α-双炔失碳酯等对Swarm大鼠软骨肉瘤在小鼠肾囊膜下生长的抑制作用
作者：马仲才 何庚华 张周 胥彬
单位：马仲才 何庚华 张周 胥彬(中国科学院上海药物研究所 上海 200031)
关键词：软骨肉瘤；α-双炔失碳酯；维甲酸；细胞分化
肿瘤000401 摘要：目的 研究双炔失碳酯(ANO)及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲酸(ATRA)对Swarm大鼠软骨肉瘤(SRCS)体内外生长的影响和机制。方法 观察药物SRCS在小鼠肾囊腺下体内生长的影响；von Kossa法观察药物治疗对SRCS中钙盐沉积的作用；用台盼蓝排染法观察了药物对SRCS细胞体外生长的影响；以对硝基苯酚磷酸酯为底物研究药物对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响；用邻甲酚酞络合酮比色法测定SRCS细胞中的钙含量。结果 几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下体内生长均有程度不一的抑制作用，α-ANO在20 mg/kg剂量下的生长抑制率为79.4 %；CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96 h对SRCS细胞体外生长的IC50分别为0.45、1.47、115.2、161.7和241.5 μmol/L；α-ANO和ATRA在体内可引起SRCS中出现钙盐沉积；在体外作用96 h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙含量显著性升高；而CDDP和TAM无上述现象。结论 α-ANO和ATRA抑制SRCS生长与其诱导SRCS向成骨化方向分化有关，提示诱导分化治疗可能为临床治疗软骨肉瘤的新的有效途径。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-361；R738.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0237-04
INHIBITORY EFFECT OF α-ANORDRIN AND OTHER DRUGS ON THE GROWTH OF SWARM RAT CHONDROSARCOMA IMPLANTED INTO SUBRENAL CAPSULES OF MICE
MA Zhong-cai
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
HE Geng-hua
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
ZHANG Zhou, et al.
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
Abstract：Objective To study the influence of anordrin (ANO)，α-ANO, tamoxifen (TAM)，cisplatin (CDDP) and all-trans retinoic acid(ATRA) on the growth of Swarm rat chondrosarcoma (SRCS). Methods Effects of drugs on the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice were studied in vivo. Calcium deposits in SRCS were revealed by von Kossa staining. Trypan-blue exclusion method was used for examining the growth condition of SRCS cells cultured in vitro. The alterations of alkaline phosphatase (ALPase) activity of SRCS cells were observed with p-nitrophenyl phosphate as substrate. o-Cresolphthalein complexone colorimetry was employed to study the calcium content of SRCS cells. Results The tested drugs could inhibit the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice at different degrees, and α-ANO caused 79.4% inhibition at the dosage 20 mg/kg. The IC50 of CDDP,ATRA,TAM, α-ANO and ANO for SRCS cells after 96 h treatment wree 0.45, 1.47, 115.2, 161.7 and 241.5 μmol/L respectively. Calcium deposits were observed in SRCS treated by α-ANO and ATRA in vivo. α-ANO and ATRA also induced a significant elevation of ALPase activity and calcium content in SRCS cells in vitro for 96 h treatment. These phenomena were not observed in SRCS treated by CDDP and TAM. Conclusion Inducing SRCS toward differentiation and ossification was involved in the growth inhibition of SRCS caused by α-ANO and ATRA, but not by CDDP and TAM. The differentiation-induction may be a new approach for clinical therapy of chondrosarcoma.
, 百拇医药
Key words： Chodrosarcoma; α-Anordrin; Tretinoin; Cell differentiation
Swarm大鼠软骨肉瘤(Swarm rat chondrosarcoma,SRCS)由一18个月的雌性Sprague-Dawley大鼠中形成的自发肿瘤经连续传代分离建株而成[1]，参照O′Neal氏软骨肉瘤分级标准[2]，SRCS属2级恶性程度较高的一种，可以作为研究人软骨肉瘤的一个良好实验模型。
双炔失碳酯(Anordrin，ANO)是一种A环失碳的雄甾烷衍生物，对雌激素有部分拮抗活性，作为抗着床避孕药已被广泛应用。1989年本实验室首先发现它具有抗肿瘤活性，并且该活性主要来自其α异构体[3]。
本文观察了ANO及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲维(ATRA)等药物对SRCS在小鼠肾囊膜下和体外生长的影响，并对几种药物抑制SRCS生长的机制作了初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
一、瘤株
SRCS从中国医科院药物研究所引种。Wistar大鼠皮下接种，每6周传代1次。
二、药物与主要试剂
ANO，上海第十九制药厂生产，α-ANO由本所植化室用氧化铝低压层析法分离制备；CDDP，齐鲁制药厂生产；ATRA、Ⅱ型胶原酶，Sigma产品；TAM，上海华联制药厂生产；胰蛋白酶，Serva产品；DMEM培养基，GIBCO产品；小牛血清，华东理工大学产品；对硝基苯酚磷酸酯(p-NP)，Merck产品；邻甲酚酞络合酮，上海第三试剂厂产品。
三、动物
昆明种小鼠23～25 g，雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。
, 百拇医药
四、方法
1.小鼠肾囊膜下移植SRCS及药物治疗[4]
实验前1天小鼠腹腔注射环磷酰胺(150 mg/kg)作免疫抑制。选取生长4周的SRCS，在DMEM(含15%小牛血清)中无菌条件下剪成均匀的2 mm3左右大小的瘤块备用。小鼠先用水合氯醛麻醉，从背部暴露肾脏，用16号穿刺针将瘤块移植到肾囊膜下，然后把肾脏复位，缝合切口，随机分组，第2天开始给药，剂量和给药途径见表1，共5天，第7天观察结果。取出荷瘤肾脏，在装有目镜测微尺的解剖镜下测量瘤块的最长径(a)和最短径(b)，理论瘤体积(mm3)=0.52ab2，肿瘤生长抑制率(%)=(1-给药组瘤体积/对照组瘤体积)×100%
2.von Kossa法观察钙盐沉积
荷瘤肾脏10%福尔马林固定，常规包埋切片。
, 百拇医药
参照文献[5]，略有改动。切片覆以5%硝酸银溶液，紫外灯下照射30～40 min，然后于5% 硫代硫酸钠水溶液中处理3～5 min，1%中性红复染数秒，中性树胶封片。
3.几种药物对SRCS细胞体外生长的影响
SRCS原代培养 在靠近边缘、无坏死和瘀血区域无菌剪取SRCS 10 g左右，去除包膜等结缔组织，剪成小块。于5% (W/V)胰蛋白酶(含等体积1 mmol/L EDTA)中37 ℃消化1 h，再用胶原酶(160 u/ml)37 ℃消化2 h，然后用100 目和400 目筛网过滤，收集滤液，用DMEM(含15%小牛血清，2 mmol/L Gln，1 μmol/L氢化可的松，15 mmol/L HEPES 洗3次，稀释到106/ml培养，台盼蓝染色证明90 % 以上为活细胞。
96孔培养板上每孔接种150 μl SRCS细胞(3×105/ml)，4 h后加入不同浓度的各种待试药物，培养4天后用台盼蓝排染法计数各组活细胞数，计算细胞生长抑制率，由Logit法计算各药物的IC50值。
, 百拇医药
4.几种药物体外对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响[6]
接种SRCS细胞(2×105/ml) 4 h后加入不同浓度的各种药物，作用96 h后收集细胞，用台盼蓝排染法计数活细胞数，然后用0.9% NaCl溶液(含0.2% Triton X-100)悬浮，0 ℃匀浆，12 000×g离心15 min，取上清与0.01 mol/L Tris-HCl反应缓冲液(pH 9.0,含0.5 mmol/L p-NP 和0.5 mmol/L MgCl2)混匀，37 ℃精确保温30 min，用0.25 %体积的1 mol/L NaOH终止反应，在410 nm处测OD值。用对硝基苯酚作标准曲线。一个酶活力单位(u)定义为37 ℃和pH 9.0条件下，以p-N为底物30 min内水解释放出1 μmol/L对基苯酚的酶量。结果以u/106细胞表示。
5.几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响
, 百拇医药
收集不同浓度的几种药物作用96 h后的SRCS细胞，用0.1 N盐酸悬浮，4 ℃过夜后1500 r/min离心5 min，取上清。用邻甲酚酞络合酮直接比色法[7]和Bradford法[8]分别测定上清中的钙浓度和蛋白质浓度，SRCS细胞中钙含量以nmol/mg蛋白表示。
6.统计学处理
实验数据以
±s表示，先作两组资料的方差齐性分析，方差齐时，用Student's t检验，方差不齐时，用Mann-Whitney检验比较均数差异的显著性。
结果
一、几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的影响
结果示于表1中。在几种药物中，CDDP和ATRA作用最强，前者在1.5 mg/kg剂量下抑瘤率为87.5%(P<0.01)，后者在20 mg/kg剂量下的抑制率为90.3%(P<0.01)。α-ANO次之，混合体ANO和TAM也有一定的抑制作用，OXL在200 mg/kg剂量下对SRCS在小鼠肾囊膜下的生长无明显影响。
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表1 几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的抑制作用 药物
剂量
(mg/kg)
给药方案
平均体重
(g,始/末)
动物数
瘤体积
(mm3，±s)
抑制率
(%)
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对照
23.5/24.7
12
32±9.4
双炔失碳酯
100
po×5
23.2/21.8
11
14±4.8
56.3
250
po×5
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23.4/20.1
10
9±4.3
71.9*
α-双炔失碳酯
10
po×5
22.8/23.1
10
15±3.2
53.1*
20
, 百拇医药
po×5
23.6/21.6
11
6.1±1.8
79.4*
顺铂
1.5
ip×5
23.3/20.4
11
4.0±1.0
87.5**
, 百拇医药
三苯氧胺
20
po×5
22.8/22.6
12
15±3.6
53.1*
全反式维甲酸
20
po×5
23.1/23.9
10
3.1±0.8
, 百拇医药
90.3**
氧代赖氨酸
200
ip×5
24.0/21.5
10
25±9.6
21.6
与对照比较，*P<0.05，**P<0.01
二、几种药物对SRCS中的钙盐沉积的作用
von Kossa法染色发现对照组SRCS中基本没有黑色颗粒，而ANO、α-ANO和ATRA治疗组SRCS中出现黑色颗粒，ATRA治疗组尤其明显，表明出现了钙盐沉积，而在OXL、TAM和CDDP治疗组中无此现象。
, 百拇医药
三、几种药物对SRCS体外生长的影响
CDDP和ATRA对SRCS细胞体外的生长抑制作用最显著，与体内结果相一致，而TAM、α-ANO和ANO的作用较弱，ANO在100 μmol/L浓度以下基本没有作用。由Logit法得CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96 h对SRCS体外生长的IC50，依次为0.45、1.47、115.2、161.7和241.5 μmol/L。
四、几种药物对SRCS细胞中ALPase活性的影响
α-ANO作用96 h，可使SRCS细胞中ALPase活性显著地升高，具有剂量依赖性，ATRA的作用较α-ANO更显著，而CDDP和TAM无此作用(见表2)。
表2 α-ANO等作用96 h对SRCS中ALPase活性的影响 药 物
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浓度
(μmol/L)
ALPase活性
(u/106细胞)
对照
0.45±0.08
α-双炔失碳酯
5
0.58±0.12
25
0.86±0.10*
125
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1.10±0.04*
全反式维甲酸
0.02
0.76±0.06*
0.1
1.21±0.07**
0.5
1.65±0.04**
三苯氧胺
10
0.50±0.09
, 百拇医药
100
0.47±0.10
顺铂
0.01
0.43±0.06
0.2
0.51±0.11
n=3，±s，与对照比较，*P<0.05，**P<0.01 五、几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响
α-ANO和ATRA作用96 h可显著地使SRCS细胞中钙水平升高，而TAM在100 μmol/L浓度下，使钙含量有所降低，但统计学处理不显著(P>0.05)，CDDP在0.2 μmol/L浓度下对SRCS细胞钙水平无明显影响(见图1)。
, 百拇医药
图1 几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响±s，n=3与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
讨论
软骨肉瘤是直源于软骨的恶性肿瘤，发病率在恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤居第二位。外科手术是临床治疗软骨肉瘤的主要手段，但由于软骨肉瘤多发生在髋骨、股骨、肩胛骨以及颅底等重要部位，手术治疗往往为保守治疗，病人最终的转移复发率和死亡率较高，所以作为全身治疗的化疗越来越受到临床上的重视。但软骨肉瘤象其他骨和软组织肿瘤一样，对许多常用的化疗药不敏感。本文应用CDDP实验治疗SRCS取得了较好的疗效，但毒副作用明显，动物体重下降，甚至有动物死亡。ATRA对SRCS的生长抑制作用也较显著，在20 mg/kg剂量下取得了90.3 %的抑制率，但无明显毒副反应。本文还首次发现α-ANO和TAM对SRCS也有一定的生长抑制作用。在体外发现，CDDP作用后，SRCS细胞大多为被台盼蓝染为蓝色的死细胞，而另外四种药物作用后则多为细胞膜完整、不被台盼蓝着色的活细胞，说明CDDP为典型的细胞毒药物，而后四种药物对于SRCS细胞应属于细胞抑制型药物。
, 百拇医药
α-NAO和ATRA作用96 h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙水平显著各项高。ALPase活性升高和钙摄取增多是软骨细胞向终末发生分化时的两种生化现象[9]，说明这两种药物引起SRCS细胞发生了分化。von Kossa法检测显示经α-ANO和ATRA治疗后的SRCA出现了钙盐沉积，更进一步证明SRCS确定向成骨化方向发生了分化，表明两者抑制SRCS生长有诱导分化机制的参与，而CDDP和TAM无上述现象。以前曾发现α-ANO能够诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化[10]，而它能诱导实体瘤发生分化这还是首次发现，值得作进一步研究。
临床治疗软骨肉瘤至今尚缺乏十分有效的方法，而本文的结果表明诱导分化治疗可以作为临床治疗该疾病的一条新途径。
基金项目：本文课题受国家自然科学基金资助(No.39770864)
作者简介：马钟才，男，博士后。
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参考文献
[1]Smith BD, Martin GR, Miller EJ, et al. Nature of the collagen synthesized by a transplanted chondrosarcoma〔J〕. Arch Biochem Biophys,1975,166:181
[2]O′Neal LW， Ackerman LV. Chondrosarcoma of bone 〔J〕. Cancer, 1952,5:551
[3]胥 彬，周佩琴，俞伟娟.双炔失碳酯的抗实验肿瘤作用研究〔J〕.肿瘤，1989，9：197
[4]卢大用，胥彬.小鼠肾囊膜下移植人肺腺癌的药敏实验研究〔J〕.中国医药工业杂志，1992，23：460
, http://www.100md.com [5]Puchtler H, Meloan SN. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction〔J〕.Histochemistry,1978,56:117
[6]Kato Y, Iwamoto M, Koike T, et al. Terminal differentiation and calcification in rabbit chondrocyte cultures grown in centrifuge tubes:regulation by transforming growth factor β and serum factors〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1988，85：9552
[7]Baginski ES, Marie SS, Clark WL, et al. Direct microdetermination of serum calcium〔J〕. Clin Chim Acta,1973,46:49
, 百拇医药
[8]Darbre A. Analytical methods〔M〕. In:Darbre A(ed). Practical Protein Chemistry: a handbook〔M〕. New Yrok:John Wiley and Sons,1986:227
[9]Kirsch T,Nah HD, Shapiro IM, et al. Regulated production of mineralization competent matrix vesicles in hypertrophic chondrocytes〔J〕. J Cell Biol,1997,137:1149
[10]胥 彬，顾 健，常美平，等.α-双炔失碳酯对HL-60细胞诱导分化的研究〔J〕.中国癌症杂志，1994，4：36
(收稿日期：1999-07-12；修回日期：1999-09-23), 百拇医药
单位：马仲才 何庚华 张周 胥彬(中国科学院上海药物研究所 上海 200031)
关键词：软骨肉瘤；α-双炔失碳酯；维甲酸；细胞分化
肿瘤000401 摘要：目的 研究双炔失碳酯(ANO)及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲酸(ATRA)对Swarm大鼠软骨肉瘤(SRCS)体内外生长的影响和机制。方法 观察药物SRCS在小鼠肾囊腺下体内生长的影响；von Kossa法观察药物治疗对SRCS中钙盐沉积的作用；用台盼蓝排染法观察了药物对SRCS细胞体外生长的影响；以对硝基苯酚磷酸酯为底物研究药物对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响；用邻甲酚酞络合酮比色法测定SRCS细胞中的钙含量。结果 几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下体内生长均有程度不一的抑制作用，α-ANO在20 mg/kg剂量下的生长抑制率为79.4 %；CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96 h对SRCS细胞体外生长的IC50分别为0.45、1.47、115.2、161.7和241.5 μmol/L；α-ANO和ATRA在体内可引起SRCS中出现钙盐沉积；在体外作用96 h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙含量显著性升高；而CDDP和TAM无上述现象。结论 α-ANO和ATRA抑制SRCS生长与其诱导SRCS向成骨化方向分化有关，提示诱导分化治疗可能为临床治疗软骨肉瘤的新的有效途径。
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中图分类号：R73-361；R738.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0237-04
INHIBITORY EFFECT OF α-ANORDRIN AND OTHER DRUGS ON THE GROWTH OF SWARM RAT CHONDROSARCOMA IMPLANTED INTO SUBRENAL CAPSULES OF MICE
MA Zhong-cai
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
HE Geng-hua
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
, 百拇医药
ZHANG Zhou, et al.
(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031, China)
Abstract：Objective To study the influence of anordrin (ANO)，α-ANO, tamoxifen (TAM)，cisplatin (CDDP) and all-trans retinoic acid(ATRA) on the growth of Swarm rat chondrosarcoma (SRCS). Methods Effects of drugs on the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice were studied in vivo. Calcium deposits in SRCS were revealed by von Kossa staining. Trypan-blue exclusion method was used for examining the growth condition of SRCS cells cultured in vitro. The alterations of alkaline phosphatase (ALPase) activity of SRCS cells were observed with p-nitrophenyl phosphate as substrate. o-Cresolphthalein complexone colorimetry was employed to study the calcium content of SRCS cells. Results The tested drugs could inhibit the growth of SRCS implanted into subrenal capsules of mice at different degrees, and α-ANO caused 79.4% inhibition at the dosage 20 mg/kg. The IC50 of CDDP,ATRA,TAM, α-ANO and ANO for SRCS cells after 96 h treatment wree 0.45, 1.47, 115.2, 161.7 and 241.5 μmol/L respectively. Calcium deposits were observed in SRCS treated by α-ANO and ATRA in vivo. α-ANO and ATRA also induced a significant elevation of ALPase activity and calcium content in SRCS cells in vitro for 96 h treatment. These phenomena were not observed in SRCS treated by CDDP and TAM. Conclusion Inducing SRCS toward differentiation and ossification was involved in the growth inhibition of SRCS caused by α-ANO and ATRA, but not by CDDP and TAM. The differentiation-induction may be a new approach for clinical therapy of chondrosarcoma.
, 百拇医药
Key words： Chodrosarcoma; α-Anordrin; Tretinoin; Cell differentiation
Swarm大鼠软骨肉瘤(Swarm rat chondrosarcoma,SRCS)由一18个月的雌性Sprague-Dawley大鼠中形成的自发肿瘤经连续传代分离建株而成[1]，参照O′Neal氏软骨肉瘤分级标准[2]，SRCS属2级恶性程度较高的一种，可以作为研究人软骨肉瘤的一个良好实验模型。
双炔失碳酯(Anordrin，ANO)是一种A环失碳的雄甾烷衍生物，对雌激素有部分拮抗活性，作为抗着床避孕药已被广泛应用。1989年本实验室首先发现它具有抗肿瘤活性，并且该活性主要来自其α异构体[3]。
本文观察了ANO及其α异构体(α-ANO)、三苯氧胺(TAM)、顺铂(CDDP)、全反式维甲维(ATRA)等药物对SRCS在小鼠肾囊膜下和体外生长的影响，并对几种药物抑制SRCS生长的机制作了初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
一、瘤株
SRCS从中国医科院药物研究所引种。Wistar大鼠皮下接种，每6周传代1次。
二、药物与主要试剂
ANO，上海第十九制药厂生产，α-ANO由本所植化室用氧化铝低压层析法分离制备；CDDP，齐鲁制药厂生产；ATRA、Ⅱ型胶原酶，Sigma产品；TAM，上海华联制药厂生产；胰蛋白酶，Serva产品；DMEM培养基，GIBCO产品；小牛血清，华东理工大学产品；对硝基苯酚磷酸酯(p-NP)，Merck产品；邻甲酚酞络合酮，上海第三试剂厂产品。
三、动物
昆明种小鼠23～25 g，雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。
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四、方法
1.小鼠肾囊膜下移植SRCS及药物治疗[4]
实验前1天小鼠腹腔注射环磷酰胺(150 mg/kg)作免疫抑制。选取生长4周的SRCS，在DMEM(含15%小牛血清)中无菌条件下剪成均匀的2 mm3左右大小的瘤块备用。小鼠先用水合氯醛麻醉，从背部暴露肾脏，用16号穿刺针将瘤块移植到肾囊膜下，然后把肾脏复位，缝合切口，随机分组，第2天开始给药，剂量和给药途径见表1，共5天，第7天观察结果。取出荷瘤肾脏，在装有目镜测微尺的解剖镜下测量瘤块的最长径(a)和最短径(b)，理论瘤体积(mm3)=0.52ab2，肿瘤生长抑制率(%)=(1-给药组瘤体积/对照组瘤体积)×100%
2.von Kossa法观察钙盐沉积
荷瘤肾脏10%福尔马林固定，常规包埋切片。
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参照文献[5]，略有改动。切片覆以5%硝酸银溶液，紫外灯下照射30～40 min，然后于5% 硫代硫酸钠水溶液中处理3～5 min，1%中性红复染数秒，中性树胶封片。
3.几种药物对SRCS细胞体外生长的影响
SRCS原代培养 在靠近边缘、无坏死和瘀血区域无菌剪取SRCS 10 g左右，去除包膜等结缔组织，剪成小块。于5% (W/V)胰蛋白酶(含等体积1 mmol/L EDTA)中37 ℃消化1 h，再用胶原酶(160 u/ml)37 ℃消化2 h，然后用100 目和400 目筛网过滤，收集滤液，用DMEM(含15%小牛血清，2 mmol/L Gln，1 μmol/L氢化可的松，15 mmol/L HEPES 洗3次，稀释到106/ml培养，台盼蓝染色证明90 % 以上为活细胞。
96孔培养板上每孔接种150 μl SRCS细胞(3×105/ml)，4 h后加入不同浓度的各种待试药物，培养4天后用台盼蓝排染法计数各组活细胞数，计算细胞生长抑制率，由Logit法计算各药物的IC50值。
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4.几种药物体外对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase)活性的影响[6]
接种SRCS细胞(2×105/ml) 4 h后加入不同浓度的各种药物，作用96 h后收集细胞，用台盼蓝排染法计数活细胞数，然后用0.9% NaCl溶液(含0.2% Triton X-100)悬浮，0 ℃匀浆，12 000×g离心15 min，取上清与0.01 mol/L Tris-HCl反应缓冲液(pH 9.0,含0.5 mmol/L p-NP 和0.5 mmol/L MgCl2)混匀，37 ℃精确保温30 min，用0.25 %体积的1 mol/L NaOH终止反应，在410 nm处测OD值。用对硝基苯酚作标准曲线。一个酶活力单位(u)定义为37 ℃和pH 9.0条件下，以p-N为底物30 min内水解释放出1 μmol/L对基苯酚的酶量。结果以u/106细胞表示。
5.几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响
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收集不同浓度的几种药物作用96 h后的SRCS细胞，用0.1 N盐酸悬浮，4 ℃过夜后1500 r/min离心5 min，取上清。用邻甲酚酞络合酮直接比色法[7]和Bradford法[8]分别测定上清中的钙浓度和蛋白质浓度，SRCS细胞中钙含量以nmol/mg蛋白表示。
6.统计学处理
实验数据以
±s表示，先作两组资料的方差齐性分析，方差齐时，用Student's t检验，方差不齐时，用Mann-Whitney检验比较均数差异的显著性。结果
一、几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的影响
结果示于表1中。在几种药物中，CDDP和ATRA作用最强，前者在1.5 mg/kg剂量下抑瘤率为87.5%(P<0.01)，后者在20 mg/kg剂量下的抑制率为90.3%(P<0.01)。α-ANO次之，混合体ANO和TAM也有一定的抑制作用，OXL在200 mg/kg剂量下对SRCS在小鼠肾囊膜下的生长无明显影响。
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表1 几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的抑制作用 药物
剂量
(mg/kg)
给药方案
平均体重
(g,始/末)
动物数
瘤体积
(mm3，
±s)抑制率
(%)
, http://www.100md.com
对照
23.5/24.7
12
32±9.4
双炔失碳酯
100
po×5
23.2/21.8
11
14±4.8
56.3
250
po×5
, http://www.100md.com
23.4/20.1
10
9±4.3
71.9*
α-双炔失碳酯
10
po×5
22.8/23.1
10
15±3.2
53.1*
20
, 百拇医药
po×5
23.6/21.6
11
6.1±1.8
79.4*
顺铂
1.5
ip×5
23.3/20.4
11
4.0±1.0
87.5**
, 百拇医药
三苯氧胺
20
po×5
22.8/22.6
12
15±3.6
53.1*
全反式维甲酸
20
po×5
23.1/23.9
10
3.1±0.8
, 百拇医药
90.3**
氧代赖氨酸
200
ip×5
24.0/21.5
10
25±9.6
21.6
与对照比较，*P<0.05，**P<0.01
二、几种药物对SRCS中的钙盐沉积的作用
von Kossa法染色发现对照组SRCS中基本没有黑色颗粒，而ANO、α-ANO和ATRA治疗组SRCS中出现黑色颗粒，ATRA治疗组尤其明显，表明出现了钙盐沉积，而在OXL、TAM和CDDP治疗组中无此现象。
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三、几种药物对SRCS体外生长的影响
CDDP和ATRA对SRCS细胞体外的生长抑制作用最显著，与体内结果相一致，而TAM、α-ANO和ANO的作用较弱，ANO在100 μmol/L浓度以下基本没有作用。由Logit法得CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96 h对SRCS体外生长的IC50，依次为0.45、1.47、115.2、161.7和241.5 μmol/L。
四、几种药物对SRCS细胞中ALPase活性的影响
α-ANO作用96 h，可使SRCS细胞中ALPase活性显著地升高，具有剂量依赖性，ATRA的作用较α-ANO更显著，而CDDP和TAM无此作用(见表2)。
表2 α-ANO等作用96 h对SRCS中ALPase活性的影响 药 物
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浓度
(μmol/L)
ALPase活性
(u/106细胞)
对照
0.45±0.08
α-双炔失碳酯
5
0.58±0.12
25
0.86±0.10*
125
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1.10±0.04*
全反式维甲酸
0.02
0.76±0.06*
0.1
1.21±0.07**
0.5
1.65±0.04**
三苯氧胺
10
0.50±0.09
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100
0.47±0.10
顺铂
0.01
0.43±0.06
0.2
0.51±0.11
n=3，
±s，与对照比较，*P<0.05，**P<0.01 五、几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响α-ANO和ATRA作用96 h可显著地使SRCS细胞中钙水平升高，而TAM在100 μmol/L浓度下，使钙含量有所降低，但统计学处理不显著(P>0.05)，CDDP在0.2 μmol/L浓度下对SRCS细胞钙水平无明显影响(见图1)。
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图1 几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响
±s，n=3与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01讨论
软骨肉瘤是直源于软骨的恶性肿瘤，发病率在恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤居第二位。外科手术是临床治疗软骨肉瘤的主要手段，但由于软骨肉瘤多发生在髋骨、股骨、肩胛骨以及颅底等重要部位，手术治疗往往为保守治疗，病人最终的转移复发率和死亡率较高，所以作为全身治疗的化疗越来越受到临床上的重视。但软骨肉瘤象其他骨和软组织肿瘤一样，对许多常用的化疗药不敏感。本文应用CDDP实验治疗SRCS取得了较好的疗效，但毒副作用明显，动物体重下降，甚至有动物死亡。ATRA对SRCS的生长抑制作用也较显著，在20 mg/kg剂量下取得了90.3 %的抑制率，但无明显毒副反应。本文还首次发现α-ANO和TAM对SRCS也有一定的生长抑制作用。在体外发现，CDDP作用后，SRCS细胞大多为被台盼蓝染为蓝色的死细胞，而另外四种药物作用后则多为细胞膜完整、不被台盼蓝着色的活细胞，说明CDDP为典型的细胞毒药物，而后四种药物对于SRCS细胞应属于细胞抑制型药物。
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α-NAO和ATRA作用96 h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙水平显著各项高。ALPase活性升高和钙摄取增多是软骨细胞向终末发生分化时的两种生化现象[9]，说明这两种药物引起SRCS细胞发生了分化。von Kossa法检测显示经α-ANO和ATRA治疗后的SRCA出现了钙盐沉积，更进一步证明SRCS确定向成骨化方向发生了分化，表明两者抑制SRCS生长有诱导分化机制的参与，而CDDP和TAM无上述现象。以前曾发现α-ANO能够诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化[10]，而它能诱导实体瘤发生分化这还是首次发现，值得作进一步研究。
临床治疗软骨肉瘤至今尚缺乏十分有效的方法，而本文的结果表明诱导分化治疗可以作为临床治疗该疾病的一条新途径。
基金项目：本文课题受国家自然科学基金资助(No.39770864)
作者简介：马钟才，男，博士后。
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参考文献
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[10]胥 彬，顾 健，常美平，等.α-双炔失碳酯对HL-60细胞诱导分化的研究〔J〕.中国癌症杂志，1994，4：36
(收稿日期：1999-07-12；修回日期：1999-09-23), 百拇医药