超顺磁性氧化铁灌注T2WI诊断超急性脑缺血的实验研究
作者：刘松龄 张云亭 刘长宏
单位：300052 天津医科大学总医院放射科
关键词：动物，实验；脑缺血；造影剂；磁共振成像
中华放射学杂志990707 【摘要】 目的 观察国产超顺磁性氧化铁(SPIO)灌注T2WI诊断超急性期脑缺血的可行性。方法 正常大鼠5只和右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠26只，行SPIO灌注前后T2WI，后者在MCAO后40～50分钟行MR检查。MR检查后4只行墨汁灌注检查，6只在MCAO后24小时行MR复查和病理检查。SPIO-I颗粒直径20nm、SPIO-II颗粒直径6～9nm，剂量为0.6mmol/kg。采用SPIO-I做了6只、SPIO-II做了20只灌注检查。结果 在MCAO后50分钟，平扫T2WI仅37%表现右侧大脑中动脉(MCA)供血区信号稍高；两种型号的SPIO灌注后100%或80%的右侧MCA供血区呈相对高信号，与墨汁灌注检查的灌注缺损区及MCAO后24小时复查T2WI的高信号范围一致。病理检查证实右侧MCA供血区的缺血、梗死。在剂量相同情况下，SPIO-I灌注T2WI显示缺血区与非缺血区的对比度明显高于SPIO-II。结论 SPIO相当于一种阴性造影剂，国产SPIO“灌注”常规T2WI可以诊断血管闭塞50分钟的急性脑缺血，SPIO-I灌注的诊断效果优于SPIO-II。
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Experimental study on perfusion T2 weighted imaging with superparamagnetic iron oxide in hyperacute cerebral ischemia
LIU Songling, ZHANG Yunting, LIU Changhong
Department of Radiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052
【Abstract】 Objective To determine the feasibility of superparamagnetic iron oxide (SPIO) perfusion T2WI for detecting hyperacute cerebral ischemia. Methods Thirty-one rats were included. 26 rats underwent right middle cerebral artery occlusion (MCAO) by Zea Longa's method, the other 5 rats were used as normal control group. At 40～50 minutes after the procedure of MCAO, pre- and post-perfusion of SPIO T2WI were performed. SPIO-I particle diameter 20 nm, SPIO-II particle diameter 6-9 nm dose 0.6 mmol/kg i.v.(SPIO-I 6/26 rats and SPIO-II 20/26 rats) . In 6 of 26 MCAO models, T2WI was obtained 24 hours after MCAO. Results In 50 minutes after MCAO, the findings of ischemic changes were either absent or subtle (37%) on T2WI before SPIO administration, but became marked on SPIO-I perfusion T2WI (100%) and SPIO-II perfusion T2WI (80%). The relative higher signal area on SPIO perfusion T2WI corresponded exactly to the area of definite ischemia seen on the black ink perfusion pathology, and also the infarction areas on 24 hours images seen on T2WI and HE-stained brain slices. Conclusions The results suggested that SPIO perfusion T2WI has the capability of detecting early stage of cerebral ischemia within 1 hour after cerebral artery occlusion. SPIO serves as a negative contrast media in T2WI. The contrast effect of SPIO-I perfusion T2WI is better than that of SPIO-II in hyperacute cerebral ischemia.
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【Key words】 Animals, laboratory Cerebral ischemia Contrast media Magnetic resonance imaging
研究表明发病6小时内的脑梗死，对各种治疗措施的反应均较敏感，而常规T2WI诊断脑梗死需在发病6小时以后。本研究的目的是评价新型MR造影剂——超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)常规增强T2WI序列对诊断超急性期脑缺血的价值。
材料与方法
1.对比剂：SPIO由广州第一军医大学附属南方医院影像中心和广州康臣制药厂联合开发，许乙凯博士提供。2种颗粒直径的SPIO的主要理化特性见表1，目前尚处于临床前期。
表1 SPIO-I和SPIO-II的主要理化特性
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SPIO-I
SPIO-II
粒子直径
20 nm
6～9 nm
包被物
葡聚糖
葡聚糖
含铁浓度
11.2mg Fe/ml
11.2mg Fe/ml
(0.2mmol/ml)
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(0.2mmol/ml)
注：SPIO-I为粒子直径20nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II为粒子直径6～9nm的超顺磁性氧化铁
2.动物模型：Wistar雄性大鼠31只，体重280～350g，购自北京医科大学实验动物中心。右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型采用Longa等[1]的线段栓塞法制作。尼龙线直径0.26mm，插入长度距颈总动脉分歧点18～20mm。麻醉用10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射，常规于鼠尾静脉放置24G留置针。
3.MRI检查[2-4]：GE公司Signa 1.5T MR机，直径3in(1in=2.54cm)表面线圈，扫描野8cm×4cm，矩阵256×192。扫描序列：矢状定位T1WI(TR 500毫秒, TE15毫秒, 2次激励)，SPIO增强前、后鼠脑冠状面T2WI (TR3 000毫秒, TE88毫秒, 4次激励)，层厚3.0mm，间隔0.5mm。经鼠尾静脉推注SPIO 0.6mmol/kg后1～5分钟内扫描，总检查时间约10分钟。
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4.实验分组及病理检查：31只大鼠分成正常对照组5只；实验组26只(SPIO-I 6只、SPIO-II 20只)。实验组在右侧MCAO术后40～50分钟行MRI检查，其中4只在MCAO后1小时行墨汁灌注病理检查；另6只在MCAO后24小时行T2WI复查，随后处死观察胎芬蓝染色情况并行HE染色光镜检查。墨汁灌注方法为心脏注射墨汁5ml/只；胎芬蓝染色方法为在MCAO术后立即腹腔注射2%胎芬蓝7ml/kg。其余16只分入MCAO后1或2小时血管再通组，治疗后复查资料未纳入本文。
5.图像分析：采用双盲法对两种SPIO灌注前后MR图像进行脑缺血的诊断；计算SPIO-I、SPIO-II灌注前后缺血区与非缺血区信号对比噪声比(contrast-to-noise ratio，CNR)和信号下降百分率(percentage signal intensity loss，PSIL)，公式如下：
CNR=(SI缺血区-SI非缺血区)/N (N：图像噪声；SI：信号强度，signal intensity)
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PSIL=[(SI灌注后-SI灌注前)/SI灌注前]×(-100%)
统计学分析使用美国社会科学统计程序(SPSS)软件包(Windows 6.0版)，均数比较用t检验或配对t检验。统计学检验有意义标准为P<0.05。
结果
一、正常SPIO灌注前后T2WI表现
在平扫T2WI上，大鼠大脑半球皮质、基底节区、脑干及小脑呈中等SI，脑室和脑池呈显著长T2信号，皮质与基底节区可分辨。注射SPIO后T2WI示大脑半球、脑干和小脑的SI明显下降，SPIO-I灌注后的SI下降程度较SPIO-II明显。
, 百拇医药 二、MCAO后50分钟SPIO灌注前后T2WI表现
1.平扫T2WI：部分模型右侧额顶叶皮质和(或)基底节区SI较对侧稍增高或皮质增厚、边界模糊；大部分模型表现为无异常信号(图1)。双盲法评价结果，在MCAO后50分钟，平扫T2WI发现脑缺血的阳性率为37%，敏感性为39%，特异性为80%，阳性预测值为95%。
图1 大脑中动脉闭塞(MCAO)后50分钟平扫T2WI，双侧大脑半球信号强度无明显差异
2.SPIO灌注T2WI：22/26只模型(使用SPIO-I 6/6只、SPIO-II 16/20只)显示右侧大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)供血区以外的脑质SI较灌注前明显降低，而右侧MCA供血区呈相对高信号，无占位效应，其中13只灌注缺损边界清楚，显示出相当于MCA与大脑前动脉、大脑后动脉供血区的分界(图2，3)；SPIO-II灌注检查有4只表现与正常表现近似。SPIO-I灌注T2WI在MCAO后50分钟诊断急性脑缺血的阳性率为100%，敏感性、特异性和阳性预测值均为100%；而SPIO-II灌注诊断脑缺血的阳性率为80%，敏感性为89%，特异性和阳性预测值为100%。
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图2 MCAO后50分钟颗粒直径为6～9nm的超顺磁性氧化铁(SPIO-Ⅱ)
灌注T2WI，右侧大脑中动脉(MCA)供血区呈相对高信号，边界欠清(▲)
图3 MCAO后50分钟颗粒直径为20nm的超顺磁性氧化铁(SPIO-Ⅰ)
灌注T2WI，右侧MCA供血区呈明显相对高信号，边界清楚
3.SPIO-I和SPIO-II灌注T2WI的比较：SPIO-I灌注T2WI右侧MCA供血区与正常脑组织间形成的对比效果明显高于SPIO-II型，SI和CNR结果见表2。配对t检验的结果显示两型SPIO灌注后CNR均高于灌注前(tSPIO-I=6.18，P=0.025；tSPIO-II=3.30，P=0.005)；两型SPIO灌注后非缺血区SI和SPIO-II缺血区SI均低于灌注前(tSPIO-I非缺血区=15.57， P=0.004；tSPIO-II非缺血区=7.29，P=0.000，tSPIO-II缺血区=4.12，P=0.001)，而SPIO-I缺血区SI灌注前后无显著性差异(t=2.61，P=0.121)。两型SPIO灌注后CNR比较，SPIO-I型CNR高于SPIO-II型(t=4.47，P=0.000)。
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表2 MCAO后50分钟两型SPIO灌注前后SI及
CNR测量结果
例
数
测量结果(x±s)
缺血区SI
非缺血区SI
CNR
SPIO-I灌注前
6
368±18.0
335±25.3
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4.8±3.4
SPIO-I灌注后
6
357±37.5
187±16.8
25.4±7.5
SPIO-II灌注前
16
332±48.1
316±52.3
3.7±3.0
SPIO-II灌注后
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16
300±66.0
249±38.7
8.2±5.9
注：SI为信号强度；CNR为缺血区与非缺血区信号对比噪声比；SPIO-I为粒子直径20 nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II粒子直径6～9nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II灌注检查无相对高信号的模型(4只)未纳入统计
非缺血区PSIL比较，SPIO-Ⅰ平均为44%、SPIO-Ⅱ平均为23%，存在显著性差异(t=5.30，P<0.01)；而缺血区SPIO-II的PSIL为12%，反而稍高于SPIO-I的PSIL 8%，但无统计学意义。
三、MCAO后24小时复查T2WI及病理检查结果
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在MCAO后50分钟SPIO灌注检查阳性的6只模型，于MCAO后24小时复查常规T2WI中见右侧大脑半球呈显著长T2信号，范围与SPIO灌注 T2WI的相对高信号区相符，但此时出现了脑室受压、中线结构左移(图4)。
图4 MCAO后24小时平扫T2WI，右侧MCA供血区呈显著高信号，脑室受压，中线左移
4只MCAO后1小时墨汁灌注检查显示右侧MCA无墨汁进入，其供血区呈淡粉色，与SPIO灌注 T2WI的相对高信号区相一致，其余正常脑组织呈灰黑色(图5)。6只胎芬蓝染色鼠，于MCAO后24小时MR检查后处死，发现右侧MCA供血区脑质呈蓝色；石蜡切片HE染色示右侧MCA供血区染色浅淡，范围与MCAO后24小时复查T2WI的高信号区相一致(图6)。光学显微镜下见病变区脑组织水肿、神经元变性坏死。
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图5 MCAO后1小时墨汁灌注检查，右侧MCA供血区
无墨汁灌注呈淡粉色，其余脑组织均呈灰黑色
图6 MCAO后24小时全脑切片HE染色，右侧MCA供血区淡染，脑室受压，中线左移
讨论
影响急性脑梗死疗效的最关键问题之一是治疗开始时间。文献报道在局灶性缺血性脑梗死模型，常规T2WI可检出≥3小时的脑缺血灶，我们的前期实验结果显示，常规T2WI的1～3小时检出率为37.5%～60.0%[2]。但在临床T2WI检出急性脑梗死需在发病6小时甚至更长，这对目前国际上较公认的“6小时”溶栓治疗时间窗来说显得太迟。弥散加权成像(diffusion weighted imaging, DWI)可以检测到细胞内外水弥散运动的变化，是显示缺血性脑水肿的最敏感的方法，可显示脑血管闭塞仅30～60分钟(临床)，甚至2～3分钟(大鼠脑缺血动物模型)的细胞毒性水肿期的脑缺血灶的范围；但因DWI需要平面回波成像(echo-planar imaging, EPI)技术，其设备昂贵不易普及[4,5]。
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灌注MR成像是基于对比剂的磁易感性，灌注区由于T2*效应磁场均匀性破坏、加速自旋质子去相位，致SI降低；而未灌注组织呈相对高信号即灌注缺损，形成灌注区与非灌注区的SI对比[3,6,7]。血流灌注是组织发生缺血性损伤的最根本原因，也是缺血性损伤组织是否能恢复的重要原因之一。灌注成像反映的是脑微循环和大循环的状况，虽然在脑部该容积仅占脑容积的2%～5%，但灌注程度可反映组织缺血程度。在局灶性脑缺血的超急性期，缺血区水肿尚轻，与非缺血区脑组织的常规T1、T2 信号比较无明显差异；但组织的灌注程度存在显著差异，因而灌注成像可在超急性期显示缺血区范围[6-8]。一般MR灌注成像均采用快速成像序列，动态观察造影剂静脉注射后第1个循环的SI变化，通过信号强度-时间曲线计算局部脑血流变化，或通过计算机后处理获取脑血流分布图。EPI技术为灌注成像提供了极佳的时间分辨率，但设备昂贵尚不能普及。用普通MR设备的T2*梯度回波序列，如快速小角度激发成像序列(FLASH)，由于设备在时间分辨率和空间分辨率上的限度，加之常规顺磁性对比剂的半衰期短、磁敏感较低，故直接获得的灌注图像信噪比较差；而在脑梗死超急性期，常规钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)增强T1WI、 T2WI序列，均不能明显改善缺血区与非缺血区的对比度。
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SPIO属于超顺磁性对比剂，主要成分是(Fe3O4)n，表面覆盖肝素或葡聚糖等。磁易感性极高，约为顺磁性对比剂的50倍或更高，对T2的影响明显大于T1。对比效果主要依赖于氧化铁晶粒的磁学特性和分布；生物学分布取决于胶体颗粒的大小和颗粒表面的理化性质[3,6,9，10]。80年代末期研制的SPIO颗粒较大(>50nm)，静脉注射后很快被网状内皮系统识别，血循环半衰期短，主要用于肝、脾的检查；近年研制的颗粒直径约20nm的SPIO，可躲过肝脏网状内皮系统，主要分布在淋巴结，它的血循环半衰期较长，故可作血池型对比剂。有关SPIO灌注脑血流方面的研究较少，主要采用梯度回波序列[6-8]。1994年Forsting等[3]首次报道了使用常规增强方法的SPIO“灌注”T2WI诊断超急性期灶性脑缺血的实验研究。然而本实验进一步证实SPIO增强T2WI显示的缺血灶与墨汁灌注检查的灌注缺损区相同，因此可将SPIO增强T2WI称之为SPIO“灌注”T2WI。SPIO灌注T2WI的机制与灌注成像的机制相似，均为缺血区与非缺血区微循环内SPIO含量的差异。由于实验用SPIO血循环半衰期较长，磁化率极高，又不能通过血脑屏障，因此，在T2WI或T2*序列使用普通增强检查方法即可获得有应用价值的灌注成像。本实验采用线段栓塞法制作MCAO模型，首次证实国产两种型号的SPIO灌注T2WI可检出MCAO后50分钟的超急性期脑缺血。在剂量相同的前提下，颗粒直径20nm的SPIO-I灌注后的缺血灶对比效果明显优于颗粒直径6～9nm 的SPIO-II。本组SPIO-I灌注图像对比效果与Forsting等[3]实验用SPIO颗粒直径40nm、剂量0.3mmol/kg的结果相似；而SPIO-II灌注图像对比效果较差。上述结果表明颗粒较大的SPIO的磁化率高于颗粒较小者；颗粒直径20nm或40nm的SPIO更适宜作血池灌注检查。另外，本实验所用SPIO剂量0.6mmol/kg，是在预实验中获得的目测SPIO-II灌注T2WI检出急性脑缺血的最低剂量，该剂量大于文献报道(0.03～0.3mmol/kg)，这可能与SPIO颗粒直径较小及使用非快速成像序列有关，尚需进一步研究。
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灌注成像除有早期诊断脑缺血的作用，还可推测脑缺血的预后。本实验超急性期墨汁灌注和MCAO后24小时胎芬蓝染色及组织学检查证实，SPIO灌注T2WI表现与脑缺血范围一致，可以认为灌注缺损区预示了梗死范围。若按MCAO后24小时T2WI和病理结果为金标准，在MCAO后50分钟，平扫T2WI诊断脑梗死的敏感性为39%、阳性预测值95%，而阴性预测值仅11%。在SPIO灌注T2WI、T2*WI诊断急性脑缺血的动物实验中，其诊断的阳性率均为100%，且未见阴性的报道；本实验SPIO-I灌注T2WI在MCAO后50分钟诊断急性脑缺血的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值均为100%，而SPIO-II灌注检查的敏感性为89%、准确性为90%、特异性和阳性预测值为100%。说明SPIO灌注检查明显提高了超急性期脑缺血的检出率。4只SPIO-II灌注阴性模型，解剖发现2只颅内尼龙线长4mm，一般成功模型颅内尼龙线长6mm，说明SPIO灌注T2WI表现与脑缺血程度相关，可作为检验模型成功的标准，为后期实验结果的可靠性提供保证；另2只失败模型可能是由于注射SPIO时，有造影剂外漏。
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总之，SPIO相当于一种阴性造影剂。SPIO灌注T2WI检查将急性脑缺血的诊断提前到1小时之内，该方法简单，有临床实用价值，有普及可能性，并为临床急性脑梗死治疗争取了时间。
参考文献
1 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20: 84-91.
2 刘松龄, 张云亭, 崔建岭, 等. 大鼠大脑中动脉闭塞与再通模型的脑MR与病理对照研究.见: 第8届中华医学会放射学年会汇编. 1997. 98.
3 Forsting M, Reith W,Dorfler R, et al. MRI in acute cerebral ischaemia: perfusion imaging with superparamagnetic iron oxide in a rat model. Neuroradiology, 1994,36: 23-26.
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4 Minematsu K, Li L, Fisher M, et al. Diffusion-weighted magnetic resonance imaging: rapid and quantitative detection of focal brain ischemia. Neurology, 1992, 42: 235-240.
5 Jiang Q, Chopp M, Zhang ZG, et al. The temporal evolution of MRI tissue signatures after transient middle cerebral artery occlusion in rat. J Neurol Sci, 1997,145:15-23.
6 Reith W, Forsting M, Voglor H, et al. Early MR detection of experimentally induced cerebral ischemia using magnetic susceptibility contrast agents: comparison between gadopentetate dimeglumine and iron oxide particles. AJNR, 1995,16: 53-60.
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7 Haraldseth O, Jones RA, Müller TB, et al. Comparison of dysprosium DTPA BMA and superparamagnetic iron oxide particles as susceptibility contrast agents for perfusion imaging of regional cerebral ischemia in the rat. J Magn Reson Imaging, 1996, 6: 714-717.
8 Reimer P, Schuierer G, Balzer T, et al. Application of a superparamagnetic iron oxide (ResovistR) for MR imaging of human cerebral blood volume. Magn Res Med, 1995, 34: 694-697.
9 刘松龄，张云亭.钆类和氧化铁类MR对比剂在诊断急性脑梗塞中的应用(综述).国外医学临床放射学分册，1998，21：276-279.
10 Sj
gren CE, Johansson C, Naevestad A, et al. Crystal size and properties of super-paramagnetic iron oxide (SPIO) particles. Magn Reson Imaging, 1997, 15: 55-67.
收稿：1998-10-26, 百拇医药
单位：300052 天津医科大学总医院放射科
关键词：动物，实验；脑缺血；造影剂；磁共振成像
中华放射学杂志990707 【摘要】 目的 观察国产超顺磁性氧化铁(SPIO)灌注T2WI诊断超急性期脑缺血的可行性。方法 正常大鼠5只和右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠26只，行SPIO灌注前后T2WI，后者在MCAO后40～50分钟行MR检查。MR检查后4只行墨汁灌注检查，6只在MCAO后24小时行MR复查和病理检查。SPIO-I颗粒直径20nm、SPIO-II颗粒直径6～9nm，剂量为0.6mmol/kg。采用SPIO-I做了6只、SPIO-II做了20只灌注检查。结果 在MCAO后50分钟，平扫T2WI仅37%表现右侧大脑中动脉(MCA)供血区信号稍高；两种型号的SPIO灌注后100%或80%的右侧MCA供血区呈相对高信号，与墨汁灌注检查的灌注缺损区及MCAO后24小时复查T2WI的高信号范围一致。病理检查证实右侧MCA供血区的缺血、梗死。在剂量相同情况下，SPIO-I灌注T2WI显示缺血区与非缺血区的对比度明显高于SPIO-II。结论 SPIO相当于一种阴性造影剂，国产SPIO“灌注”常规T2WI可以诊断血管闭塞50分钟的急性脑缺血，SPIO-I灌注的诊断效果优于SPIO-II。
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Experimental study on perfusion T2 weighted imaging with superparamagnetic iron oxide in hyperacute cerebral ischemia
LIU Songling, ZHANG Yunting, LIU Changhong
Department of Radiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052
【Abstract】 Objective To determine the feasibility of superparamagnetic iron oxide (SPIO) perfusion T2WI for detecting hyperacute cerebral ischemia. Methods Thirty-one rats were included. 26 rats underwent right middle cerebral artery occlusion (MCAO) by Zea Longa's method, the other 5 rats were used as normal control group. At 40～50 minutes after the procedure of MCAO, pre- and post-perfusion of SPIO T2WI were performed. SPIO-I particle diameter 20 nm, SPIO-II particle diameter 6-9 nm dose 0.6 mmol/kg i.v.(SPIO-I 6/26 rats and SPIO-II 20/26 rats) . In 6 of 26 MCAO models, T2WI was obtained 24 hours after MCAO. Results In 50 minutes after MCAO, the findings of ischemic changes were either absent or subtle (37%) on T2WI before SPIO administration, but became marked on SPIO-I perfusion T2WI (100%) and SPIO-II perfusion T2WI (80%). The relative higher signal area on SPIO perfusion T2WI corresponded exactly to the area of definite ischemia seen on the black ink perfusion pathology, and also the infarction areas on 24 hours images seen on T2WI and HE-stained brain slices. Conclusions The results suggested that SPIO perfusion T2WI has the capability of detecting early stage of cerebral ischemia within 1 hour after cerebral artery occlusion. SPIO serves as a negative contrast media in T2WI. The contrast effect of SPIO-I perfusion T2WI is better than that of SPIO-II in hyperacute cerebral ischemia.
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【Key words】 Animals, laboratory Cerebral ischemia Contrast media Magnetic resonance imaging
研究表明发病6小时内的脑梗死，对各种治疗措施的反应均较敏感，而常规T2WI诊断脑梗死需在发病6小时以后。本研究的目的是评价新型MR造影剂——超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)常规增强T2WI序列对诊断超急性期脑缺血的价值。
材料与方法
1.对比剂：SPIO由广州第一军医大学附属南方医院影像中心和广州康臣制药厂联合开发，许乙凯博士提供。2种颗粒直径的SPIO的主要理化特性见表1，目前尚处于临床前期。
表1 SPIO-I和SPIO-II的主要理化特性
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SPIO-I
SPIO-II
粒子直径
20 nm
6～9 nm
包被物
葡聚糖
葡聚糖
含铁浓度
11.2mg Fe/ml
11.2mg Fe/ml
(0.2mmol/ml)
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(0.2mmol/ml)
注：SPIO-I为粒子直径20nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II为粒子直径6～9nm的超顺磁性氧化铁
2.动物模型：Wistar雄性大鼠31只，体重280～350g，购自北京医科大学实验动物中心。右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型采用Longa等[1]的线段栓塞法制作。尼龙线直径0.26mm，插入长度距颈总动脉分歧点18～20mm。麻醉用10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射，常规于鼠尾静脉放置24G留置针。
3.MRI检查[2-4]：GE公司Signa 1.5T MR机，直径3in(1in=2.54cm)表面线圈，扫描野8cm×4cm，矩阵256×192。扫描序列：矢状定位T1WI(TR 500毫秒, TE15毫秒, 2次激励)，SPIO增强前、后鼠脑冠状面T2WI (TR3 000毫秒, TE88毫秒, 4次激励)，层厚3.0mm，间隔0.5mm。经鼠尾静脉推注SPIO 0.6mmol/kg后1～5分钟内扫描，总检查时间约10分钟。
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4.实验分组及病理检查：31只大鼠分成正常对照组5只；实验组26只(SPIO-I 6只、SPIO-II 20只)。实验组在右侧MCAO术后40～50分钟行MRI检查，其中4只在MCAO后1小时行墨汁灌注病理检查；另6只在MCAO后24小时行T2WI复查，随后处死观察胎芬蓝染色情况并行HE染色光镜检查。墨汁灌注方法为心脏注射墨汁5ml/只；胎芬蓝染色方法为在MCAO术后立即腹腔注射2%胎芬蓝7ml/kg。其余16只分入MCAO后1或2小时血管再通组，治疗后复查资料未纳入本文。
5.图像分析：采用双盲法对两种SPIO灌注前后MR图像进行脑缺血的诊断；计算SPIO-I、SPIO-II灌注前后缺血区与非缺血区信号对比噪声比(contrast-to-noise ratio，CNR)和信号下降百分率(percentage signal intensity loss，PSIL)，公式如下：
CNR=(SI缺血区-SI非缺血区)/N (N：图像噪声；SI：信号强度，signal intensity)
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PSIL=[(SI灌注后-SI灌注前)/SI灌注前]×(-100%)
统计学分析使用美国社会科学统计程序(SPSS)软件包(Windows 6.0版)，均数比较用t检验或配对t检验。统计学检验有意义标准为P<0.05。
结果
一、正常SPIO灌注前后T2WI表现
在平扫T2WI上，大鼠大脑半球皮质、基底节区、脑干及小脑呈中等SI，脑室和脑池呈显著长T2信号，皮质与基底节区可分辨。注射SPIO后T2WI示大脑半球、脑干和小脑的SI明显下降，SPIO-I灌注后的SI下降程度较SPIO-II明显。
, 百拇医药 二、MCAO后50分钟SPIO灌注前后T2WI表现
1.平扫T2WI：部分模型右侧额顶叶皮质和(或)基底节区SI较对侧稍增高或皮质增厚、边界模糊；大部分模型表现为无异常信号(图1)。双盲法评价结果，在MCAO后50分钟，平扫T2WI发现脑缺血的阳性率为37%，敏感性为39%，特异性为80%，阳性预测值为95%。
图1 大脑中动脉闭塞(MCAO)后50分钟平扫T2WI，双侧大脑半球信号强度无明显差异
2.SPIO灌注T2WI：22/26只模型(使用SPIO-I 6/6只、SPIO-II 16/20只)显示右侧大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)供血区以外的脑质SI较灌注前明显降低，而右侧MCA供血区呈相对高信号，无占位效应，其中13只灌注缺损边界清楚，显示出相当于MCA与大脑前动脉、大脑后动脉供血区的分界(图2，3)；SPIO-II灌注检查有4只表现与正常表现近似。SPIO-I灌注T2WI在MCAO后50分钟诊断急性脑缺血的阳性率为100%，敏感性、特异性和阳性预测值均为100%；而SPIO-II灌注诊断脑缺血的阳性率为80%，敏感性为89%，特异性和阳性预测值为100%。
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图2 MCAO后50分钟颗粒直径为6～9nm的超顺磁性氧化铁(SPIO-Ⅱ)
灌注T2WI，右侧大脑中动脉(MCA)供血区呈相对高信号，边界欠清(▲)
图3 MCAO后50分钟颗粒直径为20nm的超顺磁性氧化铁(SPIO-Ⅰ)
灌注T2WI，右侧MCA供血区呈明显相对高信号，边界清楚
3.SPIO-I和SPIO-II灌注T2WI的比较：SPIO-I灌注T2WI右侧MCA供血区与正常脑组织间形成的对比效果明显高于SPIO-II型，SI和CNR结果见表2。配对t检验的结果显示两型SPIO灌注后CNR均高于灌注前(tSPIO-I=6.18，P=0.025；tSPIO-II=3.30，P=0.005)；两型SPIO灌注后非缺血区SI和SPIO-II缺血区SI均低于灌注前(tSPIO-I非缺血区=15.57， P=0.004；tSPIO-II非缺血区=7.29，P=0.000，tSPIO-II缺血区=4.12，P=0.001)，而SPIO-I缺血区SI灌注前后无显著性差异(t=2.61，P=0.121)。两型SPIO灌注后CNR比较，SPIO-I型CNR高于SPIO-II型(t=4.47，P=0.000)。
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表2 MCAO后50分钟两型SPIO灌注前后SI及
CNR测量结果
例
数
测量结果(x±s)
缺血区SI
非缺血区SI
CNR
SPIO-I灌注前
6
368±18.0
335±25.3
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4.8±3.4
SPIO-I灌注后
6
357±37.5
187±16.8
25.4±7.5
SPIO-II灌注前
16
332±48.1
316±52.3
3.7±3.0
SPIO-II灌注后
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16
300±66.0
249±38.7
8.2±5.9
注：SI为信号强度；CNR为缺血区与非缺血区信号对比噪声比；SPIO-I为粒子直径20 nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II粒子直径6～9nm的超顺磁性氧化铁；SPIO-II灌注检查无相对高信号的模型(4只)未纳入统计
非缺血区PSIL比较，SPIO-Ⅰ平均为44%、SPIO-Ⅱ平均为23%，存在显著性差异(t=5.30，P<0.01)；而缺血区SPIO-II的PSIL为12%，反而稍高于SPIO-I的PSIL 8%，但无统计学意义。
三、MCAO后24小时复查T2WI及病理检查结果
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在MCAO后50分钟SPIO灌注检查阳性的6只模型，于MCAO后24小时复查常规T2WI中见右侧大脑半球呈显著长T2信号，范围与SPIO灌注 T2WI的相对高信号区相符，但此时出现了脑室受压、中线结构左移(图4)。
图4 MCAO后24小时平扫T2WI，右侧MCA供血区呈显著高信号，脑室受压，中线左移
4只MCAO后1小时墨汁灌注检查显示右侧MCA无墨汁进入，其供血区呈淡粉色，与SPIO灌注 T2WI的相对高信号区相一致，其余正常脑组织呈灰黑色(图5)。6只胎芬蓝染色鼠，于MCAO后24小时MR检查后处死，发现右侧MCA供血区脑质呈蓝色；石蜡切片HE染色示右侧MCA供血区染色浅淡，范围与MCAO后24小时复查T2WI的高信号区相一致(图6)。光学显微镜下见病变区脑组织水肿、神经元变性坏死。
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图5 MCAO后1小时墨汁灌注检查，右侧MCA供血区
无墨汁灌注呈淡粉色，其余脑组织均呈灰黑色
图6 MCAO后24小时全脑切片HE染色，右侧MCA供血区淡染，脑室受压，中线左移
讨论
影响急性脑梗死疗效的最关键问题之一是治疗开始时间。文献报道在局灶性缺血性脑梗死模型，常规T2WI可检出≥3小时的脑缺血灶，我们的前期实验结果显示，常规T2WI的1～3小时检出率为37.5%～60.0%[2]。但在临床T2WI检出急性脑梗死需在发病6小时甚至更长，这对目前国际上较公认的“6小时”溶栓治疗时间窗来说显得太迟。弥散加权成像(diffusion weighted imaging, DWI)可以检测到细胞内外水弥散运动的变化，是显示缺血性脑水肿的最敏感的方法，可显示脑血管闭塞仅30～60分钟(临床)，甚至2～3分钟(大鼠脑缺血动物模型)的细胞毒性水肿期的脑缺血灶的范围；但因DWI需要平面回波成像(echo-planar imaging, EPI)技术，其设备昂贵不易普及[4,5]。
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灌注MR成像是基于对比剂的磁易感性，灌注区由于T2*效应磁场均匀性破坏、加速自旋质子去相位，致SI降低；而未灌注组织呈相对高信号即灌注缺损，形成灌注区与非灌注区的SI对比[3,6,7]。血流灌注是组织发生缺血性损伤的最根本原因，也是缺血性损伤组织是否能恢复的重要原因之一。灌注成像反映的是脑微循环和大循环的状况，虽然在脑部该容积仅占脑容积的2%～5%，但灌注程度可反映组织缺血程度。在局灶性脑缺血的超急性期，缺血区水肿尚轻，与非缺血区脑组织的常规T1、T2 信号比较无明显差异；但组织的灌注程度存在显著差异，因而灌注成像可在超急性期显示缺血区范围[6-8]。一般MR灌注成像均采用快速成像序列，动态观察造影剂静脉注射后第1个循环的SI变化，通过信号强度-时间曲线计算局部脑血流变化，或通过计算机后处理获取脑血流分布图。EPI技术为灌注成像提供了极佳的时间分辨率，但设备昂贵尚不能普及。用普通MR设备的T2*梯度回波序列，如快速小角度激发成像序列(FLASH)，由于设备在时间分辨率和空间分辨率上的限度，加之常规顺磁性对比剂的半衰期短、磁敏感较低，故直接获得的灌注图像信噪比较差；而在脑梗死超急性期，常规钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)增强T1WI、 T2WI序列，均不能明显改善缺血区与非缺血区的对比度。
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SPIO属于超顺磁性对比剂，主要成分是(Fe3O4)n，表面覆盖肝素或葡聚糖等。磁易感性极高，约为顺磁性对比剂的50倍或更高，对T2的影响明显大于T1。对比效果主要依赖于氧化铁晶粒的磁学特性和分布；生物学分布取决于胶体颗粒的大小和颗粒表面的理化性质[3,6,9，10]。80年代末期研制的SPIO颗粒较大(>50nm)，静脉注射后很快被网状内皮系统识别，血循环半衰期短，主要用于肝、脾的检查；近年研制的颗粒直径约20nm的SPIO，可躲过肝脏网状内皮系统，主要分布在淋巴结，它的血循环半衰期较长，故可作血池型对比剂。有关SPIO灌注脑血流方面的研究较少，主要采用梯度回波序列[6-8]。1994年Forsting等[3]首次报道了使用常规增强方法的SPIO“灌注”T2WI诊断超急性期灶性脑缺血的实验研究。然而本实验进一步证实SPIO增强T2WI显示的缺血灶与墨汁灌注检查的灌注缺损区相同，因此可将SPIO增强T2WI称之为SPIO“灌注”T2WI。SPIO灌注T2WI的机制与灌注成像的机制相似，均为缺血区与非缺血区微循环内SPIO含量的差异。由于实验用SPIO血循环半衰期较长，磁化率极高，又不能通过血脑屏障，因此，在T2WI或T2*序列使用普通增强检查方法即可获得有应用价值的灌注成像。本实验采用线段栓塞法制作MCAO模型，首次证实国产两种型号的SPIO灌注T2WI可检出MCAO后50分钟的超急性期脑缺血。在剂量相同的前提下，颗粒直径20nm的SPIO-I灌注后的缺血灶对比效果明显优于颗粒直径6～9nm 的SPIO-II。本组SPIO-I灌注图像对比效果与Forsting等[3]实验用SPIO颗粒直径40nm、剂量0.3mmol/kg的结果相似；而SPIO-II灌注图像对比效果较差。上述结果表明颗粒较大的SPIO的磁化率高于颗粒较小者；颗粒直径20nm或40nm的SPIO更适宜作血池灌注检查。另外，本实验所用SPIO剂量0.6mmol/kg，是在预实验中获得的目测SPIO-II灌注T2WI检出急性脑缺血的最低剂量，该剂量大于文献报道(0.03～0.3mmol/kg)，这可能与SPIO颗粒直径较小及使用非快速成像序列有关，尚需进一步研究。
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灌注成像除有早期诊断脑缺血的作用，还可推测脑缺血的预后。本实验超急性期墨汁灌注和MCAO后24小时胎芬蓝染色及组织学检查证实，SPIO灌注T2WI表现与脑缺血范围一致，可以认为灌注缺损区预示了梗死范围。若按MCAO后24小时T2WI和病理结果为金标准，在MCAO后50分钟，平扫T2WI诊断脑梗死的敏感性为39%、阳性预测值95%，而阴性预测值仅11%。在SPIO灌注T2WI、T2*WI诊断急性脑缺血的动物实验中，其诊断的阳性率均为100%，且未见阴性的报道；本实验SPIO-I灌注T2WI在MCAO后50分钟诊断急性脑缺血的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值均为100%，而SPIO-II灌注检查的敏感性为89%、准确性为90%、特异性和阳性预测值为100%。说明SPIO灌注检查明显提高了超急性期脑缺血的检出率。4只SPIO-II灌注阴性模型，解剖发现2只颅内尼龙线长4mm，一般成功模型颅内尼龙线长6mm，说明SPIO灌注T2WI表现与脑缺血程度相关，可作为检验模型成功的标准，为后期实验结果的可靠性提供保证；另2只失败模型可能是由于注射SPIO时，有造影剂外漏。
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总之，SPIO相当于一种阴性造影剂。SPIO灌注T2WI检查将急性脑缺血的诊断提前到1小时之内，该方法简单，有临床实用价值，有普及可能性，并为临床急性脑梗死治疗争取了时间。
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