中国人阿耳茨海默病早老素-1基因测序一例
作者：廖瑜 顾其华 赵帆 赵伟强 张爱玉
单位：廖瑜(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；赵帆(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；张爱玉(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；顾其华(分子遗传室)；赵伟强(Department of Molecular Biology, Tulane University, U.S.A)
关键词：
中华医学遗传学杂志000224 阿耳茨海默病(Alzheimer's disease, AD)可分为早发性、晚发性家族性AD(familial Alzheimer's disease, FAD)和散发性AD(sporadic Alzheimer's disease, SAD)。国外研究发现，70%～80%的早发性FAD与Presenilin-1(PS-1)基因突变有关[1]。我们在一个FAD家系患者中发现了外显子46519nt T→A杂合性点突变，报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 检测对象 先证者，女，47岁，1993年因进行性智能障碍来我院就医，诊断为FAD[2]。2例SAD患者系本院住院患者，均符合美国精神疾病诊断统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)和史玉泉主编《实用神经病学》第2版诊断标准)。6例多发性脑梗塞痴呆患者及10名正常人。
1.2 材料及仪器 2400型PCR仪、310型DNA测序仪为美国Perkin-Elmer公司产品，扩增用Taq DNA聚合酶等为加拿大产品，上海协恒公司提供；引物由美国杜兰大学 (Tulane University)分子生物学教研室提供；DNA提取试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.3 聚合酶链反应-测序方法 抽肘静脉血0.5 ml，用EDTA Na2抗凝，静置分层，吸取界面白细胞层，用STMT溶血，离心，收集白细胞核沉渣，蛋白酶K-消化缓冲液消化，苯酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，超纯水溶解供扩增用。DNA体外扩增及测序引物为：含外显子2的引物序列5′-ACTAAC-AATGGATGACCTGGTGAAATC-3′、3′-ACGGTCTGACCT-AAGTGAATAGTAGAG-5′和含外显子3、4的引物序列5′-CGTTACCTTGATTCTGCTGAGAATCTG-3′、3′-CAGTAG- TAGTGGAACTTCCGGAGACGT-5′。PCR条件为：96℃预变性7 min，94℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72℃延伸90 s，循环35次，最后72℃ 7 min充分延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下鉴定产物质量。直接从凝胶中回收、纯化产物。取纯化后模板200ng做测序反应：采用双脱氧末端终止法荧光标记(末端标记)，反应条件为96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环。标记产物用酒精沉淀纯化，收集沉淀，待充分干燥后加TSR溶解，混匀。95℃变性分散2 min，迅速取出置于冰上冷却，将处理好的样品上310型DNA测序仪进行测序。
, 百拇医药
2 结果
2例SAD及6例多发性脑梗塞痴呆患者，以及10名正常人PS-1基因外显子2、3和4序列无一突变(图1)。FAD的PS-1基因第4外显子6519nt发现T→A杂合性点突变(图2)，结果如下：6519nt：5′-GAGCCATTATCTAAT-3′，5′-GAGCCA-ATATCTAAT-3′。
图1 SAD患者、多发性脑梗塞痴呆患者及正常人PS-1基因序列片段箭头所指
为外显子46519nt碱基位置
图2 FAD患者PS-1基因序列 箭头所示为外显子46519nt杂合性点突变位置
3 讨论
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位于14q24.3的PS-1基因突变，目前国外报道已有24种[3]。我们这次发现的是外显子4 6519nt T→A。6519nt T→A突变可能位于某一密码子的第1～3个碱基，能产生TTA(Leu)→ATA(Ile)、ATT(Ile)→AAT(Asn)，CAT(His)→CAA(Gln)等3种错义突变。PS-1蛋白的确切分子结构目前尚不清楚，推测PS-1基因编码一个由467个氨基酸组成的蛋白质[4]。Bours等研究发现：在含有NFT的神经元中，PS-1表达明显减少。提示PS-1的缺乏可能与神经退化的易感性有关。我们的研究发现：突变发生在PS-1的高度保守结构中，而在SAD与其他对照组中未发现突变。因而认为发生在此处的突变可能为病理突变，PS-1基因可能是早发性FAD的相关基因。
患者PS-1基因外显子4 6519nt A→T突变为杂合性点突变。提示FAD的遗传方式为常染色体显性遗传。另外，本家系具有发病年龄早、合并耳聋这两大特点，这在已报道的家系病例中罕见。可能是PS-1基因外显子4 6519nt T→A携带者临床表型的特点。
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参考文献
[1]Bouras C, Giannakopoulos P, Schioi J, et al. Presenilin-1 polymorphism and Alzheimer's disease. Lancet, 1996, 347(9009)∶1185-1186.
[2]廖瑜，赵帆.家族性阿耳茨海默病八例.中华医学遗传学杂志，1994，11(6)∶371.
[3]汤国梅，江三多.Presenilin 1基因研究进展.国外医学遗传学分册，1998，21(4)∶183-187.
[4]Li JH, Xu M, Zhou H. Alzheimer's presenilins in the nuclear membrane, interphase kinetochores, and centrosomes suggest a role in chromosome segregation. Cell, 1997, 90∶917-927.
收稿日期：1999-01-18, http://www.100md.com
单位：廖瑜(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；赵帆(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；张爱玉(418000 湖南省怀化市，衡阳医学院附属怀化医院神经内科)；顾其华(分子遗传室)；赵伟强(Department of Molecular Biology, Tulane University, U.S.A)
关键词：
中华医学遗传学杂志000224 阿耳茨海默病(Alzheimer's disease, AD)可分为早发性、晚发性家族性AD(familial Alzheimer's disease, FAD)和散发性AD(sporadic Alzheimer's disease, SAD)。国外研究发现，70%～80%的早发性FAD与Presenilin-1(PS-1)基因突变有关[1]。我们在一个FAD家系患者中发现了外显子46519nt T→A杂合性点突变，报告如下。
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1 材料与方法
1.1 检测对象 先证者，女，47岁，1993年因进行性智能障碍来我院就医，诊断为FAD[2]。2例SAD患者系本院住院患者，均符合美国精神疾病诊断统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)和史玉泉主编《实用神经病学》第2版诊断标准)。6例多发性脑梗塞痴呆患者及10名正常人。
1.2 材料及仪器 2400型PCR仪、310型DNA测序仪为美国Perkin-Elmer公司产品，扩增用Taq DNA聚合酶等为加拿大产品，上海协恒公司提供；引物由美国杜兰大学 (Tulane University)分子生物学教研室提供；DNA提取试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.3 聚合酶链反应-测序方法 抽肘静脉血0.5 ml，用EDTA Na2抗凝，静置分层，吸取界面白细胞层，用STMT溶血，离心，收集白细胞核沉渣，蛋白酶K-消化缓冲液消化，苯酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，超纯水溶解供扩增用。DNA体外扩增及测序引物为：含外显子2的引物序列5′-ACTAAC-AATGGATGACCTGGTGAAATC-3′、3′-ACGGTCTGACCT-AAGTGAATAGTAGAG-5′和含外显子3、4的引物序列5′-CGTTACCTTGATTCTGCTGAGAATCTG-3′、3′-CAGTAG- TAGTGGAACTTCCGGAGACGT-5′。PCR条件为：96℃预变性7 min，94℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72℃延伸90 s，循环35次，最后72℃ 7 min充分延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下鉴定产物质量。直接从凝胶中回收、纯化产物。取纯化后模板200ng做测序反应：采用双脱氧末端终止法荧光标记(末端标记)，反应条件为96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环。标记产物用酒精沉淀纯化，收集沉淀，待充分干燥后加TSR溶解，混匀。95℃变性分散2 min，迅速取出置于冰上冷却，将处理好的样品上310型DNA测序仪进行测序。
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2 结果
2例SAD及6例多发性脑梗塞痴呆患者，以及10名正常人PS-1基因外显子2、3和4序列无一突变(图1)。FAD的PS-1基因第4外显子6519nt发现T→A杂合性点突变(图2)，结果如下：6519nt：5′-GAGCCATTATCTAAT-3′，5′-GAGCCA-ATATCTAAT-3′。
图1 SAD患者、多发性脑梗塞痴呆患者及正常人PS-1基因序列片段箭头所指
为外显子46519nt碱基位置
图2 FAD患者PS-1基因序列 箭头所示为外显子46519nt杂合性点突变位置
3 讨论
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位于14q24.3的PS-1基因突变，目前国外报道已有24种[3]。我们这次发现的是外显子4 6519nt T→A。6519nt T→A突变可能位于某一密码子的第1～3个碱基，能产生TTA(Leu)→ATA(Ile)、ATT(Ile)→AAT(Asn)，CAT(His)→CAA(Gln)等3种错义突变。PS-1蛋白的确切分子结构目前尚不清楚，推测PS-1基因编码一个由467个氨基酸组成的蛋白质[4]。Bours等研究发现：在含有NFT的神经元中，PS-1表达明显减少。提示PS-1的缺乏可能与神经退化的易感性有关。我们的研究发现：突变发生在PS-1的高度保守结构中，而在SAD与其他对照组中未发现突变。因而认为发生在此处的突变可能为病理突变，PS-1基因可能是早发性FAD的相关基因。
患者PS-1基因外显子4 6519nt A→T突变为杂合性点突变。提示FAD的遗传方式为常染色体显性遗传。另外，本家系具有发病年龄早、合并耳聋这两大特点，这在已报道的家系病例中罕见。可能是PS-1基因外显子4 6519nt T→A携带者临床表型的特点。
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参考文献
[1]Bouras C, Giannakopoulos P, Schioi J, et al. Presenilin-1 polymorphism and Alzheimer's disease. Lancet, 1996, 347(9009)∶1185-1186.
[2]廖瑜，赵帆.家族性阿耳茨海默病八例.中华医学遗传学杂志，1994，11(6)∶371.
[3]汤国梅，江三多.Presenilin 1基因研究进展.国外医学遗传学分册，1998，21(4)∶183-187.
[4]Li JH, Xu M, Zhou H. Alzheimer's presenilins in the nuclear membrane, interphase kinetochores, and centrosomes suggest a role in chromosome segregation. Cell, 1997, 90∶917-927.
收稿日期：1999-01-18, http://www.100md.com