补肾药对肾阳虚大鼠下丘脑组织蛋白激酶活性的影响
作者：高博 尹桂山
单位：高博(河北医科大学中西医结合基础理论研究室，河北 石家庄 050017) ；尹桂山(河北医科大学中西医结合基础理论研究室，河北 石家庄 050017)
关键词：肾阳虚； 下丘脑； 蛋白激酶； 补肾药
中国中医基础医学杂志00011 摘要：目的：研究蛋白激酶A和蛋白激酶C在肾阳虚发病中的作用及补肾药对其调整作用。方法：用长期大量糖皮质激素造成肾阳虚大鼠模型，用32P-ATP参入反应底物中的摩尔数表示蛋白激酶的活性，用放免法测定cAMP,cGMP含量。结果：肾阳虚大鼠血浆中cAMP水平下降，cGMP水平升高，cAMP/cGMP比值降低，下丘脑组织中PKA和PKC活性在胞液和胞膜中的活性较正常组明显降低。补肾方药对PKA和PKC的活性均有不同程度的调整作用。结论：PKA和PKC可能参与了肾阳虚大鼠的发病机制，补肾方药可部分调整PKA和PKC的活性，从而改善肾阳虚症状。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(2000)-0070-03
肾阳虚证时下丘脑的神经内分泌功能受损，其分泌的CRF及其他激素水平下降[1]，这必然影响多方面生理机能。肾阳虚证时体内的cAMP和cGMP含量和比值发生改变，而这两种第二信使是中医阴阳学说的物质基础之一。本研究测定了肾阳虚证时下丘脑组织中PKA和PKC的变化，并观察了补肾中药的调整作用，以进一步探讨肾阳虚证的发病机理。
材料与方法
1 材料
醋酸可的松注射液购自上海第九制药厂，补肾方药由附子、熟地、山萸肉、茯苓、泽泻、山药、仙灵脾、肉苁蓉组成，由河北省医药公司提供。HistoneⅢS,leupeptin,cAMP,PS(磷脂酰丝氨酸)，DG(甘油二脂)，DTT为Sigma产品。cAMP和cGMP测定试剂盒由北京中国原子能研究院提供。-32P-ATP购自北京亚辉生物工程公司。
, 百拇医药
2 动物分组及标本处理
雄性SD大鼠，体重250g～300g，随机分为三组。模型组，每天肌肉注射醋酸可的松10 mg/只，同时用蒸馏水灌胃；补肾组，每天注射醋酸可的松，并按10g/kg体重中药灌胃；正常对照组以等体积生理盐水代替醋酸可的松注射，用蒸馏水灌胃。实验第21d，所有动物经股动脉取血，断头处死，迅速取出全脑置于冰上，取下丘脑组织液氮保存。
3 血浆cAMP和cGMP水平的测定
按试剂盒说明书进行。
4 下丘脑组织蛋白激酶含量测定
4.1 胞液和胞膜PKA的制备
参照Deborah等方法[2]，以1：5(W/V)的缓冲液A[10 mmol/L Tris.HCl(pH7.4)，0.25 mol/L蔗糖，2mmol/L MgCl2,1 mmol/LCaCl2，10mmol/LKCl,1mmol/LPMSF,10 mg/Lleupeptin]，在冰浴中高速匀浆，800 g离心15 min，上清液再次16000 g离心10 min，由此得到的上清液作为胞液部分，沉淀悬于缓冲液A中，作为胞膜部分。
, 百拇医药
4.2 胞液和胞膜PKC酶液的制备
参照CHEN等的方法[3]，以含20 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)，0.25 mol/L蔗糖，0.5 mmol/LPMSF,2mmol/LEDTA和DTT，10 mmol/L leupeptin的缓冲液B制备匀浆，操作同PKA酶液的制备，但第二次离心后的沉淀悬于含有0.5%TritonX-100的缓冲液B，冰浴搅拌抽提1 h，16000 g离心10 min，上清液为PKC的模性组分。
4.3 PKA活性测定
参照汤华等的方法[4]，反应总体积为50μl，含终浓度为200 mmol/LTris.HCL(pH7.4)，2mmol/L DTT,50μg HistoneⅢS,5 mmol/L MgCl2，10μg酶液，20μmol/L -32P-ATP(200cpm/pmol)。加入或不加入2μmol/L cAMP,30℃保温5 min，立即放入冰浴，加10μl 1%牛血清白蛋白。取30μl反应液滴至2 cm×2 cm大小的快速薄型新华滤纸上，迅速投入冰浴的10%三氯醋酸-2%磷酸液中，重复洗涤三次，用5%三氯醋酸洗两次，每次30 min，最后用无水乙醇洗30 min，凉干后放入闪烁液中测定。PKA的活性以32P参入HistoneⅢS pmol/min表示。样品均为三复管。
, 百拇医药
4.4 PKC活性测定
总体积为100μl，含终浓度为20 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)，10mmol/L MgCl2，50μg HistoneⅢS,25μg PS,2.5μg DG,1mmol/L CaCl2，10μg酶液。对照管不加激活剂Ca2++PS+DG，而是加入2 mmol/L EGTA，加入10μ -32P-ATP(400 cpm/pmol)启动反应，30℃准确反应3 min后放入冰浴，取60μl反应液滴至滤纸上，以下操作及计算同PKA测定。
5 蛋白质含量测定
用Bradford法。
6 统计学处理
, http://www.100md.com
实验结果用x±s表示，采用t检验。
结果
1 肾阳虚动物的表征
模型组大鼠给药后相继出现食量减少，尿液白浊，身体蜷缩，反应迟钝，眯眼，竖毛，毛色黄质脆、易脱落，呼吸短促。补肾组大鼠症状出现较晚，程度轻于模型组。
2 血浆cAMP和cGMP水平变化(见表1)
表1 血浆中cAMP和cGMP水平及cAMP/cGMP比值的变化(x±s) 组 别
cAMP(pmol/L)
cGMP(pmol/L)
cAMP/cGMP
, 百拇医药
正常组
14.63±6.46
1.23±0.3
11.67±2.40
模型组
5.72±1.47*
3.39±1.99*
2.20±0.99**
补肾组
7.02±1.90*
1.44±0.53#
, 百拇医药
5.45±2.54*#
注：*与正常组比较：*P<0.05，**p<0.01；
#与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。
与正常组相比，模型组动物血浆cAMP水平显著降低，cGMP水平显著升高，cAMP/cGMP比值降低。补肾组cAMP略有升高，但与模型组相比无统计学差异；cGMP水平降低，cAMP/cGMP比值升高，与模型组相比均统计学差异。
3 下丘脑组织细胞不同组分中PKA活性的变化(见表2)
表2 下丘脑组织细胞不同组分中PKA活性的变化(x±s) 组 别
胞 膜
, 百拇医药 (32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
胞 液
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
正常组
66.18±19.84
243.45±31.07
模型组
, http://www.100md.com
40.49± 8.19*
122.84±28.46*
补肾组
49.10±17.23*
181.74±46.56*
注：与正常组比较：*P<0.05，**p<0.01；
#与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。
模型组大鼠下丘脑组织胞膜和胞液中PKA的活性均降低，但以胞液的变化更为明显。补肾组PKA的活性升高，但与模型组相比无明显差异。
, http://www.100md.com 表3 下丘脑组织细胞不同组分中PKC活性的变化(x±s) 组 别
胞 膜
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
胞 液
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
正常组
, 百拇医药
2219.42±680.44
849.84±268.53
模型组
1377.88±413.14*
400.75±155.82*
补肾组
1994.86±531.81*
979.37±274.81#
注：与正常组相比*P<0.05，**p<0.01
#与模型组相比#P<0.05，##P<0.01
, 百拇医药
4 下丘脑组织细胞不同组分中PKC活性的变化(见表3)
模型组大鼠下丘脑组织胞膜和胞液中PKC的活性均降低，但胞液的变化幅度更大，下降到对照组的47.15%。补肾药可增加PKC的活性，且以胞液的变化更为明显。
讨论
本实验采用注射醋酸可的松法使肾上腺功能受抑制，引起大鼠精神萎靡，体重减轻等一系列肾阳虚症状，并测得其血浆中cAMP水平下降，cGMP水平升高，cAMP/cGMP比值降低。CGMP和cAMP在体内的作用相反相成，两者被认为是中医阴阳的物质基础之一，它们的改变也说明肾阳虚模型的建立是成功的。
PKA，PKC通过底物磷酸化参与许多生理活动如神经递质释放、细胞增殖分化等，它们是许多外在刺激因子如激素、神经递质、生长因子等发挥作用的重要信号调节因子[5、6]。本研究结果表明，肾阳虚大鼠下丘脑组织中PKA，PKC活性均明显降低。下丘脑激素的作用是通过胞内信号传导系统来实现的，反之胞内信号传导系统的改变就可能影响激素分泌，从而导致下丘脑-垂体轴的神经内分泌功能紊乱。下丘脑组织细胞胞液PKA活性的变化更为明显。PKC的活性胞膜大于胞液，但胞液的下降幅度大于胞膜，提示胞液中的PKA和PKC活性可能对下丘脑神经内分泌功能变化影响更大。
, 百拇医药
补肾方药中仙灵脾和附子有兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，其他几味药则加以辅佐构成合理的补肾方剂。应用结果表明，该方药可延迟或减轻肾阳虚症状的出现，增加血浆中的cAMP含量，降低cGMP含量，从而增高cAMP/cGMP比值，调整机体阴阳平衡。同时该方药还能增加下丘脑组织细胞胞液和胞膜中PKA和PKC水平，尤以胞液中PKC水平增加最为明显。提示该补肾方药可能通过调整下丘脑组织cAMP和cGMP及相关的蛋白激酶等信号传导系统而改善肾阳虚症状。
作者简介：高博(1971-)，女(汉族)，河北省邯郸人，河北医科大学主治医师，医学博士，从事神经系统疾病发病的分子生物学机制研究。
参考文献
[1]沈自尹.肾阳虚证的定位研究.中国中西医结合杂志，1997，17(1)：50-52.
[2]Debrorah,F.B.,Anthony,J.Z.,Cyclic adenosine monophosphate signaling in the primate corpus luteum:maintenance of protein kinase A activity throughout the luteal phase of the menstrual cycles.Endocrinology,1997,138:3452-3458.
, 百拇医药
[3]Chen,C.C.,Chang,J.And Lin,W.W..Differential expression of protein kinase C isoforms in glial and neuronal cells.Translocation and down-regulation of PKC isoforms in C6 glioma and NG 108-15 hybrid cells effcte of extracellular Ca2+-depletion.Neurochem Int,1995,26(5):455-464.
[4]汤华，陈惠黎.亚硝胺诱发大鼠肝癌不同细胞组分中三类蛋白激酶的变化.上海医科大学学报，1994，21(3)：176-180.
[5]Roisin,M.P.and Barkin,G..Differntial expression of PKC isoforms in hippocampal neuronal cultures:modifications after basic FGF treatment.Neurochem Int,1997,30(3):267-270.
[6]Ariane,P.,Pascale,G.,Wayne,B.A.et al.Effect of phorbol ester on cyclic adenosine 3'5'-monophosphate dependent protein kinase in PYS teratocarcinoma-derived cells and counteraction with retinoic acid.Cancer Research,1988,48:3993-3997.
收稿日期：1999-06-14
修回日期：1999-09-21, http://www.100md.com
单位：高博(河北医科大学中西医结合基础理论研究室，河北 石家庄 050017) ；尹桂山(河北医科大学中西医结合基础理论研究室，河北 石家庄 050017)
关键词：肾阳虚； 下丘脑； 蛋白激酶； 补肾药
中国中医基础医学杂志00011 摘要：目的：研究蛋白激酶A和蛋白激酶C在肾阳虚发病中的作用及补肾药对其调整作用。方法：用长期大量糖皮质激素造成肾阳虚大鼠模型，用32P-ATP参入反应底物中的摩尔数表示蛋白激酶的活性，用放免法测定cAMP,cGMP含量。结果：肾阳虚大鼠血浆中cAMP水平下降，cGMP水平升高，cAMP/cGMP比值降低，下丘脑组织中PKA和PKC活性在胞液和胞膜中的活性较正常组明显降低。补肾方药对PKA和PKC的活性均有不同程度的调整作用。结论：PKA和PKC可能参与了肾阳虚大鼠的发病机制，补肾方药可部分调整PKA和PKC的活性，从而改善肾阳虚症状。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(2000)-0070-03
肾阳虚证时下丘脑的神经内分泌功能受损，其分泌的CRF及其他激素水平下降[1]，这必然影响多方面生理机能。肾阳虚证时体内的cAMP和cGMP含量和比值发生改变，而这两种第二信使是中医阴阳学说的物质基础之一。本研究测定了肾阳虚证时下丘脑组织中PKA和PKC的变化，并观察了补肾中药的调整作用，以进一步探讨肾阳虚证的发病机理。
材料与方法
1 材料
醋酸可的松注射液购自上海第九制药厂，补肾方药由附子、熟地、山萸肉、茯苓、泽泻、山药、仙灵脾、肉苁蓉组成，由河北省医药公司提供。HistoneⅢS,leupeptin,cAMP,PS(磷脂酰丝氨酸)，DG(甘油二脂)，DTT为Sigma产品。cAMP和cGMP测定试剂盒由北京中国原子能研究院提供。-32P-ATP购自北京亚辉生物工程公司。
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2 动物分组及标本处理
雄性SD大鼠，体重250g～300g，随机分为三组。模型组，每天肌肉注射醋酸可的松10 mg/只，同时用蒸馏水灌胃；补肾组，每天注射醋酸可的松，并按10g/kg体重中药灌胃；正常对照组以等体积生理盐水代替醋酸可的松注射，用蒸馏水灌胃。实验第21d，所有动物经股动脉取血，断头处死，迅速取出全脑置于冰上，取下丘脑组织液氮保存。
3 血浆cAMP和cGMP水平的测定
按试剂盒说明书进行。
4 下丘脑组织蛋白激酶含量测定
4.1 胞液和胞膜PKA的制备
参照Deborah等方法[2]，以1：5(W/V)的缓冲液A[10 mmol/L Tris.HCl(pH7.4)，0.25 mol/L蔗糖，2mmol/L MgCl2,1 mmol/LCaCl2，10mmol/LKCl,1mmol/LPMSF,10 mg/Lleupeptin]，在冰浴中高速匀浆，800 g离心15 min，上清液再次16000 g离心10 min，由此得到的上清液作为胞液部分，沉淀悬于缓冲液A中，作为胞膜部分。
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4.2 胞液和胞膜PKC酶液的制备
参照CHEN等的方法[3]，以含20 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)，0.25 mol/L蔗糖，0.5 mmol/LPMSF,2mmol/LEDTA和DTT，10 mmol/L leupeptin的缓冲液B制备匀浆，操作同PKA酶液的制备，但第二次离心后的沉淀悬于含有0.5%TritonX-100的缓冲液B，冰浴搅拌抽提1 h，16000 g离心10 min，上清液为PKC的模性组分。
4.3 PKA活性测定
参照汤华等的方法[4]，反应总体积为50μl，含终浓度为200 mmol/LTris.HCL(pH7.4)，2mmol/L DTT,50μg HistoneⅢS,5 mmol/L MgCl2，10μg酶液，20μmol/L -32P-ATP(200cpm/pmol)。加入或不加入2μmol/L cAMP,30℃保温5 min，立即放入冰浴，加10μl 1%牛血清白蛋白。取30μl反应液滴至2 cm×2 cm大小的快速薄型新华滤纸上，迅速投入冰浴的10%三氯醋酸-2%磷酸液中，重复洗涤三次，用5%三氯醋酸洗两次，每次30 min，最后用无水乙醇洗30 min，凉干后放入闪烁液中测定。PKA的活性以32P参入HistoneⅢS pmol/min表示。样品均为三复管。
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4.4 PKC活性测定
总体积为100μl，含终浓度为20 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)，10mmol/L MgCl2，50μg HistoneⅢS,25μg PS,2.5μg DG,1mmol/L CaCl2，10μg酶液。对照管不加激活剂Ca2++PS+DG，而是加入2 mmol/L EGTA，加入10μ -32P-ATP(400 cpm/pmol)启动反应，30℃准确反应3 min后放入冰浴，取60μl反应液滴至滤纸上，以下操作及计算同PKA测定。
5 蛋白质含量测定
用Bradford法。
6 统计学处理
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实验结果用x±s表示，采用t检验。
结果
1 肾阳虚动物的表征
模型组大鼠给药后相继出现食量减少，尿液白浊，身体蜷缩，反应迟钝，眯眼，竖毛，毛色黄质脆、易脱落，呼吸短促。补肾组大鼠症状出现较晚，程度轻于模型组。
2 血浆cAMP和cGMP水平变化(见表1)
表1 血浆中cAMP和cGMP水平及cAMP/cGMP比值的变化(x±s) 组 别
cAMP(pmol/L)
cGMP(pmol/L)
cAMP/cGMP
, 百拇医药
正常组
14.63±6.46
1.23±0.3
11.67±2.40
模型组
5.72±1.47*
3.39±1.99*
2.20±0.99**
补肾组
7.02±1.90*
1.44±0.53#
, 百拇医药
5.45±2.54*#
注：*与正常组比较：*P<0.05，**p<0.01；
#与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。
与正常组相比，模型组动物血浆cAMP水平显著降低，cGMP水平显著升高，cAMP/cGMP比值降低。补肾组cAMP略有升高，但与模型组相比无统计学差异；cGMP水平降低，cAMP/cGMP比值升高，与模型组相比均统计学差异。
3 下丘脑组织细胞不同组分中PKA活性的变化(见表2)
表2 下丘脑组织细胞不同组分中PKA活性的变化(x±s) 组 别
胞 膜
, 百拇医药 (32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
胞 液
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
正常组
66.18±19.84
243.45±31.07
模型组
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40.49± 8.19*
122.84±28.46*
补肾组
49.10±17.23*
181.74±46.56*
注：与正常组比较：*P<0.05，**p<0.01；
#与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。
模型组大鼠下丘脑组织胞膜和胞液中PKA的活性均降低，但以胞液的变化更为明显。补肾组PKA的活性升高，但与模型组相比无明显差异。
, http://www.100md.com 表3 下丘脑组织细胞不同组分中PKC活性的变化(x±s) 组 别
胞 膜
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
胞 液
(32P-ATPpmol/min
.mg-1.Pr)
正常组
, 百拇医药
2219.42±680.44
849.84±268.53
模型组
1377.88±413.14*
400.75±155.82*
补肾组
1994.86±531.81*
979.37±274.81#
注：与正常组相比*P<0.05，**p<0.01
#与模型组相比#P<0.05，##P<0.01
, 百拇医药
4 下丘脑组织细胞不同组分中PKC活性的变化(见表3)
模型组大鼠下丘脑组织胞膜和胞液中PKC的活性均降低，但胞液的变化幅度更大，下降到对照组的47.15%。补肾药可增加PKC的活性，且以胞液的变化更为明显。
讨论
本实验采用注射醋酸可的松法使肾上腺功能受抑制，引起大鼠精神萎靡，体重减轻等一系列肾阳虚症状，并测得其血浆中cAMP水平下降，cGMP水平升高，cAMP/cGMP比值降低。CGMP和cAMP在体内的作用相反相成，两者被认为是中医阴阳的物质基础之一，它们的改变也说明肾阳虚模型的建立是成功的。
PKA，PKC通过底物磷酸化参与许多生理活动如神经递质释放、细胞增殖分化等，它们是许多外在刺激因子如激素、神经递质、生长因子等发挥作用的重要信号调节因子[5、6]。本研究结果表明，肾阳虚大鼠下丘脑组织中PKA，PKC活性均明显降低。下丘脑激素的作用是通过胞内信号传导系统来实现的，反之胞内信号传导系统的改变就可能影响激素分泌，从而导致下丘脑-垂体轴的神经内分泌功能紊乱。下丘脑组织细胞胞液PKA活性的变化更为明显。PKC的活性胞膜大于胞液，但胞液的下降幅度大于胞膜，提示胞液中的PKA和PKC活性可能对下丘脑神经内分泌功能变化影响更大。
, 百拇医药
补肾方药中仙灵脾和附子有兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，其他几味药则加以辅佐构成合理的补肾方剂。应用结果表明，该方药可延迟或减轻肾阳虚症状的出现，增加血浆中的cAMP含量，降低cGMP含量，从而增高cAMP/cGMP比值，调整机体阴阳平衡。同时该方药还能增加下丘脑组织细胞胞液和胞膜中PKA和PKC水平，尤以胞液中PKC水平增加最为明显。提示该补肾方药可能通过调整下丘脑组织cAMP和cGMP及相关的蛋白激酶等信号传导系统而改善肾阳虚症状。
作者简介：高博(1971-)，女(汉族)，河北省邯郸人，河北医科大学主治医师，医学博士，从事神经系统疾病发病的分子生物学机制研究。
参考文献
[1]沈自尹.肾阳虚证的定位研究.中国中西医结合杂志，1997，17(1)：50-52.
[2]Debrorah,F.B.,Anthony,J.Z.,Cyclic adenosine monophosphate signaling in the primate corpus luteum:maintenance of protein kinase A activity throughout the luteal phase of the menstrual cycles.Endocrinology,1997,138:3452-3458.
, 百拇医药
[3]Chen,C.C.,Chang,J.And Lin,W.W..Differential expression of protein kinase C isoforms in glial and neuronal cells.Translocation and down-regulation of PKC isoforms in C6 glioma and NG 108-15 hybrid cells effcte of extracellular Ca2+-depletion.Neurochem Int,1995,26(5):455-464.
[4]汤华，陈惠黎.亚硝胺诱发大鼠肝癌不同细胞组分中三类蛋白激酶的变化.上海医科大学学报，1994，21(3)：176-180.
[5]Roisin,M.P.and Barkin,G..Differntial expression of PKC isoforms in hippocampal neuronal cultures:modifications after basic FGF treatment.Neurochem Int,1997,30(3):267-270.
[6]Ariane,P.,Pascale,G.,Wayne,B.A.et al.Effect of phorbol ester on cyclic adenosine 3'5'-monophosphate dependent protein kinase in PYS teratocarcinoma-derived cells and counteraction with retinoic acid.Cancer Research,1988,48:3993-3997.
收稿日期：1999-06-14
修回日期：1999-09-21, http://www.100md.com