格列本脲对糖尿病及正常大鼠心肌磺脲类药物受体mRNA的影响
作者：李焱 邓庆丽 傅祖植 黎锋 刘顺莲 程桦
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科
关键词：格列本脲；糖尿病
中华医学杂志000719【摘要】目的 观察链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的心肌磺脲类药物受体(SUR1，SUR2)和Kir6.2 是否在mRNA水平发生变化，并探讨格列本脲治疗对正常及糖尿病大鼠心肌SUR1，SUR2和Kir6.2数量的影响。方法 成年雄性SD大鼠随机分为3组，糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常组。另外一部分成年雄性SD大鼠随机分为糖尿病格列本脲治疗组和糖尿病对照组，非糖尿病格列本脲治疗组和非糖尿病对照组。格列本脲治疗组按10 mg/kg体重的剂量腹腔注射格列本脲2周。RT-PCR生产地高辛标记的单链cDNA探针，斑点印迹杂交检测心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA含量变化。结果 糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组的心肌SUR1，SUR2，Kir6.2的mRNA水平无差别(P>0.05)；格列本脲使非糖尿病大鼠心肌SUR1和SUR2的mRNA水平升高(P<0.05)，Kir6.2的mRNA水平无改变(P>0.05)。格列本脲不影响糖尿病大鼠心肌SUR1、SUR2和Kir6.2 mRNA水平(P>0.05)。结论 链脲霉素诱导的实验性糖尿病不影响心肌SUR1、SUR2和Kir6.2的mRNA水平，但改变心肌SUR1、SUR2对格列本脲的反应。
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Effects of glibenclamide on mRNA level of ATP-sensitive potassium channels of heart in normal and streptozotocin-induced diabetic rats
LI Yan DENG Qingli FU Zuzhi et al.
(Department of Endocrinology, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510120, China)
【Abstract】Objective To estimate if any difference exists in mRNA expression levels of KATP (SUR1, SUR2, Kir6.2) in heart tissues between streptozotocin-induced diabetic and normal rats, and to examine if any changes of heart KATP in mRNA level occurred after long-term Glibenclamide administration among the diabetic and control rats. Methods Part 1: Adult male Sprague-Dawley (SD) rats were allocated into three groups: one group (n=13) was taken as normal control, and the other two groups were diabetic models induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg/kg). One of the diabetic groups (n=10) was treated with premixed insulin (30%RI, 70%NPH) 4-8 units/day by subcutaneous injection at 4-5 pm everyday for two weeks. Part 2: Four groups of adult male SD rats were enrolled into the study. Group one (D1) was diabetes control induced by streptozotocin (n=9), group two (DG2) was the diabetes treated with Glibenclamide (n=14). Group three (N3) was normal control (n=10), and group four (NG4) received Glibenclamide administration without diabetes (n=14). DG2 and NG4 were given 10 mg/kg Glibenclamide intraperitonealy at 4-5pm everyday for 14 days. Single-stranded digoxigenin-labeled probes were generated with RT-PCR. A total of 30 μg of unfractionated RNA was transferred onto nylon membranes by dot-blot. Hybridization was performed at 50℃ for 16 hours with high SDS concentration hybridization buffer. Results Study one: There was no significant difference in mRNA expression levels of SUR1, SUR2, and Kir6.2 in heart between diabetic, insulin-treated diabetic and control groups (P>0.05). Study two: Glibenclamide-treated non-diabetic rats had higher mRNA expression levels of SUR1 and SUR2 in heart than normal control. The SUR1 were 43.0±16.6 vs 30.8±7.8 (P<0.05), SUR2 161.9±51.0 vs 118.9±40.9 (P<0.05), respectively. No difference in heart Kir6.2 mRNA level was found between the two groups (P>0.05). Comparison between Glibenclamide-treated diabetic and non-treated diabetic rats shoued that there was no change in mRNA levels of SUR1, SUR2 and Kir6.2 in heart (P>0.05). Conclusion Chronic Glibenclamide-treatment up-regulates KATP gene transcriptional expression of heart in non-diabetic rats. The Streptozotocin-inducing diabetes itself does not affect the mRNA expression of KATP (SUR1, SUR2, and Kir6.2) in extra-pancreas tissues, but decreases the response of KATP to chronic Glibenclamide-treatment at transcriptional level.
, 百拇医药
【Key words】Glyburide; Diabetes mellitus
磺脲类药物(SU)是治疗Ⅱ型糖尿病的主要药物之一，作用机制是关闭胰岛β细胞膜的ATP敏感的钾离子通道(KATP)，刺激胰岛素分泌[1]。ATP敏感的钾离子通道由磺脲类药物受体1或受体2(SUR1或SUR2)和内向整流型钾离子通道6.2(Kir6.2)组成[2]。同样的KATP也存在于心肌组织，也能被磺脲类药物阻断。动物实验发现，格列本脲(第2代的磺脲类药物)抑制大鼠心肌组织的KATP，延长心肌细胞动作电位时相，减少细胞外钾离子的聚积，在心肌缺血时，格列本脲扩大缺血心肌的坏死面积，延缓心肌收缩功能的恢复；同时增加血管阻力，减少血流供应[3]。
然而，现有的研究绝大多数是在非糖尿病动物中进行[4]。为此，本研究观察在链脲霉素导致的糖尿病大鼠中，心肌的KATP各组成成分-磺脲类药物受体(SUR1，SUR2)和Kir6.2 是否在mRNA水平发生变化；并探讨长期格列本脲治疗对正常及糖尿病大鼠心肌KATP数量的影响，为进一步了解磺脲类药物治疗糖尿病的安全性提供基本的实验依据。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1.糖尿病对大鼠心肌KATP各基因mRNA的影响：成年雄性SD大鼠(250～450 g)分为3组，其中2组按60 mg/kg体重空腹腹腔注射链脲霉素形成糖尿病模型，再分为糖尿病组(13只)和糖尿病胰岛素治疗组(14只)；注射链脲霉素3 d后，随机血糖大于16 mmol/L为糖尿病。另一组为正常对照组，胰岛素组给以皮下注射人预混短中效胰岛素(Humlin30R：30%RI，70%NPH) 每只4～8 U/d，每天下午4～5时注射，共2周。每3 d检测鼠尾全血血糖，调整胰岛素的用量，使其随机血糖接近正常；其他2组给以生理盐水。在实验期间，糖尿病胰岛素治疗组内4只大鼠因低血糖死亡，糖尿病组有2只不明原因死亡。糖尿病胰岛素治疗组10 只，糖尿病组 11只，正常组 13只完成实验。
2.格列本脲对糖尿病和正常大鼠心肌KATP基因mRNA的影响；成年雄性SD大鼠25只(200～290 g)，按上述方法形成糖尿病模型，将其中16只分为糖尿病格列本脲治疗组，9只为糖尿病对照组；将26只正常大鼠(190～240 g)分为非糖尿病格列本脲治疗组16只、非糖尿病对照组10只。格列本脲治疗组每天下午4～5 h，按10 mg/kg体重的剂量腹腔注射格列本脲，对照组给予相应量的溶剂(1,2-丙二醇：无水乙醇：0.1 mol/L氢氧化钠=1∶1∶1)，共2周。实验期间，糖尿病治疗组和非糖尿病治疗组各死亡2只。两周后，乙醚麻醉，左心室采血，分离血清，-40度冷冻保存。迅速取出心肌，冰生理盐水冲洗血液后液氮保存备用。
, 百拇医药
二、方法
1.异硫氰酸胍“一步法” 抽提组织总RNA，RT-PCR生产地高辛标记的单链cDNA为探针，斑点印迹杂交(Dot Blot)检测各组织SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA含量变化。
2.地高辛标记的单链cDNA探针的制备：(1)引物：SUR1：Sn(4 194～4 216)：5′-TGAAGGGTA-TCCACACACTCC-3′，Asn(4 559～4 540)：5′-ACTGAAGAGAACAGGGTCC-3′。SUR2：Sn (4 413～4 432)：5′-TAGACATTTCCAAGCTGCC-3′，Asn(4 821～4 799)：5′-TAATAGAGGAGACACGGTGAGC-3′。Kir6.2：Sn(805～826)22 bp：5′-CTCATCATCTAC-CACGTCATCG-3′，Asn(1 063～1 043)21 bp：5′-TGGGCACTTTAACGGTGTTCC-3′。SUR2探针范围在3′端135个核苷酸之前，故本探针检测的mRNA为SUR2A和SUR2B的总和，统称SUR2。(2)RT-PCR制备地高辛标记的单链cDNA探针：试剂：禽源逆转录酶(AMV)，Olig(dT15-18)：购于Gibco BRL公司，Rnase购于华美公司，dNTP、Taq酶及宝灵曼PCR产物纯化试剂盒，宝灵曼PCR合成地高辛探针试剂盒，宝灵曼地高辛核酸检测试剂盒购于宝灵曼公司。制备过程：RT-PCR合成双链DNA，内切酶TaqI鉴定。纯化产物用Asn引物和地高辛标记的dNTP进行第2次PCR扩增，制备地高辛标记的单链cDNA。
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3.RNA转膜、固定和杂交：斑点点样器将30 μg RNA转至尼龙膜，120℃烤箱烘烤30 min固定RNA。50℃预杂交4 h。按3.5～5 ml /100 cm2杂交膜面积加入杂交液和探针杂交过夜。室温下，2×洗液(2×SSC，0.1% SDS)200 ml洗膜2次，每次15 min，随后68度水浴下，0.1×洗液(0.1×SSC，0.1% SDS)200 ml洗膜2次，每次15 min。按宝灵曼地高辛核酸检测试剂盒产品说明书操作，进行地高辛检测及显色反应。
4.图像分析及数据的采集：全自动计算机图象分析仪(德国Kontron Elektronik Irbs2.0)扫描杂交膜，分别测定斑点杂交信号与周围本底的光密度，两者的差与杂交斑点的面积的乘积为光密度积分，代表杂交信号的强弱，即特定mRNA的水平。
三、统计分析
数据以平均数±标准差表示，2组间比较采用成组t检验，2组以上采用单因素方差分析。使用统计分析软件SPSS 9.0分析。
, 百拇医药
结果
1.各组KATP成分mRNA水平的比较：糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组的心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA水平无差别(P>0.05)。
2.格列本脲对心肌KATP各成分mRNA水平的影响：格列本脲不影响糖尿病大鼠心肌SUR1、SUR2和Kir6.2 mRNA水平(P>0.05)，但使正常大鼠心肌SUR1和SUR2的mRNA水平升高(P<0.05)，Kir6.2的mRNA水平无改变(P>0.05)，杂交信号的扫描光密度积分值(表1)。
表1 各组心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA杂交信号
光密度积分的比较(
±s) 组别
, http://www.100md.com 鼠数
(只)
SUR1
SUR2
Kir6.2
糖尿病组
8
35±10
152±35
35±6
糖尿病格列本脲治疗组
14
34±14
, 百拇医药
153±51
36±7
非糖尿病组
9
31± 8
119±41
37±8
非糖尿病格列本脲治疗组
13
43±17*
162±51**
41±9
, http://www.100md.com
注：与非糖尿病组比较，*t=2.2，P=0.039；**t=2.1，P=0.045讨论
本研究采用地高辛标记的单链cDNA探针检测心肌组织SUR1、SUR2、Kir6.2 的mRNA含量。首次观察链脲霉素诱导的实验性糖尿病与胰腺外组织即心肌KATP数量的关系。结果显示，链脲霉素诱导的实验性糖尿病不影响心肌KATP各组成成分的mRNA水平，这与糖尿病时葡萄糖的代谢特点和KATP的生理调节过程相一致。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠，组织对葡萄糖的摄取和利用减少，乳酸生成增多，酮体(乙酰乙酸，β-羟丁酸)比例升高，耗氧量下降，能量代谢降低，但是，除非有非常严重地低胰岛素血症，出现类似酮症酸中毒的代谢紊乱，糖尿病大鼠心肌细胞内的ATP含量无明显改变，细胞内外的pH值保持稳定[5]，说明在非组织缺血/缺氧下，组织的KATP的数量不会因为糖尿病而发生改变。
糖尿病本身不影响大鼠心肌的KATP数量，但却使组织对格列本脲的调节反应发生改变。经过2周的格列本脲治疗，正常大鼠心肌细胞的SUR1、SUR2发生上调节，即增加心肌组织的KATP数量，这符合受体调节的一般规律。但是，链脲霉素糖尿病大鼠经格列本脲处理，却没有出现在正常大鼠所观察到的现象，即长期的格列本脲治疗未使糖尿病大鼠心肌的KATP发生数量的上调节。提示糖尿病状态改变了心肌KATP对格列本脲的反应，发生的机制不清楚，但有研究发现抑制细胞代谢可降低KATP对格列本脲的敏感性[6，7]。
, 百拇医药
本研究发现，在正常大鼠，长期与格列本脲接触，SUR的上调节可使细胞的KATP的数量增加，意味着细胞具有开放更多KATP的能力，对同一剂量的格列本脲而言，阻断KATP的效果下降，需更多的格列本脲才能达到同样的效果。更为重要的是，糖尿病改变了心肌KATP对格列本脲的反应，在非糖尿病动物发现格列本脲扩大缺血心肌的坏死面积、延缓心肌收缩功能的恢复等研究结果，不能简单推论到糖尿病动物。
基金项目：广东省科学技术委员会重点攻关课题基金资助项目；广东省卫生科学技术研究基金资助项目
参考文献
1，Groop LC. Sufonylureas in NIDDM. Diabetes Care， 1992,15: 737-754.
2，Aguilar-bryan L, Clement JP , Gonzalez G, et al. Toward understanding the assembly and structure of KATP channels. Physiol Rev, 1998,78:227-245.
, http://www.100md.com
3，Smits P, Thien T. Cardiovascular effects of sulphonylurea derivatives. Implications for the treatment of NIDDM? Diabetologia ,1995,38:116-121.
4，Leibowitz G, Cerasi E. Sulfonylurea treatment of NIDDM patiens with cardiovascular disease: a mixed blessing. Diabetologia, 1996, 39:503.
5，Rosen P, Windeck P, Zimmer H G, et al. Myocardial performance and metabolism in nonketotic diabetic rat hearts: myocardial function and metabolism iv vivo and in the isolated perfused heart under the influence of insulin and octanoate. Basic Res Cardiol, 1989,81:620-635.
, 百拇医药
6，Findlay I. Sufonylurea drugs no longer inhibit ATP-sensitive K+ channels during metabolic stress in cardiac muscle. J Pharmacol Exp Ther ,1993, 266: 456-467.
7，Mukai E, Ishida H, Kato S, et al. Metabolic inhibition impairs ATP-sensitive K+ channel block by sulfonylurea in pancreatic β-cells. Am J Phusiol ,1998,274:E38-E44.
收稿日期：1999-12-20, 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科
关键词：格列本脲；糖尿病
中华医学杂志000719【摘要】目的 观察链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的心肌磺脲类药物受体(SUR1，SUR2)和Kir6.2 是否在mRNA水平发生变化，并探讨格列本脲治疗对正常及糖尿病大鼠心肌SUR1，SUR2和Kir6.2数量的影响。方法 成年雄性SD大鼠随机分为3组，糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常组。另外一部分成年雄性SD大鼠随机分为糖尿病格列本脲治疗组和糖尿病对照组，非糖尿病格列本脲治疗组和非糖尿病对照组。格列本脲治疗组按10 mg/kg体重的剂量腹腔注射格列本脲2周。RT-PCR生产地高辛标记的单链cDNA探针，斑点印迹杂交检测心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA含量变化。结果 糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组的心肌SUR1，SUR2，Kir6.2的mRNA水平无差别(P>0.05)；格列本脲使非糖尿病大鼠心肌SUR1和SUR2的mRNA水平升高(P<0.05)，Kir6.2的mRNA水平无改变(P>0.05)。格列本脲不影响糖尿病大鼠心肌SUR1、SUR2和Kir6.2 mRNA水平(P>0.05)。结论 链脲霉素诱导的实验性糖尿病不影响心肌SUR1、SUR2和Kir6.2的mRNA水平，但改变心肌SUR1、SUR2对格列本脲的反应。
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Effects of glibenclamide on mRNA level of ATP-sensitive potassium channels of heart in normal and streptozotocin-induced diabetic rats
LI Yan DENG Qingli FU Zuzhi et al.
(Department of Endocrinology, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510120, China)
【Abstract】Objective To estimate if any difference exists in mRNA expression levels of KATP (SUR1, SUR2, Kir6.2) in heart tissues between streptozotocin-induced diabetic and normal rats, and to examine if any changes of heart KATP in mRNA level occurred after long-term Glibenclamide administration among the diabetic and control rats. Methods Part 1: Adult male Sprague-Dawley (SD) rats were allocated into three groups: one group (n=13) was taken as normal control, and the other two groups were diabetic models induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg/kg). One of the diabetic groups (n=10) was treated with premixed insulin (30%RI, 70%NPH) 4-8 units/day by subcutaneous injection at 4-5 pm everyday for two weeks. Part 2: Four groups of adult male SD rats were enrolled into the study. Group one (D1) was diabetes control induced by streptozotocin (n=9), group two (DG2) was the diabetes treated with Glibenclamide (n=14). Group three (N3) was normal control (n=10), and group four (NG4) received Glibenclamide administration without diabetes (n=14). DG2 and NG4 were given 10 mg/kg Glibenclamide intraperitonealy at 4-5pm everyday for 14 days. Single-stranded digoxigenin-labeled probes were generated with RT-PCR. A total of 30 μg of unfractionated RNA was transferred onto nylon membranes by dot-blot. Hybridization was performed at 50℃ for 16 hours with high SDS concentration hybridization buffer. Results Study one: There was no significant difference in mRNA expression levels of SUR1, SUR2, and Kir6.2 in heart between diabetic, insulin-treated diabetic and control groups (P>0.05). Study two: Glibenclamide-treated non-diabetic rats had higher mRNA expression levels of SUR1 and SUR2 in heart than normal control. The SUR1 were 43.0±16.6 vs 30.8±7.8 (P<0.05), SUR2 161.9±51.0 vs 118.9±40.9 (P<0.05), respectively. No difference in heart Kir6.2 mRNA level was found between the two groups (P>0.05). Comparison between Glibenclamide-treated diabetic and non-treated diabetic rats shoued that there was no change in mRNA levels of SUR1, SUR2 and Kir6.2 in heart (P>0.05). Conclusion Chronic Glibenclamide-treatment up-regulates KATP gene transcriptional expression of heart in non-diabetic rats. The Streptozotocin-inducing diabetes itself does not affect the mRNA expression of KATP (SUR1, SUR2, and Kir6.2) in extra-pancreas tissues, but decreases the response of KATP to chronic Glibenclamide-treatment at transcriptional level.
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【Key words】Glyburide; Diabetes mellitus
磺脲类药物(SU)是治疗Ⅱ型糖尿病的主要药物之一，作用机制是关闭胰岛β细胞膜的ATP敏感的钾离子通道(KATP)，刺激胰岛素分泌[1]。ATP敏感的钾离子通道由磺脲类药物受体1或受体2(SUR1或SUR2)和内向整流型钾离子通道6.2(Kir6.2)组成[2]。同样的KATP也存在于心肌组织，也能被磺脲类药物阻断。动物实验发现，格列本脲(第2代的磺脲类药物)抑制大鼠心肌组织的KATP，延长心肌细胞动作电位时相，减少细胞外钾离子的聚积，在心肌缺血时，格列本脲扩大缺血心肌的坏死面积，延缓心肌收缩功能的恢复；同时增加血管阻力，减少血流供应[3]。
然而，现有的研究绝大多数是在非糖尿病动物中进行[4]。为此，本研究观察在链脲霉素导致的糖尿病大鼠中，心肌的KATP各组成成分-磺脲类药物受体(SUR1，SUR2)和Kir6.2 是否在mRNA水平发生变化；并探讨长期格列本脲治疗对正常及糖尿病大鼠心肌KATP数量的影响，为进一步了解磺脲类药物治疗糖尿病的安全性提供基本的实验依据。
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材料与方法
一、材料
1.糖尿病对大鼠心肌KATP各基因mRNA的影响：成年雄性SD大鼠(250～450 g)分为3组，其中2组按60 mg/kg体重空腹腹腔注射链脲霉素形成糖尿病模型，再分为糖尿病组(13只)和糖尿病胰岛素治疗组(14只)；注射链脲霉素3 d后，随机血糖大于16 mmol/L为糖尿病。另一组为正常对照组，胰岛素组给以皮下注射人预混短中效胰岛素(Humlin30R：30%RI，70%NPH) 每只4～8 U/d，每天下午4～5时注射，共2周。每3 d检测鼠尾全血血糖，调整胰岛素的用量，使其随机血糖接近正常；其他2组给以生理盐水。在实验期间，糖尿病胰岛素治疗组内4只大鼠因低血糖死亡，糖尿病组有2只不明原因死亡。糖尿病胰岛素治疗组10 只，糖尿病组 11只，正常组 13只完成实验。
2.格列本脲对糖尿病和正常大鼠心肌KATP基因mRNA的影响；成年雄性SD大鼠25只(200～290 g)，按上述方法形成糖尿病模型，将其中16只分为糖尿病格列本脲治疗组，9只为糖尿病对照组；将26只正常大鼠(190～240 g)分为非糖尿病格列本脲治疗组16只、非糖尿病对照组10只。格列本脲治疗组每天下午4～5 h，按10 mg/kg体重的剂量腹腔注射格列本脲，对照组给予相应量的溶剂(1,2-丙二醇：无水乙醇：0.1 mol/L氢氧化钠=1∶1∶1)，共2周。实验期间，糖尿病治疗组和非糖尿病治疗组各死亡2只。两周后，乙醚麻醉，左心室采血，分离血清，-40度冷冻保存。迅速取出心肌，冰生理盐水冲洗血液后液氮保存备用。
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二、方法
1.异硫氰酸胍“一步法” 抽提组织总RNA，RT-PCR生产地高辛标记的单链cDNA为探针，斑点印迹杂交(Dot Blot)检测各组织SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA含量变化。
2.地高辛标记的单链cDNA探针的制备：(1)引物：SUR1：Sn(4 194～4 216)：5′-TGAAGGGTA-TCCACACACTCC-3′，Asn(4 559～4 540)：5′-ACTGAAGAGAACAGGGTCC-3′。SUR2：Sn (4 413～4 432)：5′-TAGACATTTCCAAGCTGCC-3′，Asn(4 821～4 799)：5′-TAATAGAGGAGACACGGTGAGC-3′。Kir6.2：Sn(805～826)22 bp：5′-CTCATCATCTAC-CACGTCATCG-3′，Asn(1 063～1 043)21 bp：5′-TGGGCACTTTAACGGTGTTCC-3′。SUR2探针范围在3′端135个核苷酸之前，故本探针检测的mRNA为SUR2A和SUR2B的总和，统称SUR2。(2)RT-PCR制备地高辛标记的单链cDNA探针：试剂：禽源逆转录酶(AMV)，Olig(dT15-18)：购于Gibco BRL公司，Rnase购于华美公司，dNTP、Taq酶及宝灵曼PCR产物纯化试剂盒，宝灵曼PCR合成地高辛探针试剂盒，宝灵曼地高辛核酸检测试剂盒购于宝灵曼公司。制备过程：RT-PCR合成双链DNA，内切酶TaqI鉴定。纯化产物用Asn引物和地高辛标记的dNTP进行第2次PCR扩增，制备地高辛标记的单链cDNA。
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3.RNA转膜、固定和杂交：斑点点样器将30 μg RNA转至尼龙膜，120℃烤箱烘烤30 min固定RNA。50℃预杂交4 h。按3.5～5 ml /100 cm2杂交膜面积加入杂交液和探针杂交过夜。室温下，2×洗液(2×SSC，0.1% SDS)200 ml洗膜2次，每次15 min，随后68度水浴下，0.1×洗液(0.1×SSC，0.1% SDS)200 ml洗膜2次，每次15 min。按宝灵曼地高辛核酸检测试剂盒产品说明书操作，进行地高辛检测及显色反应。
4.图像分析及数据的采集：全自动计算机图象分析仪(德国Kontron Elektronik Irbs2.0)扫描杂交膜，分别测定斑点杂交信号与周围本底的光密度，两者的差与杂交斑点的面积的乘积为光密度积分，代表杂交信号的强弱，即特定mRNA的水平。
三、统计分析
数据以平均数±标准差表示，2组间比较采用成组t检验，2组以上采用单因素方差分析。使用统计分析软件SPSS 9.0分析。
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结果
1.各组KATP成分mRNA水平的比较：糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组的心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA水平无差别(P>0.05)。
2.格列本脲对心肌KATP各成分mRNA水平的影响：格列本脲不影响糖尿病大鼠心肌SUR1、SUR2和Kir6.2 mRNA水平(P>0.05)，但使正常大鼠心肌SUR1和SUR2的mRNA水平升高(P<0.05)，Kir6.2的mRNA水平无改变(P>0.05)，杂交信号的扫描光密度积分值(表1)。
表1 各组心肌SUR1、SUR2、Kir6.2的mRNA杂交信号
光密度积分的比较(
±s) 组别, http://www.100md.com 鼠数
(只)
SUR1
SUR2
Kir6.2
糖尿病组
8
35±10
152±35
35±6
糖尿病格列本脲治疗组
14
34±14
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153±51
36±7
非糖尿病组
9
31± 8
119±41
37±8
非糖尿病格列本脲治疗组
13
43±17*
162±51**
41±9
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注：与非糖尿病组比较，*t=2.2，P=0.039；**t=2.1，P=0.045讨论
本研究采用地高辛标记的单链cDNA探针检测心肌组织SUR1、SUR2、Kir6.2 的mRNA含量。首次观察链脲霉素诱导的实验性糖尿病与胰腺外组织即心肌KATP数量的关系。结果显示，链脲霉素诱导的实验性糖尿病不影响心肌KATP各组成成分的mRNA水平，这与糖尿病时葡萄糖的代谢特点和KATP的生理调节过程相一致。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠，组织对葡萄糖的摄取和利用减少，乳酸生成增多，酮体(乙酰乙酸，β-羟丁酸)比例升高，耗氧量下降，能量代谢降低，但是，除非有非常严重地低胰岛素血症，出现类似酮症酸中毒的代谢紊乱，糖尿病大鼠心肌细胞内的ATP含量无明显改变，细胞内外的pH值保持稳定[5]，说明在非组织缺血/缺氧下，组织的KATP的数量不会因为糖尿病而发生改变。
糖尿病本身不影响大鼠心肌的KATP数量，但却使组织对格列本脲的调节反应发生改变。经过2周的格列本脲治疗，正常大鼠心肌细胞的SUR1、SUR2发生上调节，即增加心肌组织的KATP数量，这符合受体调节的一般规律。但是，链脲霉素糖尿病大鼠经格列本脲处理，却没有出现在正常大鼠所观察到的现象，即长期的格列本脲治疗未使糖尿病大鼠心肌的KATP发生数量的上调节。提示糖尿病状态改变了心肌KATP对格列本脲的反应，发生的机制不清楚，但有研究发现抑制细胞代谢可降低KATP对格列本脲的敏感性[6，7]。
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本研究发现，在正常大鼠，长期与格列本脲接触，SUR的上调节可使细胞的KATP的数量增加，意味着细胞具有开放更多KATP的能力，对同一剂量的格列本脲而言，阻断KATP的效果下降，需更多的格列本脲才能达到同样的效果。更为重要的是，糖尿病改变了心肌KATP对格列本脲的反应，在非糖尿病动物发现格列本脲扩大缺血心肌的坏死面积、延缓心肌收缩功能的恢复等研究结果，不能简单推论到糖尿病动物。
基金项目：广东省科学技术委员会重点攻关课题基金资助项目；广东省卫生科学技术研究基金资助项目
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收稿日期：1999-12-20, 百拇医药