴性表达。
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涎腺肿瘤发生，部位，包膜不同情况p21表达(表3)。
表3 涎腺肿瘤发生部位包膜情况p21表达比较(PU值)
t
P
原 发
10.73±3.40
2.611
<0.05
复 发
15.59±3.76
, http://www.100md.com
浅 叶
10.96±3.73
2.021
<0.05
深 叶
15.77±4.69
完 整
10.89±3.64
3.227
<0.01
不完整
16.18±3.55
, 百拇医药 表3所示，复发性腮腺深叶包膜不完整者p21蛋白PU值高于原发性腮腺浅叶包膜完整者(P<0.05)(图1～4)。
图1 腮腺多形性腺瘤腺泡，腺管，鳞状化生及粘液软骨样区均可见p21阳性表达 LSAB法 ×100
图2 腮腺多形性腺瘤恶变大部分腺泡区p21呈阳性表达 LSAB法 ×400
图3 腮腺腺样囊性癌可见p21强阳性表达以腺管样区腺泡阳性表达最为明显 LSAB法 ×100
, 百拇医药
图4 腮腺腺样囊性癌可见P21强阳性表达 LSAB法 ×400
讨 论
有关ras p21蛋白在涎腺肿瘤中表达的报道不多，本研究结果显示①涎腺组织、良性肿瘤、恶性肿瘤中均有p21蛋白表达，图像统计及方差分析表明三组之间PU值有显著性差异(P<0.01)，良恶性肿瘤组p21蛋白阳性表达明显高于正常组。②涎腺良恶性肿瘤细胞胞浆p21蛋白表达明显强于(或多于)细胞核的表达，亦可见部分区域呈强阳性表达，部分区域呈弱阳性甚至阴性表达。③涎腺肿瘤p21蛋白阳性表达特征主要在腺管样区，亦可见其他区域。④部分恶性肿瘤及瘤旁腺泡p21蛋白分别为强阳性和弱阳性表达的征象。⑤良恶性肿瘤区域内淋巴结呈阴性表达。⑥无论良恶性肿瘤，其复发性腮腺深叶包膜不完整的肿瘤，PU值高于原发性腮腺浅叶包膜完整的肿瘤(P<0.05)。
, 百拇医药 关于涎腺多形性瘤ras p21的表达率在24～100之间〔3，4〕。王洁等〔5〕的表达率为78%，本文良性肿瘤阳性以上表达率为75%，与之接近。提示ras基因的激活在很大程度上参与了多形性腺瘤的发生和发展，我们推测ras p21癌基因在肿瘤细胞生长增殖过程中起着重要的调控作用。
(致谢本研究承蒙同济医院实验中心赵西平及病理学教研室周晟协助。)
参考文献
1 Viola MV. Fromowitz F,Oravez S et al. Expression of ras oncogene p21 in prostate cancer. New England J Medicine. 1986;314:133.
2 Hand PH, Vilasi V, Thor A et al. Quantitation of Havey ras p21 enhanced expression in human breast and colon carcinomas. J Natl cancer Inst, 1987;79:59.
, 百拇医药
3 Deguchi H, Hamano H, Hayashi Y c-myc, ras p21 and p53 expression in pleomorphic adenoma and its malignant form of the human salivary glands. Acta Pathol Jpn. 1993;43:413.
4 Okutsu S, Takeda A, Suzuki T et al. Expression of ras p21 and ras gene alteration in pleomorphic adenomas. J Nihon Univ Sch Dent 1993;35:200.
5 王洁，董福生，王小玲等，ras p21 与P53在涎腺多形性腺瘤中表达的定量研究.中华口腔医学杂志1997；23：208.
(收稿：1999—02—05), http://www.100md.com