电离辐射对小鼠肝脏金属硫蛋白表达的影响
作者：范才 鞠桂芝
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990420
金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于体内、富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白，具有重金属解毒、调节机体应激反应及必需微量元素代谢等重要功能。重金属、INF、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)及化学毒物等多种物质均可诱导MT合成、并产生交叉抗性[1]。近来，研究发现电离辐射亦可诱导组织合成MT，但所见报道有限[2-4]。为了进一步研究辐射对MT表达的影响，作者采用了109Cd饱和法对全身X射线照射小鼠肝脏MT含量的变化进行了研究。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.动物：雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g，购于白求恩医科大学实验动物部。
2.照射条件：应用Philips深部X射线治疗机，电压200 kV，电流10 mA，滤过板 0.5 mmCu+1.0 mmAl，全身单次照射，吸收剂量率为 0.287 Gy/min。时程实验：吸收剂量为 4 Gy，照射后 0.5、2、4、8、16、24、48及72小时断头处死动物，取肝脏制成匀浆；剂量效应关系实验：设0.5、1、2、4及6 Gy照射组及假照射组，每组10只小鼠，照射后16小时断头处死动物，取肝脏制成匀浆。
3.组织MT的测定[5]：取大约 1 g肝脏，加4倍体积的 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆1～2分钟，10 000 g离心10 分钟，上清液沸水浴2分钟，冷却，10 000 g离心5分钟，以除去变性蛋白，上清液适当稀释5～10倍，取 200 μl稀释液置于 1.5 ml离心管中，加入 200 μl用 10 mmol/L Tris-HCl配制的 2.0 μg/ml CdCl2和放射性浓度为3.7×104 Bq/ml 109Cd的混合液，混匀后室温放置10分钟，然后加入 100 μl 2%牛血红蛋白溶液，混匀沸水加热2分钟，冷却后 10 000 g离心10分钟，再加入2%牛血红蛋白溶液 100 μl，加热、冷却、离心使变性血红蛋白紧贴于管壁，将上清液转入放免管进行放射性计数。空白管用 10 mmol/L Tris-HCl代替匀浆液；总放射性管用 10 mmol/L Tris-HCl代替血红蛋白。样品MT含量为：
, 百拇医药
MT(μg/g重组织)=(C样-C空)/C总×18.0×匀浆体积÷样品重量，其中18.0为加入样品中Cd完全饱和MT而得到的单位体积样品中MT的量，(0.2×2)/(6×112)×6050÷0.2=18.0(μg/ml)。
4.统计学处理：数据统计采用Student's t检验
二、结果
1.剂量效应关系：表1为不同剂量照射后16小时肝脏MT含量的变化，除 0.5 Gy照射组MT略低于假照射组外，1～6 Gy照射肝脏MT含量随剂量增加而增加，并且2、4、6 Gy照射后肝脏MT水平明显高于假照射组(分别P<0.05，P<0.01)。
表1 X射线照射后16小时小鼠肝脏MT含量的变化
剂量分组(Gy)
, 百拇医药
MT(μg/g重组织)
假照射
14.36±3.02
0.5
12.39±2.02
1.0
19.53±6.83
2.0
24.10±4.30*
4.0
34.24±3.03**
6.0
, 百拇医药
39.66±5.17**
注：
±s,n=5(6.0 Gy组n=3);与假照射组比较 *P<0.05；**P<0.01
2.时程：小鼠经4 Gy X射线全身照射后不同时间肝脏MT含量的变化，见图1。
图1 小鼠经4 Gy X射线照射后不同时间肝脏MT含量的变化
注：±s,n=5；与假照射组比较*P<0.05；**P<0.01
由图1所见，4 Gy X射线照射后4小时小鼠肝脏MT含量开始升高，24小时达高峰。以后逐渐下降，至照射后72小时肝脏MT仍较对照组高20%以上。
, 百拇医药
三、讨论
MT是细胞内富含巯基的金属结合蛋白，由于其独特的结构及功能的多样性，已引起了国内、外学者的普遍重视。在既往的研究中，学者们主要对MT的重金属解毒功能和抗氧化损伤作用等进行了深入的研究，但有关辐射对MT表达的影响研究较少。Shiraishi等[3，4]最早报道了辐射能明显增加小鼠肝脏、肾脏MT含量，并证实照射后MT含量升高是由于MT合成增加，而非降解减少所致。本实验发现2～6 Gy X射线照射可明显增加小鼠肝脏MT的合成，并随剂量的增加而增加，但辐射不能诱导脾脏、肾脏MT的合成(未发表资料)。4 Gy X射线照射小鼠肝脏MT含量4小时开始增加，24小时达高峰，以后逐渐下降，时程变化与国外报道基本相同。Koropatnick等[5]亦证实肝脏MT含量与照射剂量呈正相关，80 Gy照射后肝脏MT含量可达对照组的十几倍，但肾脏MT含量未见升高。辐射亦不能诱导体外培养的细胞合成MT。有人用切除肾上腺的小鼠做实验证实X射线诱导肝MT合成与内源性糖皮质激素无关[6]，这些都表明辐射使肝MT增加可能是由某些体液因子介导的间接过程。
, 百拇医药
虽然人们对MT做了大量研究，但MT确切的生物学功能尚不十分清楚，由于其普遍存在于生物界，并能对许多有毒因素强烈应答，表明MT在许多应激过程乃至病理过程中起重要作用，其可能是一类非特异的保护性蛋白质。有人给小鼠腹腔注射Zn或Cd使肝MT增加可明显降低其死亡率[7]。方兴旺等[8]证实MT能有效地清除.OH自由基，保护DNA免受辐射损伤的作用，并促进DNA损伤的修复。由此推断小鼠全身照射后肝脏MT水平的升高可能与机体的应激状态和抗辐射损伤过程有密切关系。
参考文献
1 Hamer DH. Metallothionein. Ann Rev Bio-chem, 1986,55:913-915.
2 Shiraishi N, Hayashi H, Hiraki Y. Elevation in metallothionein massenger RNA in tissues after exposure to X-irradiation.Toxicol Appl Pharmacol,1989,98:501-506.
, 百拇医药
3 Shiraishi N,Yamamoto Y,Takeda Y.Increased metallothionein content in rat liver and kidney following X-irradiation.Toxicol Appl Pharmacol,1986,85:128-134.
4 Shiraishi N,Aono K,Utsumi K.Increased metallothionein content in rat liver induced by X-irradiation and exposure to high oxygen tension.Radiat Res,1983,95:298-302.
5 David L,Brian F.Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assay for the rapid determination of metallothionein in biological tissues.Toxicol Appl Pharmacol,1982,66:134-142.
, 百拇医药
6 Koropatnick J,Leibbrandt M,Cherian MG.Organ-specific metallothionein induction in mice by X irradiation.Radiat Rev,1989,119:356-365.
7 Matsubara J, Tajima Y,Karawa M.Risk analysis of multiple environmental factors:radiation,zinc,cadmium,and calcium.Environ Res,1987,43:66-74.
8 方兴旺，吴季兰，魏根栓.金属硫蛋白对胸腺嘧啶的辐射保护作用.辐射研究与辐射工艺学报，1994，12：1-6.
(收稿:1998-10-08 修回:1999-03-09), 百拇医药
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990420
金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于体内、富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白，具有重金属解毒、调节机体应激反应及必需微量元素代谢等重要功能。重金属、INF、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)及化学毒物等多种物质均可诱导MT合成、并产生交叉抗性[1]。近来，研究发现电离辐射亦可诱导组织合成MT，但所见报道有限[2-4]。为了进一步研究辐射对MT表达的影响，作者采用了109Cd饱和法对全身X射线照射小鼠肝脏MT含量的变化进行了研究。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.动物：雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g，购于白求恩医科大学实验动物部。
2.照射条件：应用Philips深部X射线治疗机，电压200 kV，电流10 mA，滤过板 0.5 mmCu+1.0 mmAl，全身单次照射，吸收剂量率为 0.287 Gy/min。时程实验：吸收剂量为 4 Gy，照射后 0.5、2、4、8、16、24、48及72小时断头处死动物，取肝脏制成匀浆；剂量效应关系实验：设0.5、1、2、4及6 Gy照射组及假照射组，每组10只小鼠，照射后16小时断头处死动物，取肝脏制成匀浆。
3.组织MT的测定[5]：取大约 1 g肝脏，加4倍体积的 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆1～2分钟，10 000 g离心10 分钟，上清液沸水浴2分钟，冷却，10 000 g离心5分钟，以除去变性蛋白，上清液适当稀释5～10倍，取 200 μl稀释液置于 1.5 ml离心管中，加入 200 μl用 10 mmol/L Tris-HCl配制的 2.0 μg/ml CdCl2和放射性浓度为3.7×104 Bq/ml 109Cd的混合液，混匀后室温放置10分钟，然后加入 100 μl 2%牛血红蛋白溶液，混匀沸水加热2分钟，冷却后 10 000 g离心10分钟，再加入2%牛血红蛋白溶液 100 μl，加热、冷却、离心使变性血红蛋白紧贴于管壁，将上清液转入放免管进行放射性计数。空白管用 10 mmol/L Tris-HCl代替匀浆液；总放射性管用 10 mmol/L Tris-HCl代替血红蛋白。样品MT含量为：
, 百拇医药
MT(μg/g重组织)=(C样-C空)/C总×18.0×匀浆体积÷样品重量，其中18.0为加入样品中Cd完全饱和MT而得到的单位体积样品中MT的量，(0.2×2)/(6×112)×6050÷0.2=18.0(μg/ml)。
4.统计学处理：数据统计采用Student's t检验
二、结果
1.剂量效应关系：表1为不同剂量照射后16小时肝脏MT含量的变化，除 0.5 Gy照射组MT略低于假照射组外，1～6 Gy照射肝脏MT含量随剂量增加而增加，并且2、4、6 Gy照射后肝脏MT水平明显高于假照射组(分别P<0.05，P<0.01)。
表1 X射线照射后16小时小鼠肝脏MT含量的变化
剂量分组(Gy)
, 百拇医药
MT(μg/g重组织)
假照射
14.36±3.02
0.5
12.39±2.02
1.0
19.53±6.83
2.0
24.10±4.30*
4.0
34.24±3.03**
6.0
, 百拇医药
39.66±5.17**
注：
±s,n=5(6.0 Gy组n=3);与假照射组比较 *P<0.05；**P<0.012.时程：小鼠经4 Gy X射线全身照射后不同时间肝脏MT含量的变化，见图1。
图1 小鼠经4 Gy X射线照射后不同时间肝脏MT含量的变化
注：
±s,n=5；与假照射组比较*P<0.05；**P<0.01由图1所见，4 Gy X射线照射后4小时小鼠肝脏MT含量开始升高，24小时达高峰。以后逐渐下降，至照射后72小时肝脏MT仍较对照组高20%以上。
, 百拇医药
三、讨论
MT是细胞内富含巯基的金属结合蛋白，由于其独特的结构及功能的多样性，已引起了国内、外学者的普遍重视。在既往的研究中，学者们主要对MT的重金属解毒功能和抗氧化损伤作用等进行了深入的研究，但有关辐射对MT表达的影响研究较少。Shiraishi等[3，4]最早报道了辐射能明显增加小鼠肝脏、肾脏MT含量，并证实照射后MT含量升高是由于MT合成增加，而非降解减少所致。本实验发现2～6 Gy X射线照射可明显增加小鼠肝脏MT的合成，并随剂量的增加而增加，但辐射不能诱导脾脏、肾脏MT的合成(未发表资料)。4 Gy X射线照射小鼠肝脏MT含量4小时开始增加，24小时达高峰，以后逐渐下降，时程变化与国外报道基本相同。Koropatnick等[5]亦证实肝脏MT含量与照射剂量呈正相关，80 Gy照射后肝脏MT含量可达对照组的十几倍，但肾脏MT含量未见升高。辐射亦不能诱导体外培养的细胞合成MT。有人用切除肾上腺的小鼠做实验证实X射线诱导肝MT合成与内源性糖皮质激素无关[6]，这些都表明辐射使肝MT增加可能是由某些体液因子介导的间接过程。
, 百拇医药
虽然人们对MT做了大量研究，但MT确切的生物学功能尚不十分清楚，由于其普遍存在于生物界，并能对许多有毒因素强烈应答，表明MT在许多应激过程乃至病理过程中起重要作用，其可能是一类非特异的保护性蛋白质。有人给小鼠腹腔注射Zn或Cd使肝MT增加可明显降低其死亡率[7]。方兴旺等[8]证实MT能有效地清除.OH自由基，保护DNA免受辐射损伤的作用，并促进DNA损伤的修复。由此推断小鼠全身照射后肝脏MT水平的升高可能与机体的应激状态和抗辐射损伤过程有密切关系。
参考文献
1 Hamer DH. Metallothionein. Ann Rev Bio-chem, 1986,55:913-915.
2 Shiraishi N, Hayashi H, Hiraki Y. Elevation in metallothionein massenger RNA in tissues after exposure to X-irradiation.Toxicol Appl Pharmacol,1989,98:501-506.
, 百拇医药
3 Shiraishi N,Yamamoto Y,Takeda Y.Increased metallothionein content in rat liver and kidney following X-irradiation.Toxicol Appl Pharmacol,1986,85:128-134.
4 Shiraishi N,Aono K,Utsumi K.Increased metallothionein content in rat liver induced by X-irradiation and exposure to high oxygen tension.Radiat Res,1983,95:298-302.
5 David L,Brian F.Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assay for the rapid determination of metallothionein in biological tissues.Toxicol Appl Pharmacol,1982,66:134-142.
, 百拇医药
6 Koropatnick J,Leibbrandt M,Cherian MG.Organ-specific metallothionein induction in mice by X irradiation.Radiat Rev,1989,119:356-365.
7 Matsubara J, Tajima Y,Karawa M.Risk analysis of multiple environmental factors:radiation,zinc,cadmium,and calcium.Environ Res,1987,43:66-74.
8 方兴旺，吴季兰，魏根栓.金属硫蛋白对胸腺嘧啶的辐射保护作用.辐射研究与辐射工艺学报，1994，12：1-6.
(收稿:1998-10-08 修回:1999-03-09), 百拇医药