肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因比较*
作者：程伯鲲 徐建国
单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所
关键词：ESIEC；侵袭基因；致泻性大肠埃希氏菌
中国人兽共患病杂志990403 摘 要 目的 比较肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(Entero-SLTs-Producing and Invasive Escherichia coli,ESIEC)和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因，阐明它们之间的异同。方法 使用质粒酶切图谱分析，侵袭性基因ipaB、ipaC、ipaD的PCR和Southern blot杂交实验，以及利用EIEC 8401菌株的侵袭性大质粒酶切产物作为探针与ESIEC大质粒进行Southern blot杂交等方法。结果 发现ESIEC菌株不具有EIEC、志贺氏菌所特有的ipaB、ipaC、ipaD基因；ESIEC菌株质粒与EIEC、志贺氏菌质粒同源性很小。结论 ESIEC菌株编码侵袭力的基因与EIEC及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，证明对ESIEC的分类是正确的。
, 百拇医药
MOLECULAR COMPARISION OF INVASIVE GENE IN ENTERO-SHIGA
-LIKE-TOXIN-PRODUCING AND INVASIVE ESCHERICHIA COLI、ENTEROINVASIVE ESCHERICHIA COLI AND
SHIGELLA SPECIES
Cheng Bokun Xu Jianguo
(Department of Microbiology,Institute of Epidemiology and Microbiology,Chinese
Academy of Preventive Medicine,Beijing 102206)
, 百拇医药
ABSTRACT Aim The plasmid DNA of Entero-shiga-like-toxin producing and invasive Escherichia coli(ESIEC)was hybridized with plasmid probe of EIEC and Shigella species.So as to clarify the similarities and differents between them.Methods The invasive gene in ESIEC、EIEC and shigella Species were compared by restriction endonuclease analysis,polymerase chain reaction(PCR) and hybridization of ipaB、ipaC、ipaD genes,hybridization of the DIG-labelled enzyme-digested plasmid of EIEC 8401 strain with restriction fragments of the plasmid of ESIEC strains.Results It was proved that ESIEC strains were lack of ipaB、ipaC、ipaD genes,the key genes encoding invasiveness of EIEC and Shigella species.It was further found that the homology of plasmid DNA between ESIEC and EIEC or Shigella species was low.Conclusion Data suggested that the invasive locus of ESIEC was completely different from that of EIEC and Shigella species.The name of ESIEC as a new category of diarrheagenic E.coli was based on solid.However,some differences of restriction fragments patterns among plasmid DNA of ESIEC F171,R145,89/67 strains also need be noticed and it is possible to further clarify the ESIEC strains.
, 百拇医药
KEY WORDS ESIEC Invasive gene Diarrheagenic E.coli
根据对致泻性大肠埃希氏菌毒力因子、致病机理、临床特征及遗传控制的研究进展，目前国际上倾向于将致泻性大肠埃希氏菌分为5类，包括肠产毒性大肠埃希氏菌(Entero-toxigenic E.coli,ETEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(Entero-pathogenic E.coli,EPEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(Entero-Invasive E.coli,EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(Entero-Hemorrhagic E.coli,EHEC)和肠集聚性粘附大肠埃希氏菌(Entero-Aggregative E.coli,EAggEC)，并根据其主要毒力因子的基因结构，发展了相应的DNA探针，作为鉴定和研究手段[1]。
我国目前对致泻性大肠埃希氏菌的分离和鉴定主要依靠诊断血清。在临床腹泻病人粪便标本中，约有60%分离不出任何已知病原菌，而能分离到几乎呈纯培养的大肠埃希氏菌。这些大肠埃希氏菌由于不与ETEC、EPEC、EIEC的诊断血清发生凝集，而被认为是肠道正常大肠埃希氏菌。我们对1989～1990年北京西城区三家医院从腹泻病患者粪便标本中分离的172株所谓正常大肠埃希氏菌进行了研究，发现其中44%可鉴定为致泻性大肠埃希氏菌。其中有54株菌同时与Inv、SLT-Ⅱ或SLT-Ⅰ探针杂交，占所检菌株的31.4%。这种杂交型的大肠埃希氏菌在国际上从未见报道，我们认为可能是一类新的致泻性大肠埃希氏菌，将之命 名为肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(Entero-shiga-like-toxin-producing and Invasive E.coli,ESIEC)[2]。
, http://www.100md.com
ESIEC菌株与EIEC的特异性DNA探针呈阳性反应，对HEp-2细胞有具侵袭力，但豚鼠角膜试验为阴性。为了了解ESIEC菌株的侵袭基因与EIEC及志贺氏菌侵袭基因的关系，我们对三者的侵袭基因进行了比较。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 实验菌株：E.coli F171、R145、89/67为从腹泻病人粪便标本中分离的ESIEC菌株。SLT-Ⅱ、Inv探针阳性，对HEp-2细胞呈集聚性粘附且具侵袭力，豚鼠角膜试验阴性。对照菌株：S.flexneri 2a 301,E,coli 8401(EIEC菌株),Inv探针阳性，为本室分离并保存的参考菌株。E.coli HB101为本室保存的遗传工程受体菌。
探针菌株：pSF55,Inv探针[3]，
教授惠赠。
, 百拇医药
1.1.2 培养基 LB： NaCl 5g,蛋白胨10g，酵母粉5g，双蒸水1000ml，pH7.4。
1.1.3 试剂 地高辛标记试剂盒购自德国Boeringham Mannheim公司。内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP及其它试剂均购自华美生物工程公司。
1.1.4 引物 参照ipaB、ipaC、ipaD基因的序列设计[4]，由中科院微生物所合成。ipaB基因引物：
primer1:5′TGG AGC TCG TAT CAA GCA GTA GTT TG3′
primer2:5′CCT CTA GAC GTA ATT CAA CAC AGC′
ipaC基因引物：
, http://www.100md.com
primer1:5′ACG AAG CTT ATG TCC AAC TCT CAG G3′
primer2:5′GAC GAT ATC CTT ACA GGA AGA GCC A3′
ipaD基因引物：
primer1:5′AGA CAA TTC GAC AGC CAG TCA GAT TG3′
primer2:5′GTT TAC ATT ATG CAT GGC GCA CCT C3′
2 方法
2.1 质粒提取 采用本实验室改良的质粒DNA提取方法。具体步骤如下：1.取200ml细菌过夜培养物，离心，弃上清，悬浮于5ml溶菌酶液中(溶菌酶5mg,1M Tris pH8.0 0.1ml,0.5M EDTA 0.1ml,20%葡萄糖0.222ml，蒸馏水4.55ml)置冰上30min；2.加入10ml裂解液(10N NaOH 0.2ml,20%SDS 0.5ml,蒸馏水9.3ml)，轻轻混匀，置冰上20min；3.加入5M醋酸氨10ml，置冰上30min；4.离心，取上清并与0.6倍体积的冷异丙醇混合，置-20℃30min；5.离心，弃上清，用冷乙醇洗一次，干燥，溶DNA于TE缓冲液中。
, http://www.100md.com
2.2 DNA酶切，琼脂糖凝胶电泳 按文献[5]进行。按厂家提供的酶切条件将质粒DNA在37℃酶切1h，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.3 PCR技术 按文献[5]进行。
2.4 探针的制备 Inv探针菌株pSF55提取质粒后，用HindⅢ酶切，然后用Gene Clean kit回收2.5kb片段，操作方法按Gene Clean kit说明书进行。
ipaB、ipaC、ipaD的PCR产物用WizardTMPCR preps DNA purification system进行纯化，操作方法按说明书进行。
EIEC 8401菌株提取大质粒后，用HindⅢ酶切。
2.5 探针的标记 地高辛标记参照Boenringer Mannheim公司DIG标记及检测试剂盒说明书进行。
, http://www.100md.com
2.6 Southern blot杂交 参照Boenringer Mannheim公司DIG标记及检测试剂盒说明书进行。
3 结果
3.1 ESIEC菌株与Shigella flexneri 2a 301及EIEC菌株8401大质粒同源性的比较 所有ESIEC菌株都具有一个或二至三个大质粒，我们用本实验室改良的质粒提取方法提取ESIEC菌株的大质粒发现，ESIEC菌株F171、89/67、R145均具有一个大质粒，其分子量比S.flexneri 2a 301 及EIEC菌株8401的230kb大质粒分子量稍小。从ESIEC菌株F171、EIEC菌株8401、Shigella flexneri 2a 301菌株的大质粒的HindⅢ及SalⅠ酶切图谱上可以看出，EIEC菌株8401及Shigella flexneri 2a 301的DNA带型分布比较相似，存在较小的差异；而ESIEC菌株F171的DNA带型分布与EIEC菌株8401及Shigella flexneri 2a 301有明显差别，但也存在一些分子量相同的条带。从ESIEC菌株F171、89/67、R145大质粒SalⅠ酶切图谱上可以看出，三者之间并不完全相同，ESIEC菌株89/67与ESIE菌株R145的带型分布更为相近。这3株ESIEC菌株之间，及与Shigella flexneri 2a 301和EIEC菌株8401都有一些分子量相同的DNA条带。
, 百拇医药
为了进一步比较ESIEC、EIEC及S.flexneri 2a大质粒的同源性，以EIEC菌株8401全质粒HindⅢ酶切产物做为探针，用DIG标记，与S.flexneri 2a 301, EIEC菌株8401、ESIEC菌株F171、89/67、R145大质粒的SalⅠ酶切产物进行Southern杂交，结果显示，ESIEC菌株F171与EIEC菌株8401全质粒HindⅢ酶切产物探针呈阳性反应的条带较多，且有与Shigella flexneri 2a 301及EIEC菌株8401分子量相同的带型。ESIEC菌株89/67、R145与EIEC菌株8401探针的反应较弱，但也有分子量相同DNA带。
上述结果提示：(i)ESIEC菌株F171、R145、89/67菌株的大质粒上存在着EIEC菌株8401、S.flexneri 301大质粒的同源序列；(ii)ESIEC菌株的质粒DNA酶切片段并不一致，有可能进一步分为2个或多个亚类。
3.2 ESIEC菌株与EIEC的特异性DNA探针的反应 用原位杂交的方法，我们发现ESIEC 株与EIEC Inv特异性探针呈阳性反应，为进一步证实上述结果，用DIG标记的pSF55的2.5kb HindⅢ酶切片段做为探针，与SalⅠ酶切的ESIEC菌株F171大质粒进行Southern blot杂交，结果显示S.flexneri 2a 301、EIEC菌株8401及ESIEC菌株F171均与该探针有特异性反应条带，而阴性对照pHC79 及pBR322载体质粒不与探针反应。
, http://www.100md.com
3.3 ipaB、ipaC、ipaD基因的检测 根据S.flexneri 2a及EIEC的ipaB、ipaC、ipaD基因的序列，设计了三对引物，进行PCR，结果表明阳性对照S.flexneri 2a 301菌株和EIEC菌株8401含有1.9kb的ipaB基因，1.23kb的ipaC基因及1.27kb的ipaD基因。而ESIEC菌株F171不含ipaB、ipaC、ipaD基因。为了进一步证实上述结果，将PCR合成的S.flexneri 2a 301的ipaB、ipaC、ipaD基因纯化，用DIG标记做为探针，与ESIEC菌株大质粒的HindⅢ及SalⅠ酶切产物进行Southern杂交，结果阳性对照S.flexneri 2a 301及EIEC菌株8401与三种探针均有特异性反应带，而ESIEC菌株都为阴性。
上述结果提示：ESIEC与EIEC及S.flexneri 2a菌株编码侵袭的基因不同，不具有编码侵袭性外膜蛋白的ipaB、ipaC、ipaD基因。
, http://www.100md.com 4 讨论
人类对大肠埃希氏菌的认识经历了一个漫长的过程，Escherich于1885年首先描述了大肠埃希氏菌，1945年Bray首先分离到致病性大肠埃希氏菌(EPEC)，继1967年Sakazaki等发现了侵袭性大肠埃希氏菌后，于1983年和1987年又相继发现了出血性大肠埃希氏菌和集聚性粘附大肠埃希氏菌。随着分子生物学技术的不断发展和应用，人们对致泻性大肠埃希氏菌毒力因子，致病机理及其遗传控制的认识也在不断深入。我们实验室通过对我国北京市西城区腹泻病人粪便标本中分离的大肠埃希氏菌的研究，发现了国际上尚未见报道的一类新的杂交型的大肠埃希氏菌，并将之命名为产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(ESIEC)[2]，ESIEC可能是一类新的致泻性大肠埃希氏菌。
ESIEC的命名依据是它与Inv探针及SLT-Ⅱ或SLT-Ⅰ探针同时杂交。我们的研究发现，ESIEC菌株F171的大质粒编码一种Ⅳ型菌毛EF/I，介导F171菌株对HEp-2细胞的集聚性粘附，但是，ESIEC菌株不与EAggEC的特异性探针反应。EF/I菌毛的亚单位分子量为19kDa,ESIEC菌株F171产生SLT-Ⅱ样毒素，其基因位于噬菌体上。经腹腔攻击后，ESIEC可引起实验动物发生腹泻，志愿者实验发现ESIEC菌株F171能在成人志愿者中引起典型腹泻症状[6]。ESIEC菌株在我们所检测的菌株中的分离率为31.4%，说明在我国它可能是一类比其它致泻性大肠埃希氏菌分离率更高的腹泻病原。
, http://www.100md.com
我们以前的研究工作已用原位杂交的方法证明ESIEC菌株与Inv探针呈阳性反应，且对HEp-2细胞具有侵袭力，为了进一步研究ESIEC菌株的侵袭力，我们提取了ESIEC菌株F171、R145、89/67及EIEC菌株8401、S.flexneri 2a 301的大质粒，用SalⅠ及HindⅢ分别酶切，比较了它们酶切后DNA片段的带型分布，并用DIG标记HindⅢ酶切的EIEC菌株8401全质粒作为探针进行了Southern blot杂交，结果发现ESIEC菌株大质粒与EIEC菌株8401及S.flexneri 2a 301菌株的大质粒具有同源性。而且我们还发现ESIEC菌株F171大质粒与EIEC菌株8014及S.flexneri 2a 301的大质粒的同源性高于ESIEC菌株R145和89/67,而ESIEC菌株R145和89/67的带型分布比较相近。结果提示，我们分离的ESIEC菌株的质粒DNA并不完全相同，有可能进一步分为若干亚类。
侵袭基因(Inv)探针是志贺氏菌和EIEC菌株所特异的，该探针来源于EIEC侵袭性大质粒的ial基因，为侵袭性外膜蛋白IpaB、IpaC、IpaD分泌相关的基因。我们的实验用Southernblot杂交的方法证实ESIEC菌株的大质粒与该探针有特异性反应带，提示我们ESIEC菌株的大质粒与EIEC及志贺氏菌侵袭性大质粒的亲缘关系。然而，我们的实验又证实ESIC菌株的大质粒不具有在EIEC及志贺氏菌侵袭过程中起重要作用的ipaB、ipaC、ipaD基因，说明ESIEC菌株编码侵袭力的基因与EIEC及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，ESIEC侵袭的机制与EIEC及志贺氏菌的侵袭机制是不同的。
, 百拇医药
侵袭力是肠道病原菌的重要毒力因子之一。随着分子生物学技术的不断发展，很多原来没有发现具有侵袭力的肠道病原菌的侵袭力被揭示出来。比如EPEC和ETEC过去都被认为是不具有侵袭力的[1]，近年来不但证实了它们对宿主上皮细胞的侵袭力，而且对编码侵袭力的基因进行了分析[7，8]。也有报道认为EHEC及EAggEC菌株对宿主上皮细胞具有侵袭力[9，10]。我们推测，虽然在不同的病原菌中编码侵袭的基因可能不同，不同细菌的侵袭力在致病机理中的作用也可能不同，但侵袭力是肠道致病菌共有的逃避宿主的清除作用及免疫系统的防御反应的一种策略，它有助于病原菌更好地在被感染的宿主体内定居并发挥其他毒力因子的作用，最终导致疾病的发生。
本研究为杰出青年基金资助项目
参考文献
1.Levine MM.Escherichia coli that cause diarrhea:enterotoxigenic,enteropathogenic,enteroinvasive,enterohemorrhagic,and enteroadherent.J Infect Dis,1987,155(1):377.
, http://www.100md.com
2.Jianguo Xu,Bokun Cheng,Yanping Wu,et al.Adherence patterns and DNA probe types of Escherichia coli isolated from diarrheal patients in China.Microbiol Immuno,1996,40(2):89.
3.Small PLC,Falkow S.Development of a DNA Probe for theVirulence Plasmid of shigella spp.and Enteroinvasive Escherichia coli.In:Microbiology-1986,American Society of Microbiology,1986,121.
4.Sasakawa C,Adler B,Tobe T,et ,al.Functional organization and nucleotide sequence of virulence Region-2 on the large virulence plasmid in shigella flexneri 2a.Molecular Microbiology,1989,3(9):1191.
, http://www.100md.com
5.Smabrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning.A laboratory Manual.2nd.Cold spring Harbor Laboratory press,1989
6.徐建国，赖心河，刘志奇等.肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(ESIEC)菌株F171志愿者实验.中华流行病学杂志，1994，15(6-A)：9.
7.Donnenberg MS and James Kaper.Enteropathogenic Escherichiacoli.Infect.Immun,1992,60(10):3953.
8.Elsinghorst EAand Dennis JK.Molecular Cloning of Epithelial Cell Invasion Determinants from Enterotoxigenic Escherichia col.Infect Immun,1992,60(6):2409.
, 百拇医药
9.Tobias AO,Barrett TJ,and Dennis JK.Some Structures and Processes of Human Epithelial Cells Involved in Uptake of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Strains.Infect Immun,1994,62(11):5142.
10.Benjamin P,Micheline F,Christine A,et al.Characterization of an Invasive Phenotype Associated with Enteroaggregative Escherichia coli.Infect Immun,1995,63(9):3417.
1998年7月28日收稿, http://www.100md.com
单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所
关键词：ESIEC；侵袭基因；致泻性大肠埃希氏菌
中国人兽共患病杂志990403 摘 要 目的 比较肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(Entero-SLTs-Producing and Invasive Escherichia coli,ESIEC)和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因，阐明它们之间的异同。方法 使用质粒酶切图谱分析，侵袭性基因ipaB、ipaC、ipaD的PCR和Southern blot杂交实验，以及利用EIEC 8401菌株的侵袭性大质粒酶切产物作为探针与ESIEC大质粒进行Southern blot杂交等方法。结果 发现ESIEC菌株不具有EIEC、志贺氏菌所特有的ipaB、ipaC、ipaD基因；ESIEC菌株质粒与EIEC、志贺氏菌质粒同源性很小。结论 ESIEC菌株编码侵袭力的基因与EIEC及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，证明对ESIEC的分类是正确的。
, 百拇医药
MOLECULAR COMPARISION OF INVASIVE GENE IN ENTERO-SHIGA
-LIKE-TOXIN-PRODUCING AND INVASIVE ESCHERICHIA COLI、ENTEROINVASIVE ESCHERICHIA COLI AND
SHIGELLA SPECIES
Cheng Bokun Xu Jianguo
(Department of Microbiology,Institute of Epidemiology and Microbiology,Chinese
Academy of Preventive Medicine,Beijing 102206)
, 百拇医药
ABSTRACT Aim The plasmid DNA of Entero-shiga-like-toxin producing and invasive Escherichia coli(ESIEC)was hybridized with plasmid probe of EIEC and Shigella species.So as to clarify the similarities and differents between them.Methods The invasive gene in ESIEC、EIEC and shigella Species were compared by restriction endonuclease analysis,polymerase chain reaction(PCR) and hybridization of ipaB、ipaC、ipaD genes,hybridization of the DIG-labelled enzyme-digested plasmid of EIEC 8401 strain with restriction fragments of the plasmid of ESIEC strains.Results It was proved that ESIEC strains were lack of ipaB、ipaC、ipaD genes,the key genes encoding invasiveness of EIEC and Shigella species.It was further found that the homology of plasmid DNA between ESIEC and EIEC or Shigella species was low.Conclusion Data suggested that the invasive locus of ESIEC was completely different from that of EIEC and Shigella species.The name of ESIEC as a new category of diarrheagenic E.coli was based on solid.However,some differences of restriction fragments patterns among plasmid DNA of ESIEC F171,R145,89/67 strains also need be noticed and it is possible to further clarify the ESIEC strains.
, 百拇医药
KEY WORDS ESIEC Invasive gene Diarrheagenic E.coli
根据对致泻性大肠埃希氏菌毒力因子、致病机理、临床特征及遗传控制的研究进展，目前国际上倾向于将致泻性大肠埃希氏菌分为5类，包括肠产毒性大肠埃希氏菌(Entero-toxigenic E.coli,ETEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(Entero-pathogenic E.coli,EPEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(Entero-Invasive E.coli,EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(Entero-Hemorrhagic E.coli,EHEC)和肠集聚性粘附大肠埃希氏菌(Entero-Aggregative E.coli,EAggEC)，并根据其主要毒力因子的基因结构，发展了相应的DNA探针，作为鉴定和研究手段[1]。
我国目前对致泻性大肠埃希氏菌的分离和鉴定主要依靠诊断血清。在临床腹泻病人粪便标本中，约有60%分离不出任何已知病原菌，而能分离到几乎呈纯培养的大肠埃希氏菌。这些大肠埃希氏菌由于不与ETEC、EPEC、EIEC的诊断血清发生凝集，而被认为是肠道正常大肠埃希氏菌。我们对1989～1990年北京西城区三家医院从腹泻病患者粪便标本中分离的172株所谓正常大肠埃希氏菌进行了研究，发现其中44%可鉴定为致泻性大肠埃希氏菌。其中有54株菌同时与Inv、SLT-Ⅱ或SLT-Ⅰ探针杂交，占所检菌株的31.4%。这种杂交型的大肠埃希氏菌在国际上从未见报道，我们认为可能是一类新的致泻性大肠埃希氏菌，将之命 名为肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(Entero-shiga-like-toxin-producing and Invasive E.coli,ESIEC)[2]。
, http://www.100md.com
ESIEC菌株与EIEC的特异性DNA探针呈阳性反应，对HEp-2细胞有具侵袭力，但豚鼠角膜试验为阴性。为了了解ESIEC菌株的侵袭基因与EIEC及志贺氏菌侵袭基因的关系，我们对三者的侵袭基因进行了比较。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 实验菌株：E.coli F171、R145、89/67为从腹泻病人粪便标本中分离的ESIEC菌株。SLT-Ⅱ、Inv探针阳性，对HEp-2细胞呈集聚性粘附且具侵袭力，豚鼠角膜试验阴性。对照菌株：S.flexneri 2a 301,E,coli 8401(EIEC菌株),Inv探针阳性，为本室分离并保存的参考菌株。E.coli HB101为本室保存的遗传工程受体菌。
探针菌株：pSF55,Inv探针[3]，
教授惠赠。, 百拇医药
1.1.2 培养基 LB： NaCl 5g,蛋白胨10g，酵母粉5g，双蒸水1000ml，pH7.4。
1.1.3 试剂 地高辛标记试剂盒购自德国Boeringham Mannheim公司。内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP及其它试剂均购自华美生物工程公司。
1.1.4 引物 参照ipaB、ipaC、ipaD基因的序列设计[4]，由中科院微生物所合成。ipaB基因引物：
primer1:5′TGG AGC TCG TAT CAA GCA GTA GTT TG3′
primer2:5′CCT CTA GAC GTA ATT CAA CAC AGC′
ipaC基因引物：
, http://www.100md.com
primer1:5′ACG AAG CTT ATG TCC AAC TCT CAG G3′
primer2:5′GAC GAT ATC CTT ACA GGA AGA GCC A3′
ipaD基因引物：
primer1:5′AGA CAA TTC GAC AGC CAG TCA GAT TG3′
primer2:5′GTT TAC ATT ATG CAT GGC GCA CCT C3′
2 方法
2.1 质粒提取 采用本实验室改良的质粒DNA提取方法。具体步骤如下：1.取200ml细菌过夜培养物，离心，弃上清，悬浮于5ml溶菌酶液中(溶菌酶5mg,1M Tris pH8.0 0.1ml,0.5M EDTA 0.1ml,20%葡萄糖0.222ml，蒸馏水4.55ml)置冰上30min；2.加入10ml裂解液(10N NaOH 0.2ml,20%SDS 0.5ml,蒸馏水9.3ml)，轻轻混匀，置冰上20min；3.加入5M醋酸氨10ml，置冰上30min；4.离心，取上清并与0.6倍体积的冷异丙醇混合，置-20℃30min；5.离心，弃上清，用冷乙醇洗一次，干燥，溶DNA于TE缓冲液中。
, http://www.100md.com
2.2 DNA酶切，琼脂糖凝胶电泳 按文献[5]进行。按厂家提供的酶切条件将质粒DNA在37℃酶切1h，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.3 PCR技术 按文献[5]进行。
2.4 探针的制备 Inv探针菌株pSF55提取质粒后，用HindⅢ酶切，然后用Gene Clean kit回收2.5kb片段，操作方法按Gene Clean kit说明书进行。
ipaB、ipaC、ipaD的PCR产物用WizardTMPCR preps DNA purification system进行纯化，操作方法按说明书进行。
EIEC 8401菌株提取大质粒后，用HindⅢ酶切。
2.5 探针的标记 地高辛标记参照Boenringer Mannheim公司DIG标记及检测试剂盒说明书进行。
, http://www.100md.com
2.6 Southern blot杂交 参照Boenringer Mannheim公司DIG标记及检测试剂盒说明书进行。
3 结果
3.1 ESIEC菌株与Shigella flexneri 2a 301及EIEC菌株8401大质粒同源性的比较 所有ESIEC菌株都具有一个或二至三个大质粒，我们用本实验室改良的质粒提取方法提取ESIEC菌株的大质粒发现，ESIEC菌株F171、89/67、R145均具有一个大质粒，其分子量比S.flexneri 2a 301 及EIEC菌株8401的230kb大质粒分子量稍小。从ESIEC菌株F171、EIEC菌株8401、Shigella flexneri 2a 301菌株的大质粒的HindⅢ及SalⅠ酶切图谱上可以看出，EIEC菌株8401及Shigella flexneri 2a 301的DNA带型分布比较相似，存在较小的差异；而ESIEC菌株F171的DNA带型分布与EIEC菌株8401及Shigella flexneri 2a 301有明显差别，但也存在一些分子量相同的条带。从ESIEC菌株F171、89/67、R145大质粒SalⅠ酶切图谱上可以看出，三者之间并不完全相同，ESIEC菌株89/67与ESIE菌株R145的带型分布更为相近。这3株ESIEC菌株之间，及与Shigella flexneri 2a 301和EIEC菌株8401都有一些分子量相同的DNA条带。
, 百拇医药
为了进一步比较ESIEC、EIEC及S.flexneri 2a大质粒的同源性，以EIEC菌株8401全质粒HindⅢ酶切产物做为探针，用DIG标记，与S.flexneri 2a 301, EIEC菌株8401、ESIEC菌株F171、89/67、R145大质粒的SalⅠ酶切产物进行Southern杂交，结果显示，ESIEC菌株F171与EIEC菌株8401全质粒HindⅢ酶切产物探针呈阳性反应的条带较多，且有与Shigella flexneri 2a 301及EIEC菌株8401分子量相同的带型。ESIEC菌株89/67、R145与EIEC菌株8401探针的反应较弱，但也有分子量相同DNA带。
上述结果提示：(i)ESIEC菌株F171、R145、89/67菌株的大质粒上存在着EIEC菌株8401、S.flexneri 301大质粒的同源序列；(ii)ESIEC菌株的质粒DNA酶切片段并不一致，有可能进一步分为2个或多个亚类。
3.2 ESIEC菌株与EIEC的特异性DNA探针的反应 用原位杂交的方法，我们发现ESIEC 株与EIEC Inv特异性探针呈阳性反应，为进一步证实上述结果，用DIG标记的pSF55的2.5kb HindⅢ酶切片段做为探针，与SalⅠ酶切的ESIEC菌株F171大质粒进行Southern blot杂交，结果显示S.flexneri 2a 301、EIEC菌株8401及ESIEC菌株F171均与该探针有特异性反应条带，而阴性对照pHC79 及pBR322载体质粒不与探针反应。
, http://www.100md.com
3.3 ipaB、ipaC、ipaD基因的检测 根据S.flexneri 2a及EIEC的ipaB、ipaC、ipaD基因的序列，设计了三对引物，进行PCR，结果表明阳性对照S.flexneri 2a 301菌株和EIEC菌株8401含有1.9kb的ipaB基因，1.23kb的ipaC基因及1.27kb的ipaD基因。而ESIEC菌株F171不含ipaB、ipaC、ipaD基因。为了进一步证实上述结果，将PCR合成的S.flexneri 2a 301的ipaB、ipaC、ipaD基因纯化，用DIG标记做为探针，与ESIEC菌株大质粒的HindⅢ及SalⅠ酶切产物进行Southern杂交，结果阳性对照S.flexneri 2a 301及EIEC菌株8401与三种探针均有特异性反应带，而ESIEC菌株都为阴性。
上述结果提示：ESIEC与EIEC及S.flexneri 2a菌株编码侵袭的基因不同，不具有编码侵袭性外膜蛋白的ipaB、ipaC、ipaD基因。
, http://www.100md.com 4 讨论
人类对大肠埃希氏菌的认识经历了一个漫长的过程，Escherich于1885年首先描述了大肠埃希氏菌，1945年Bray首先分离到致病性大肠埃希氏菌(EPEC)，继1967年Sakazaki等发现了侵袭性大肠埃希氏菌后，于1983年和1987年又相继发现了出血性大肠埃希氏菌和集聚性粘附大肠埃希氏菌。随着分子生物学技术的不断发展和应用，人们对致泻性大肠埃希氏菌毒力因子，致病机理及其遗传控制的认识也在不断深入。我们实验室通过对我国北京市西城区腹泻病人粪便标本中分离的大肠埃希氏菌的研究，发现了国际上尚未见报道的一类新的杂交型的大肠埃希氏菌，并将之命名为产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(ESIEC)[2]，ESIEC可能是一类新的致泻性大肠埃希氏菌。
ESIEC的命名依据是它与Inv探针及SLT-Ⅱ或SLT-Ⅰ探针同时杂交。我们的研究发现，ESIEC菌株F171的大质粒编码一种Ⅳ型菌毛EF/I，介导F171菌株对HEp-2细胞的集聚性粘附，但是，ESIEC菌株不与EAggEC的特异性探针反应。EF/I菌毛的亚单位分子量为19kDa,ESIEC菌株F171产生SLT-Ⅱ样毒素，其基因位于噬菌体上。经腹腔攻击后，ESIEC可引起实验动物发生腹泻，志愿者实验发现ESIEC菌株F171能在成人志愿者中引起典型腹泻症状[6]。ESIEC菌株在我们所检测的菌株中的分离率为31.4%，说明在我国它可能是一类比其它致泻性大肠埃希氏菌分离率更高的腹泻病原。
, http://www.100md.com
我们以前的研究工作已用原位杂交的方法证明ESIEC菌株与Inv探针呈阳性反应，且对HEp-2细胞具有侵袭力，为了进一步研究ESIEC菌株的侵袭力，我们提取了ESIEC菌株F171、R145、89/67及EIEC菌株8401、S.flexneri 2a 301的大质粒，用SalⅠ及HindⅢ分别酶切，比较了它们酶切后DNA片段的带型分布，并用DIG标记HindⅢ酶切的EIEC菌株8401全质粒作为探针进行了Southern blot杂交，结果发现ESIEC菌株大质粒与EIEC菌株8401及S.flexneri 2a 301菌株的大质粒具有同源性。而且我们还发现ESIEC菌株F171大质粒与EIEC菌株8014及S.flexneri 2a 301的大质粒的同源性高于ESIEC菌株R145和89/67,而ESIEC菌株R145和89/67的带型分布比较相近。结果提示，我们分离的ESIEC菌株的质粒DNA并不完全相同，有可能进一步分为若干亚类。
侵袭基因(Inv)探针是志贺氏菌和EIEC菌株所特异的，该探针来源于EIEC侵袭性大质粒的ial基因，为侵袭性外膜蛋白IpaB、IpaC、IpaD分泌相关的基因。我们的实验用Southernblot杂交的方法证实ESIEC菌株的大质粒与该探针有特异性反应带，提示我们ESIEC菌株的大质粒与EIEC及志贺氏菌侵袭性大质粒的亲缘关系。然而，我们的实验又证实ESIC菌株的大质粒不具有在EIEC及志贺氏菌侵袭过程中起重要作用的ipaB、ipaC、ipaD基因，说明ESIEC菌株编码侵袭力的基因与EIEC及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，ESIEC侵袭的机制与EIEC及志贺氏菌的侵袭机制是不同的。
, 百拇医药
侵袭力是肠道病原菌的重要毒力因子之一。随着分子生物学技术的不断发展，很多原来没有发现具有侵袭力的肠道病原菌的侵袭力被揭示出来。比如EPEC和ETEC过去都被认为是不具有侵袭力的[1]，近年来不但证实了它们对宿主上皮细胞的侵袭力，而且对编码侵袭力的基因进行了分析[7，8]。也有报道认为EHEC及EAggEC菌株对宿主上皮细胞具有侵袭力[9，10]。我们推测，虽然在不同的病原菌中编码侵袭的基因可能不同，不同细菌的侵袭力在致病机理中的作用也可能不同，但侵袭力是肠道致病菌共有的逃避宿主的清除作用及免疫系统的防御反应的一种策略，它有助于病原菌更好地在被感染的宿主体内定居并发挥其他毒力因子的作用，最终导致疾病的发生。
本研究为杰出青年基金资助项目
参考文献
1.Levine MM.Escherichia coli that cause diarrhea:enterotoxigenic,enteropathogenic,enteroinvasive,enterohemorrhagic,and enteroadherent.J Infect Dis,1987,155(1):377.
, http://www.100md.com
2.Jianguo Xu,Bokun Cheng,Yanping Wu,et al.Adherence patterns and DNA probe types of Escherichia coli isolated from diarrheal patients in China.Microbiol Immuno,1996,40(2):89.
3.Small PLC,Falkow S.Development of a DNA Probe for theVirulence Plasmid of shigella spp.and Enteroinvasive Escherichia coli.In:Microbiology-1986,American Society of Microbiology,1986,121.
4.Sasakawa C,Adler B,Tobe T,et ,al.Functional organization and nucleotide sequence of virulence Region-2 on the large virulence plasmid in shigella flexneri 2a.Molecular Microbiology,1989,3(9):1191.
, http://www.100md.com
5.Smabrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning.A laboratory Manual.2nd.Cold spring Harbor Laboratory press,1989
6.徐建国，赖心河，刘志奇等.肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌(ESIEC)菌株F171志愿者实验.中华流行病学杂志，1994，15(6-A)：9.
7.Donnenberg MS and James Kaper.Enteropathogenic Escherichiacoli.Infect.Immun,1992,60(10):3953.
8.Elsinghorst EAand Dennis JK.Molecular Cloning of Epithelial Cell Invasion Determinants from Enterotoxigenic Escherichia col.Infect Immun,1992,60(6):2409.
, 百拇医药
9.Tobias AO,Barrett TJ,and Dennis JK.Some Structures and Processes of Human Epithelial Cells Involved in Uptake of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Strains.Infect Immun,1994,62(11):5142.
10.Benjamin P,Micheline F,Christine A,et al.Characterization of an Invasive Phenotype Associated with Enteroaggregative Escherichia coli.Infect Immun,1995,63(9):3417.
1998年7月28日收稿, http://www.100md.com