链脲菌素糖尿病大鼠胰腺神经肽Y分布及含量的研究
作者：傅茂 李秀均 鲜杨 余叶蓉 陈静 张敏
单位：傅茂 李秀均 鲜杨 余叶蓉 陈静(610041 成都，华西医科大学第一附属医院内分泌科)；张敏(华西医科大学基础医学院同位素室)
关键词：
中华医学杂志000927 神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)广泛分布于中枢神经系统和外周的许多器官,与摄食、血压、心率、呼吸调节、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌调节等重要的生理功能有关。脑室灌注NPY可致血胰岛素水平增高。用NPY对胰岛进行柱细胞表面灌注，可抑制葡萄糖诱导胰岛素分泌。近年的研究证实，不仅在胰腺中有NPY的神经纤维分布，而且在胰岛内分泌细胞中有NPY阳性的细胞分布[1]。但NPY在糖尿病胰腺中的分布及变化情况在所查国内外资料中尚未见报道。为此，我们应用免疫组织化学的方法，对链脲菌素(STZ)糖尿病大鼠胰腺中NPY的变化情况进行了研究。
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一、材料与方法
1.STZ糖尿病大鼠模型建立：选用健康雌性Wistar大鼠30只，分为3组，每组10只，将其中一组作为对照，另2组给予STZ(streptozocin)50 mg/kg腹腔注射，血糖达16.7 mmol/L者，诊断为糖尿病。将其中一组糖尿病鼠给予皮下注射长效胰岛素1～3 U，每天1次，为治疗组。另一组不给药为糖尿病组。对照组病死2只；糖尿病组缓解1只，病死2只；治疗组缓解1只，低血糖死亡1只。饲养24周(从成糖尿病算起)后，处死动物。迅速取出胰腺，固定，包埋，切片备用。
2.免疫组织化学程序：石蜡切片常规脱水；常规免疫组织化学程序，NPY抗体(美国Sigma公司，1∶800)、胰岛素抗体(中山生物化学公司，1∶100)，DAB染色；苏木素衬染。空白对照和替代对照结果均为阴性。
3. 统计学处理；在图像分析系统测定每张胰腺切片中5个较完整的胰岛面积，并计数其中的阳细胞数。利用统计软件包进行统计，两样本均数比较用t检验，多个样本均数的比较用方差分析中的q检验。检验水准α=0.05。
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二、结果
1.动物的进食、饮水、体重及血糖情况(表1)：STZ糖尿病鼠进食、饮水均较正常组增加，给予胰岛素治疗，多饮多食症状缓解。体重糖尿病组明显轻，糖尿病胰岛素治疗组体重与正常接近。血糖情况：糖尿病组血糖明显高于正常组，治疗组血糖较糖尿病组明显降低，但尚高于正常组，说明胰岛素用量不足。糖尿病组有71.43%的大鼠出现白内障(5/7)。上述资料证明建模成功。
表1 STZ糖尿病鼠进食、饮水、体重及血糖情况(
±s) 组别
鼠数
进食
(g)
饮水
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(ml)
血糖
(mmol/L)
体重(g)
进食前
进食后
对照组
8
17.0±
2.9
28±
8
5.2±
, 百拇医药
1.0
198±
8
324±
28
糖尿病组
7
32.0±
3.4*
107±
23*
19.3±
1.5*
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210±
19
275±
24*
治疗组
8
23.8±
4.3*▲
33±
8▲
13.5±
4*▲
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202±
5
313±
34▲
注：与对照组比，*q值分别为11.72、16.07、15.07、10.86、6.23、9.05，P<0.01，▲与糖尿病组比，q值分别为5.70、14.75、6.32、10.30，P<0.01
2.STZ糖尿病鼠胰岛面积和胰岛中胰岛素及NPY变化情况(表2)：STZ注射后，糖尿病和治疗组胰岛面积均较正常对照组明显缩小。HE染色观察到胰岛内细胞数目减少，细胞间结缔组织增加，细胞核异染色质增多，并有靠边现象。胰岛中胰岛素阳性细胞数糖尿病组较正常对照组明显减少，但与治疗组比较差异无显著意义。残存的INS阳性细胞多位于胰岛的中央部分。NPY阳性的细胞多分布于胰岛的周边，胰岛中央也有少许NPY阳性细胞分布，但其阳性反应弱。在糖尿病组，NPY阳性细胞较正常对照组增多，且在胰岛的中央周边均可见分布。治疗组与糖尿病组间比较差异无显著意义。
, 百拇医药
表2 STZ糖尿病大鼠胰岛面积和胰岛素及
NPY阳性细胞数(±s) 组别
鼠数
胰岛面积
(μm2)
INS阳性
细胞数
NPY阳性
细胞数
对照组
8
, 百拇医药
31 408±4 968
100±22
18±4
糖尿病组
7
12 488±3 237*
24±10*
29±5**
治疗组
8
12 315±1 967*
, 百拇医药
23±9*
26±6**
注：与对照组比，*q值分别为14.91、33.64、14.27、33.37，P<0.01；**q值4.02，3.11，P<0.05 三、讨论
STZ糖尿病鼠胰岛NPY阳性细胞数目及分布均发生变化的原因尚不清楚，推测可能有以下几种原因(1)STZ造成β细胞坏死和损伤，使β细胞广泛表达NPY。在发育的早期β细胞中胰岛素和NPY共同表达，发育成熟后β细胞中未见NPY表达[2]。当β细胞受损时，解除了对 NPY基因的抑制，使NPY得以表达[3]。因此可以认为，β细胞受某些因素影响后，可表达NPY。(2)胰岛素缺乏引起NPY的表达增加。胰岛素的缺乏，使胰岛内环境改变，而使胰岛的内分泌细胞表达NPY。如胰岛素缺乏，对α细胞的抑制减弱，合成胰升血糖素及NPY增加。(3)糖尿病时，高血糖刺激NPY的合成增多。用地塞米松处理后的鼠胰岛灌注时，发现低血糖时NPY分泌少，而高糖时NPY的分泌增加。认为地塞米松使β细胞表达NPY，并在高糖刺激时，使其分泌。(4)胰岛内增生的内分泌细胞表达NPY。Bonner-Weir等[4]报道，胰腺部分切除后，残余的胰岛可再生。O′Reilly等[5]也证实，在NOD鼠胰腺导管细胞中，NPY阳性细胞数较转基因NOD-E鼠明显增多。皮下给予胰岛素治疗未能明显的改变胰岛NPY阳性细胞数，可能的原因为胰岛的内分泌细胞长期处于较高的胰岛素环境，外周给予胰岛素，其到胰岛的量太微，不足以纠正胰岛内胰岛素不足的状况，而不能明显的改变NPY的阳性细胞数。可能胰岛内的NPY增多与胰岛素缺乏无关，故给予胰岛素后仍不能使NPY阳性数目减少。
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NPY在STZ糖尿病鼠胰岛内含量增多的确切生理作用目前还不清楚。用地塞米松处理大鼠后，其胰腺的NPY含量增加，分别用NPY的抗血清和正常血清处理胰岛后，进行柱细胞表面灌注，NPY抗血清组比正常血清组糖刺激的胰岛素分泌高2～3倍。证明NPY对胰岛素分泌有抑制作用。通过对胰岛NPY受体的研究，也证明NPY可通过β细胞上的受体，而直接影响胰岛素分泌。NPY的含量增多，也可能与胰岛内分泌细胞的再生有关。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(399770351)
参考文献
1，Louw J, woodroof CW, Wolfe-coote SA. Distribution of endocrine cell displaying immunoreactivity for one or more peptides in the pancreas of adult vervet monkey (cercopithecus aethiops). Anat Rec, 1997,247:405-412.
, 百拇医药
2，Jackerott M, Qster A, Larsson LI. PYY in developing murine islet cells: comparisons to development of islet hormones, NPY and Brdu incorporation. J Histochem Cytochem. 1996.44:809-817.
3，Waeber G, Thompson N, Waebar B, et al. Neuropeptide Y expression and regulation in differentiated rat insulin-secreting cell line. Endocrinology. 1993,133:1061-1067.
4，Bonner-Weir S, Baxter LA, Schuppim GT, et al. A second pathway or regeneration of adult exocrine and endocrine pancreas. Diabetes. 1993,42:1715-1720.
5，O′Reilly LA, Gu DL, Sarvetnick N, et al. α-cell neogenesis in an animal model of IDDM. Diabetes， 1997,46:599-606.
(收稿日期：1999-09-23), 百拇医药
单位：傅茂 李秀均 鲜杨 余叶蓉 陈静(610041 成都，华西医科大学第一附属医院内分泌科)；张敏(华西医科大学基础医学院同位素室)
关键词：
中华医学杂志000927 神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)广泛分布于中枢神经系统和外周的许多器官,与摄食、血压、心率、呼吸调节、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌调节等重要的生理功能有关。脑室灌注NPY可致血胰岛素水平增高。用NPY对胰岛进行柱细胞表面灌注，可抑制葡萄糖诱导胰岛素分泌。近年的研究证实，不仅在胰腺中有NPY的神经纤维分布，而且在胰岛内分泌细胞中有NPY阳性的细胞分布[1]。但NPY在糖尿病胰腺中的分布及变化情况在所查国内外资料中尚未见报道。为此，我们应用免疫组织化学的方法，对链脲菌素(STZ)糖尿病大鼠胰腺中NPY的变化情况进行了研究。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.STZ糖尿病大鼠模型建立：选用健康雌性Wistar大鼠30只，分为3组，每组10只，将其中一组作为对照，另2组给予STZ(streptozocin)50 mg/kg腹腔注射，血糖达16.7 mmol/L者，诊断为糖尿病。将其中一组糖尿病鼠给予皮下注射长效胰岛素1～3 U，每天1次，为治疗组。另一组不给药为糖尿病组。对照组病死2只；糖尿病组缓解1只，病死2只；治疗组缓解1只，低血糖死亡1只。饲养24周(从成糖尿病算起)后，处死动物。迅速取出胰腺，固定，包埋，切片备用。
2.免疫组织化学程序：石蜡切片常规脱水；常规免疫组织化学程序，NPY抗体(美国Sigma公司，1∶800)、胰岛素抗体(中山生物化学公司，1∶100)，DAB染色；苏木素衬染。空白对照和替代对照结果均为阴性。
3. 统计学处理；在图像分析系统测定每张胰腺切片中5个较完整的胰岛面积，并计数其中的阳细胞数。利用统计软件包进行统计，两样本均数比较用t检验，多个样本均数的比较用方差分析中的q检验。检验水准α=0.05。
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二、结果
1.动物的进食、饮水、体重及血糖情况(表1)：STZ糖尿病鼠进食、饮水均较正常组增加，给予胰岛素治疗，多饮多食症状缓解。体重糖尿病组明显轻，糖尿病胰岛素治疗组体重与正常接近。血糖情况：糖尿病组血糖明显高于正常组，治疗组血糖较糖尿病组明显降低，但尚高于正常组，说明胰岛素用量不足。糖尿病组有71.43%的大鼠出现白内障(5/7)。上述资料证明建模成功。
表1 STZ糖尿病鼠进食、饮水、体重及血糖情况(
±s) 组别鼠数
进食
(g)
饮水
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(ml)
血糖
(mmol/L)
体重(g)
进食前
进食后
对照组
8
17.0±
2.9
28±
8
5.2±
, 百拇医药
1.0
198±
8
324±
28
糖尿病组
7
32.0±
3.4*
107±
23*
19.3±
1.5*
, http://www.100md.com
210±
19
275±
24*
治疗组
8
23.8±
4.3*▲
33±
8▲
13.5±
4*▲
, http://www.100md.com
202±
5
313±
34▲
注：与对照组比，*q值分别为11.72、16.07、15.07、10.86、6.23、9.05，P<0.01，▲与糖尿病组比，q值分别为5.70、14.75、6.32、10.30，P<0.01
2.STZ糖尿病鼠胰岛面积和胰岛中胰岛素及NPY变化情况(表2)：STZ注射后，糖尿病和治疗组胰岛面积均较正常对照组明显缩小。HE染色观察到胰岛内细胞数目减少，细胞间结缔组织增加，细胞核异染色质增多，并有靠边现象。胰岛中胰岛素阳性细胞数糖尿病组较正常对照组明显减少，但与治疗组比较差异无显著意义。残存的INS阳性细胞多位于胰岛的中央部分。NPY阳性的细胞多分布于胰岛的周边，胰岛中央也有少许NPY阳性细胞分布，但其阳性反应弱。在糖尿病组，NPY阳性细胞较正常对照组增多，且在胰岛的中央周边均可见分布。治疗组与糖尿病组间比较差异无显著意义。
, 百拇医药
表2 STZ糖尿病大鼠胰岛面积和胰岛素及
NPY阳性细胞数(
±s) 组别鼠数
胰岛面积
(μm2)
INS阳性
细胞数
NPY阳性
细胞数
对照组
8
, 百拇医药
31 408±4 968
100±22
18±4
糖尿病组
7
12 488±3 237*
24±10*
29±5**
治疗组
8
12 315±1 967*
, 百拇医药
23±9*
26±6**
注：与对照组比，*q值分别为14.91、33.64、14.27、33.37，P<0.01；**q值4.02，3.11，P<0.05 三、讨论
STZ糖尿病鼠胰岛NPY阳性细胞数目及分布均发生变化的原因尚不清楚，推测可能有以下几种原因(1)STZ造成β细胞坏死和损伤，使β细胞广泛表达NPY。在发育的早期β细胞中胰岛素和NPY共同表达，发育成熟后β细胞中未见NPY表达[2]。当β细胞受损时，解除了对 NPY基因的抑制，使NPY得以表达[3]。因此可以认为，β细胞受某些因素影响后，可表达NPY。(2)胰岛素缺乏引起NPY的表达增加。胰岛素的缺乏，使胰岛内环境改变，而使胰岛的内分泌细胞表达NPY。如胰岛素缺乏，对α细胞的抑制减弱，合成胰升血糖素及NPY增加。(3)糖尿病时，高血糖刺激NPY的合成增多。用地塞米松处理后的鼠胰岛灌注时，发现低血糖时NPY分泌少，而高糖时NPY的分泌增加。认为地塞米松使β细胞表达NPY，并在高糖刺激时，使其分泌。(4)胰岛内增生的内分泌细胞表达NPY。Bonner-Weir等[4]报道，胰腺部分切除后，残余的胰岛可再生。O′Reilly等[5]也证实，在NOD鼠胰腺导管细胞中，NPY阳性细胞数较转基因NOD-E鼠明显增多。皮下给予胰岛素治疗未能明显的改变胰岛NPY阳性细胞数，可能的原因为胰岛的内分泌细胞长期处于较高的胰岛素环境，外周给予胰岛素，其到胰岛的量太微，不足以纠正胰岛内胰岛素不足的状况，而不能明显的改变NPY的阳性细胞数。可能胰岛内的NPY增多与胰岛素缺乏无关，故给予胰岛素后仍不能使NPY阳性数目减少。
, http://www.100md.com
NPY在STZ糖尿病鼠胰岛内含量增多的确切生理作用目前还不清楚。用地塞米松处理大鼠后，其胰腺的NPY含量增加，分别用NPY的抗血清和正常血清处理胰岛后，进行柱细胞表面灌注，NPY抗血清组比正常血清组糖刺激的胰岛素分泌高2～3倍。证明NPY对胰岛素分泌有抑制作用。通过对胰岛NPY受体的研究，也证明NPY可通过β细胞上的受体，而直接影响胰岛素分泌。NPY的含量增多，也可能与胰岛内分泌细胞的再生有关。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(399770351)
参考文献
1，Louw J, woodroof CW, Wolfe-coote SA. Distribution of endocrine cell displaying immunoreactivity for one or more peptides in the pancreas of adult vervet monkey (cercopithecus aethiops). Anat Rec, 1997,247:405-412.
, 百拇医药
2，Jackerott M, Qster A, Larsson LI. PYY in developing murine islet cells: comparisons to development of islet hormones, NPY and Brdu incorporation. J Histochem Cytochem. 1996.44:809-817.
3，Waeber G, Thompson N, Waebar B, et al. Neuropeptide Y expression and regulation in differentiated rat insulin-secreting cell line. Endocrinology. 1993,133:1061-1067.
4，Bonner-Weir S, Baxter LA, Schuppim GT, et al. A second pathway or regeneration of adult exocrine and endocrine pancreas. Diabetes. 1993,42:1715-1720.
5，O′Reilly LA, Gu DL, Sarvetnick N, et al. α-cell neogenesis in an animal model of IDDM. Diabetes， 1997,46:599-606.
(收稿日期：1999-09-23), 百拇医药