灵芝深层发酵产物中四环三萜酸定性分析
作者：李平作* 夏结红 章克昌
单位：无锡轻工业大学生物工程学院 214036
关键词：灵芝；四环三萜酸；紫外光谱；抑菌实验
灵芝深层发酵产物中四环三萜酸定性分析 摘 要 以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂，以硫酸-甲醇(1∶1)为显色剂，通过硅胶薄层层析法由灵芝发酵产物中分离得到3种四环三萜酸，命名为M1、M2和M3，其Rf值分别为0.56，0.49，0.17。并对这3种物质的紫外光谱特性进行了研究。抗菌实验显示3种四环三萜酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长的活性。
灵芝中四环三萜类化合物是近年来发现的灵芝中另外一类具有明显药理活性的化合物。在化学结构上属于四环三萜类化合物，具有护肝和排毒[1]、降血压[2]、降胆固醇[3]等作用。灵芝中四环三萜首先由Kubota[4]等从灵芝G. lucidum的子实体中得到；此后Nishitoba[5]和Hirotani[6]等作了较多的研究报道；国内这方面的研究起步较晚，陈若芸[7]在他们的综述中论及灵芝中四环三萜酸的研究进展；王芳生等[8]报道了赤芝子实体中四环三萜进行了较深入的研究[9]。笔者报道了灵芝四环三萜酸的定性分析方法、紫外光谱特征及抑菌活性。
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1 材料和方法
1.1 材料：试剂均为分析纯；硅胶(层析用)300 目，青岛海洋化工厂；薄层板5×20 cm，自制；753 W紫外分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 灵芝发酵产物中四环三萜酸的提取[6]：发酵液经真空浓缩至原体积的1/5，过滤后，用水饱和正丁醇提取3 次，合并正丁醇提取液，后减压浓缩至干，残渣溶于适量的甲醇中，即为粗四环三萜酸。
1.2.2 深层发酵：25 L发酵罐中培养基体积125 L，发酵温度30℃，通风量1∶0.75，搅拌转速180 r/min，接种量1 L，起始pH 5.5，发酵96 h。
1.2.3 抑菌实验-滤纸透明圈法[10]：①上层培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖5，NaCl 5，琼脂18，pH 7.2。下层培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5，琼脂20，pH 7.2。
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②抑菌效果评价：接种细菌浓度为107 CFU/mL，灵芝酸浓度50 mg/L。抑菌圈直径5～6 mm为+，7～10 mm为++，抑菌圈不明显为-。
2 结果与讨论
2.1 灵芝中四环三萜酸薄层定性分析：利用薄层层析法进行中草药有效成分的定性分析至今仍是一种常规的检测方法。在运用该方法时首先要确定的是采用何种展开剂。我们选择4种展开剂进行实验，结果见表1。
表1 不同展开剂条件下四环三萜酸的Rf值
系统1
系统2
系统3
系统4
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代号
0.26
0.28
0.70
0.56
M1
0.62
0.65
0.67
0.49
M2
0.12
0.15
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0.55
0.17
M1
系统1-正己烷-乙酸乙酯(1∶1)
系统2-正己烷-乙酸乙酯：乙醚(1∶1∶1)
系统3-氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9∶1∶1)
系统4-甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)
显色剂：硫酸-甲醇(1∶1)溶液
由表1中可以看出，4种展开系统都有3个明显斑点，它们的Rf值在0.15～0.70之间。由于展开剂的极性不同，使得各物质的Rf值不同。以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂时，由于加入少量乙酸，使得分离结果非常理想。因此我们选择系统4为展开剂。
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显色剂的选择：分别以三氯乙酸和硫酸-甲醇为显色剂进行实验，前者皆显黄色，加热时间长且灵敏度不高。以硫酸-甲醇(1∶1)为显色剂时，加热时间短，显色速度快，120℃加热15～20 min即显色。而且以硫酸-甲醇为显色剂时，还可以判别三萜酸基本结构的饱和与不饱和情况[10]。在实验中我们观察到M1(Rf=0.56)和M2(Rf=0.49)先显亮红色，然后变为紫色；M3(Rf=0.17)则由橙色变为紫色，这表明三种灵芝中四环三萜酸都具有不饱和特性，否则呈黄色并逐渐褪色。因此我们选择硫酸-甲醇=1∶1为显色剂，图1是以系统4为展开剂时灵芝中四环三萜酸的薄层层析图谱。
图1 灵芝四环三萜酸的薄层层析图谱
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2.2 灵芝中四环三萜酸的紫外光谱特征：由于灵芝中四环三萜酸中含有共轭体系，因而通常在紫外区有吸收峰。将分离的3种四环三萜酸在紫外区进行吸收扫描，得到如下的谱图(图2)。
从图2中可以看出，3种四环三萜酸在220～260 nm中都有不同程度的吸收峰，已有的文献报道[7]也证明灵芝中四环三萜酸在此范围内有明显的吸收。由图2可以看出M1的最大紫外吸收峰在254 nm左右；M2的最大吸收峰在243 nm左右；M3的最大吸收峰在224 nm左右。
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图2 M1、M2、M3紫外光谱图
2.3 灵芝中四环三萜酸的抗菌活性：通过滤纸透明圈法检测了灵芝酸对不同微生物的抑菌活性。结果见表2。
表2 灵芝酸的抑菌作用
肠炎杆菌
产气杆菌
金黄色
葡萄球菌
大肠杆菌
枯草杆菌
M1
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++
++
++
++
+
M2
+
++
+
++
-
M3
++
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+
+
++
-
3 小结
3.1 确定了灵芝中四环三萜酸的硅胶薄层定性分析法，适宜的展开剂组成是甲苯-乙酸乙酯-乙酸＝12∶4∶0.5；显色剂组成是硫酸-甲醇=1∶1，而且利用该显色剂可以初步判断灵芝中四环三萜酸母核上的不饱和性。分离得到的3种灵芝三萜酸的Rf值分别为0.56，0.49，0.17。
3.2 紫外吸收光谱表明，M1的最大吸收在254 nm，与有关的报道基本相一致。在C11位不存在羰基的化合物，大都有△7[8]△9[11]双键，其紫外吸收大多在237 nm，244 nm，253 nm，M2的紫外光谱特征在此范围内。而在既没有α、β不饱和酮，又没有共轭双键的化合物中，紫外吸收在λmax210 nm左右，M3有可能属于此范围。
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3.3 抗菌实验显示3种四环三萜酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长的活性。
参考文献
1 Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:2282
2 Morigiwa A, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:3025
3 Shiao M-S, et al. J Nat Prod, 1987, 50:886
4 Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982， 62:611
5 Nishitoba T, et al. Agr Biol Chem, 1984, 48:2905
, 百拇医药
6 Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull， 1986, 34:2282
7 陈若芸，等.药学学报，1990，25(12)：940
8 王芳生，等.药学学报，1997，32(6)：447
9 李平作.无锡轻工大学博士论文，1997.12
10 钱存柔，等编.微生物学实验.北京：北京大学出版社，1985：196
11 Wall M E, et al. J Biol Chem， 1952, 198：533
收稿日期：1998-10-22, 百拇医药(李平作* 夏结红 章克昌)
单位：无锡轻工业大学生物工程学院 214036
关键词：灵芝；四环三萜酸；紫外光谱；抑菌实验
灵芝深层发酵产物中四环三萜酸定性分析 摘 要 以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂，以硫酸-甲醇(1∶1)为显色剂，通过硅胶薄层层析法由灵芝发酵产物中分离得到3种四环三萜酸，命名为M1、M2和M3，其Rf值分别为0.56，0.49，0.17。并对这3种物质的紫外光谱特性进行了研究。抗菌实验显示3种四环三萜酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长的活性。
灵芝中四环三萜类化合物是近年来发现的灵芝中另外一类具有明显药理活性的化合物。在化学结构上属于四环三萜类化合物，具有护肝和排毒[1]、降血压[2]、降胆固醇[3]等作用。灵芝中四环三萜首先由Kubota[4]等从灵芝G. lucidum的子实体中得到；此后Nishitoba[5]和Hirotani[6]等作了较多的研究报道；国内这方面的研究起步较晚，陈若芸[7]在他们的综述中论及灵芝中四环三萜酸的研究进展；王芳生等[8]报道了赤芝子实体中四环三萜进行了较深入的研究[9]。笔者报道了灵芝四环三萜酸的定性分析方法、紫外光谱特征及抑菌活性。
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1 材料和方法
1.1 材料：试剂均为分析纯；硅胶(层析用)300 目，青岛海洋化工厂；薄层板5×20 cm，自制；753 W紫外分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 灵芝发酵产物中四环三萜酸的提取[6]：发酵液经真空浓缩至原体积的1/5，过滤后，用水饱和正丁醇提取3 次，合并正丁醇提取液，后减压浓缩至干，残渣溶于适量的甲醇中，即为粗四环三萜酸。
1.2.2 深层发酵：25 L发酵罐中培养基体积125 L，发酵温度30℃，通风量1∶0.75，搅拌转速180 r/min，接种量1 L，起始pH 5.5，发酵96 h。
1.2.3 抑菌实验-滤纸透明圈法[10]：①上层培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖5，NaCl 5，琼脂18，pH 7.2。下层培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5，琼脂20，pH 7.2。
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②抑菌效果评价：接种细菌浓度为107 CFU/mL，灵芝酸浓度50 mg/L。抑菌圈直径5～6 mm为+，7～10 mm为++，抑菌圈不明显为-。
2 结果与讨论
2.1 灵芝中四环三萜酸薄层定性分析：利用薄层层析法进行中草药有效成分的定性分析至今仍是一种常规的检测方法。在运用该方法时首先要确定的是采用何种展开剂。我们选择4种展开剂进行实验，结果见表1。
表1 不同展开剂条件下四环三萜酸的Rf值
系统1
系统2
系统3
系统4
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代号
0.26
0.28
0.70
0.56
M1
0.62
0.65
0.67
0.49
M2
0.12
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0.55
0.17
M1
系统1-正己烷-乙酸乙酯(1∶1)
系统2-正己烷-乙酸乙酯：乙醚(1∶1∶1)
系统3-氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9∶1∶1)
系统4-甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)
显色剂：硫酸-甲醇(1∶1)溶液
由表1中可以看出，4种展开系统都有3个明显斑点，它们的Rf值在0.15～0.70之间。由于展开剂的极性不同，使得各物质的Rf值不同。以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂时，由于加入少量乙酸，使得分离结果非常理想。因此我们选择系统4为展开剂。
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显色剂的选择：分别以三氯乙酸和硫酸-甲醇为显色剂进行实验，前者皆显黄色，加热时间长且灵敏度不高。以硫酸-甲醇(1∶1)为显色剂时，加热时间短，显色速度快，120℃加热15～20 min即显色。而且以硫酸-甲醇为显色剂时，还可以判别三萜酸基本结构的饱和与不饱和情况[10]。在实验中我们观察到M1(Rf=0.56)和M2(Rf=0.49)先显亮红色，然后变为紫色；M3(Rf=0.17)则由橙色变为紫色，这表明三种灵芝中四环三萜酸都具有不饱和特性，否则呈黄色并逐渐褪色。因此我们选择硫酸-甲醇=1∶1为显色剂，图1是以系统4为展开剂时灵芝中四环三萜酸的薄层层析图谱。
图1 灵芝四环三萜酸的薄层层析图谱
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2.2 灵芝中四环三萜酸的紫外光谱特征：由于灵芝中四环三萜酸中含有共轭体系，因而通常在紫外区有吸收峰。将分离的3种四环三萜酸在紫外区进行吸收扫描，得到如下的谱图(图2)。
从图2中可以看出，3种四环三萜酸在220～260 nm中都有不同程度的吸收峰，已有的文献报道[7]也证明灵芝中四环三萜酸在此范围内有明显的吸收。由图2可以看出M1的最大紫外吸收峰在254 nm左右；M2的最大吸收峰在243 nm左右；M3的最大吸收峰在224 nm左右。
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图2 M1、M2、M3紫外光谱图
2.3 灵芝中四环三萜酸的抗菌活性：通过滤纸透明圈法检测了灵芝酸对不同微生物的抑菌活性。结果见表2。
表2 灵芝酸的抑菌作用
肠炎杆菌
产气杆菌
金黄色
葡萄球菌
大肠杆菌
枯草杆菌
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3.1 确定了灵芝中四环三萜酸的硅胶薄层定性分析法，适宜的展开剂组成是甲苯-乙酸乙酯-乙酸＝12∶4∶0.5；显色剂组成是硫酸-甲醇=1∶1，而且利用该显色剂可以初步判断灵芝中四环三萜酸母核上的不饱和性。分离得到的3种灵芝三萜酸的Rf值分别为0.56，0.49，0.17。
3.2 紫外吸收光谱表明，M1的最大吸收在254 nm，与有关的报道基本相一致。在C11位不存在羰基的化合物，大都有△7[8]△9[11]双键，其紫外吸收大多在237 nm，244 nm，253 nm，M2的紫外光谱特征在此范围内。而在既没有α、β不饱和酮，又没有共轭双键的化合物中，紫外吸收在λmax210 nm左右，M3有可能属于此范围。
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3.3 抗菌实验显示3种四环三萜酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长的活性。
参考文献
1 Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:2282
2 Morigiwa A, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:3025
3 Shiao M-S, et al. J Nat Prod, 1987, 50:886
4 Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982， 62:611
5 Nishitoba T, et al. Agr Biol Chem, 1984, 48:2905
, 百拇医药
6 Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull， 1986, 34:2282
7 陈若芸，等.药学学报，1990，25(12)：940
8 王芳生，等.药学学报，1997，32(6)：447
9 李平作.无锡轻工大学博士论文，1997.12
10 钱存柔，等编.微生物学实验.北京：北京大学出版社，1985：196
11 Wall M E, et al. J Biol Chem， 1952, 198：533
收稿日期：1998-10-22, 百拇医药(李平作* 夏结红 章克昌)