斑点-ELISA检测AFP
作者：黄保军 汪红俊 李瑞珠
单位：安徽医科大学免疫学教研室，合肥 230032
关键词：纤维素；甲胎蛋白类；分析；酶联免疫吸附测定
安徽医科大学学报000403
摘要 目的 探讨硝酸纤维素膜为固相载体的酶免疫测定法检测甲胎蛋白(AFP)。方法 以硝酸纤维素膜代替常规ELISA中的固相载体聚苯乙烯板，其余步骤按ELISA方法操作。结果 以AFP标准品作试验，进行方法学探索，测出最佳包被抗体浓度为100 mg.L-1,酶标抗体稀释度为1∶4 000。不同来源不同孔径的硝酸纤维素膜无差异；同时发现包被过程中的封闭处理能减少非特异性反应；保存试验证明包被抗体的硝酸纤维素膜至少可保存2周。结论 该法具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点，通过与常规ELISA检测血清标本AFP含量值的比较，表明该法可半定量测定AFP的含量，尤其适用于标本的初步筛选。
, http://www.100md.com
自由词 硝酸纤维素膜
中图分类号 R446.61；R73-3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0253-03
Application of detecting AFP of dot-ELISA
Huang Baojun, Wang Hongjun, Li Ruizhu
(Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective The enzyme immunoassay in which the solid state carrier is served as the nitrocellulose membrane was used to detect α-fetoprotein (AFP). Methods The solid state carrier with nitrocellulose membrane substituting for polystyrene plate among the convention ELISA, the other step was operated according to ELISAs method. Results The optimum bundle by antibody consistency was 100 mg.L-1, and enzyme linked antibody of dilution 1∶4 000. The experiment indicates that the nitrocellulose membrane of different apertures and different sources did not have clear difference. The quench could reduce the nonspecific reaction by wrapping. Preserving experiment proved that the nitrocellulose membrane wrapped by antibody could be stored at least two weeks.Conclusion Experiment proves that this method possesses good specialties, repetitions and high sensitivity. Compared with convention ELISAs checkout serum specimen AFPs content value, it is suggested that this method can measure the content of AFP quantitively, particularly suitable for the specimen screen.
, http://www.100md.com
MeSH cellulose; alpha-fetoproteins/analysis; enzyme-linked immunosorbent assay
Free word nitrocellulose membrane
斑点-ELISA近年来已广泛用于临床上各种标本的测定〔1～3〕。其原理是利用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体，使抗原抗体反应在膜上进行，结合在硝酸纤维素膜上的酶抗体结合物通过将底物分解成不溶性的产物而沉积，在硝酸纤维素膜上形成斑点。待测抗原或抗体含量的高低可通过膜上斑点颜色的深浅来判断。由于斑点-ELISA具有特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器、操作简便等优点，近年来在基础医学研究和临床检验等领域得到迅速发展和广泛的应用。本文试用斑点-ELISA检测血清标本甲胎蛋白(AFP)的含量，并对实验有关问题进行探讨，现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 材料 AFP标准品，批号940922，含量为400 μg.L-1，上海生物制品研究所；马抗人AFP抗体，批号940701，蛋白含量为36 g.L-1，上海生物制品研究所；辣根过氧化物酶，批号940411，上海丽珠东风生物技术有限公司；硝酸纤维素膜：浙江四青生化材料厂(孔径分别为0.22、0.3、0.45 μm)，北京化工学校(孔径分别为0.22、0.3 μm)，Sigma公司(孔径为0.3 μm)；显色剂：二氨基联苯胺四盐酸(批号931014，北京化工厂)30 mg溶于40 ml pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，避光搅拌3 h过滤，临用前加入H2O2，终浓度为0.1%。
1.2 酶标马抗人AFP抗体的制备 采用改良过碘酸钠法，作HRP标记马抗人AFP抗体，小量分装，-30℃冻存。
1.3 双抗体夹心斑点-ELISA法 按照沈大康等〔4〕报道的方法并做改良。将硝酸纤维素膜切割成条状，画上格子，用pH 7.4的PBS浸泡10 min，室温干燥后在每格中央点加100 mg.L-1的抗AFP抗体2 μl，室温放置1 h使抗体蛋白与膜条充分结合，然后放置于10%小牛血清中孵育2 h以封闭膜条上剩余的蛋白质结合位点，PBS洗涤后于4℃或-20℃保存。检测标本时，在膜上每格中央滴加不同浓度的AFP标准品或待检血清标本2 μl，孵育1 h后，用含0.05%吐温的PBS振荡洗涤5 min×3次，然后将膜条置于1∶4 000稀释的酶标抗体中孵育30 min，同上洗涤后将膜条置于新鲜配制的显色剂中，室温避光5 min流水冲洗终止反应。1.4 结果观察 结果目测，阴性反应膜条不显色，如在膜上出现棕色的染色斑点，即为阳性反应，并且斑点颜色的深浅随血清标本中AFP含量的高低而变化。
, 百拇医药
1.5 常规ELISA检测血清标本AFP的含量 试剂盒购自上海生物制品研究所，按说明书操作。
2 结果
2.1 检测系统条件的确定
2.1.1 包被抗体浓度的选择 分别用200、100、50、25 mg.L-1的抗AFP抗体包被硝酸纤维素膜，与含量分别为400、200、100、50、25 μg.L-1的AFP标准品做方阵滴定，同时设立阴性对照及空白对照。当包被抗体浓度为100 mg.L-1，随着样本AFP含量的减少，膜条显色依次递减，结果最佳，故选用100 mg.L-1的抗AFP抗体为包被浓度(表1)。
表1 包被抗体浓度的选择 包被抗体的浓度
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(mg.L-1)
甲胎蛋白含量(μg.L-1)
400
200
100
50
25
阴性对照
200
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100
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50
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25
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注：“#、、”代表膜条斑点显色的深浅；“-”代表膜条不显色
, 百拇医药
2.1.2 酶标抗体最适稀释度的选择 将酶标抗AFP抗体从1∶1 000起倍比稀释至1∶8 000，分别与AFP标准品及阴性对照进行测定，发现当酶标抗AFP抗体稀释度为1∶4 000时，阳性的膜条呈明显的棕色而阴性对照不显色，故选1∶4 000为酶标抗体的稀释度。
2.1.3 不同封闭条件的影响 用10%小牛血清、10%兔血清、1% BSA分别对膜条进行封闭并比较，结果表明均能满意地封闭膜条上的剩余的蛋白质结合位点。因此，实际工作中我们选用10%小牛血清作为封闭剂。
2.1.4 不同膜的比较 经过对浙江四青公司、北京化工学校和Sigma公司生产的不同孔径的硝酸纤维素膜的比较，各种膜之间在敏感性、特异性及背景颜色方面无显著差异，但北京产品较薄，试验过程中易于划痕，浙江产0.3 μm的硝酸纤维素膜质地较厚，点样不易扩散，吸附蛋白质性能好。
2.2 方法学考察
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2.2.1 灵敏度与重复性 在确定的最佳试验条件下，用AFP标准品重复试验，可见随着AFP含量的增加，硝酸纤维素膜显色也逐渐加深，在AFP含量为50 μg.L-1时，膜条显色为浅棕色，与阴性对照对比明显。结果如表2所示，表明该法的检测灵敏度可达50 μg.L-1。
表2 甲胎蛋白含量与硝酸纤维素膜显色的关系 AFP含量
(μg.L-1)
400
200
100
50
25
, 百拇医药
阴性对照
膜条显色深浅
#
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2.2.2 特异性 以pH 7.4 PBS代替抗AFP抗体包被硝酸纤维素膜，测定不同浓度的AFP标准抗原，结果硝酸纤维素膜上无斑点显示。用该法重复3次以上检测正常人血清3份，均为阴性。
2.2.3 稳定性 硝酸纤维素膜经抗AFP抗体包被、10%小牛血清封闭、洗涤印干后分为3组，分别于即刻及在4℃放置1、2周后进行实验，检测AFP标准品及阴性对照，实验表明3组结果完全相同。说明吸附抗体的硝酸纤维素膜至少能稳定地贮存2周。
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2.3 检测临床病人血清标本的结果 用斑点ELISA和常规ELISA同时检测10例临床血清标本，用斑点-ELISA检测时，每份血清标本均从原液～1∶16作倍比稀释后进行测定，以50 μg.L-1 AFP标准品为阳性对照，正常人血清为阴性对照。结果以硝酸纤维素膜呈浅棕色为反应终点，根据血清稀释度的分布，粗略计算其AFP的含量，并与常规ELISA测定的结果相比较，两者基本吻合(表3)。常规ELISA检测按操作说明书进行。3 讨论
AFP含量检测通常需要灵敏度较高的方法如RIA、ELISA等，由于RIA需要一些要求较高的条件和设备，因而在基层单位的广泛开展和普及就受到限制。而ELISA是目前公认的敏感而简便的免疫检测法，已广泛地用于临床各种标本的检测，特别是以硝酸纤维素膜为固相支持物的双抗体夹心斑点-ELISA法是一种灵敏而稳定的检测AFP的新技术。它具有简便、快速、稳定、省材料等优点〔5〕，尤其是它不需要任何复杂的条件设备也能半定量检测标本的含量，更适宜在基层单位推广和普及。表3 斑点-ELISA与常规ELISA检测临床
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病人血清标本结果的比较 组别
标本号
常规ELISA测定值
AFP含量(μg.L-1)
血清滴度
斑点ELISA计算值
AFP含量(μg.L-1)
肝癌
1
>400
>1∶8
, 百拇医药
>400
2
>400
>1∶8
>400
5
>400
>1∶8
>400
11
<25
-
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, 百拇医药
9
>400
>1∶8
>400
肝硬化
25
200
>1∶4
200
肝炎
16
50
原液
, 百拇医药 50
17
50
原液
50
鼻咽癌
20
<25
-
-
21
<25
-
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, 百拇医药
阳性对照
50
原液
50
阴性对照
<25
-
-
硝酸纤维素膜具有很强的结合蛋白质的能力，不需要溴化氰活化即能很稳定地与蛋白质结合。在本研究中，我们利用硝酸纤维素膜为固相载体建立了斑点-ELISA双抗体夹心法检测AFP。在硝酸纤维素膜上包被抗体点样后，经室温干燥处理，使抗AFP抗体在膜条上不过度扩散，才能斑点显色清晰。抗原抗体在微湿环境中起免疫反应，使膜条得以充分洗涤减少非特异性显色，以保证试验的准确性和敏感性；为消除膜载体的非特异性吸附，必须以较高浓度的牛血清白蛋白或异种动物血清封闭活性位点，并在加酶标抗体后，要在搅拌下充分振荡洗涤，否则膜条显色本底深，影响结果和敏感性。通过应用本法检测临床血清标本，结果显示正常人均为阴性，表明无非特异性。本法操作简便，所用抗体抗原量少，在5 mm×4 mm的膜条上，可操作8个标本，在膜上包被抗体的量仅为0.2 μg即能与50 μg.L-1的AFP反应出现肉眼辨别的棕色斑点，表明其敏感性优于聚苯乙烯板，与常规ELISA比较具有省时省力的特点；本法的另一显著优点是吸附了抗体的硝酸纤维素膜可长期保存，这也为实际工作提供了便利。
, http://www.100md.com
作者简介：黄保军，男，31岁，硕士，讲师
参考文献
1，娄文娴，俞安洲. 组合单克隆抗体夹心斑点-ELISA检测日本血吸虫循环抗原的研究. 上海免疫学杂志， 1995；15(3)：141～143
2，蒋燕群，倪语星. 用斑点-ELISA检测副溶血弧菌的耐热溶血毒(TDH)和TDH类似毒(TRH). 上海医学检验杂志， 1997；12(3)：143～144
3，Rahman H. Dot-ELISA for detection of Salmonella enterotoxin. Indian J Med Res, 1999;110(1):47～49
4，沈大康，娄文娴，郑志国. 夹心dot-ELISA检测钉螺体内血吸虫抗原的研究. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 1997；15(6)：353～355
5，Tapchaisri P, Wangroongsarb P, Panbangred W et al. Detection of Salmonella contamination in food samples by dot-ELISA, DNA amplification and bacterial culture. Asian Pac J Allergy Immunol, 1999;17(1):41～51
2000-04-04收稿，2000-06-01修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学免疫学教研室，合肥 230032
关键词：纤维素；甲胎蛋白类；分析；酶联免疫吸附测定
安徽医科大学学报000403
摘要 目的 探讨硝酸纤维素膜为固相载体的酶免疫测定法检测甲胎蛋白(AFP)。方法 以硝酸纤维素膜代替常规ELISA中的固相载体聚苯乙烯板，其余步骤按ELISA方法操作。结果 以AFP标准品作试验，进行方法学探索，测出最佳包被抗体浓度为100 mg.L-1,酶标抗体稀释度为1∶4 000。不同来源不同孔径的硝酸纤维素膜无差异；同时发现包被过程中的封闭处理能减少非特异性反应；保存试验证明包被抗体的硝酸纤维素膜至少可保存2周。结论 该法具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点，通过与常规ELISA检测血清标本AFP含量值的比较，表明该法可半定量测定AFP的含量，尤其适用于标本的初步筛选。
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自由词 硝酸纤维素膜
中图分类号 R446.61；R73-3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0253-03
Application of detecting AFP of dot-ELISA
Huang Baojun, Wang Hongjun, Li Ruizhu
(Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective The enzyme immunoassay in which the solid state carrier is served as the nitrocellulose membrane was used to detect α-fetoprotein (AFP). Methods The solid state carrier with nitrocellulose membrane substituting for polystyrene plate among the convention ELISA, the other step was operated according to ELISAs method. Results The optimum bundle by antibody consistency was 100 mg.L-1, and enzyme linked antibody of dilution 1∶4 000. The experiment indicates that the nitrocellulose membrane of different apertures and different sources did not have clear difference. The quench could reduce the nonspecific reaction by wrapping. Preserving experiment proved that the nitrocellulose membrane wrapped by antibody could be stored at least two weeks.Conclusion Experiment proves that this method possesses good specialties, repetitions and high sensitivity. Compared with convention ELISAs checkout serum specimen AFPs content value, it is suggested that this method can measure the content of AFP quantitively, particularly suitable for the specimen screen.
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MeSH cellulose; alpha-fetoproteins/analysis; enzyme-linked immunosorbent assay
Free word nitrocellulose membrane
斑点-ELISA近年来已广泛用于临床上各种标本的测定〔1～3〕。其原理是利用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体，使抗原抗体反应在膜上进行，结合在硝酸纤维素膜上的酶抗体结合物通过将底物分解成不溶性的产物而沉积，在硝酸纤维素膜上形成斑点。待测抗原或抗体含量的高低可通过膜上斑点颜色的深浅来判断。由于斑点-ELISA具有特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器、操作简便等优点，近年来在基础医学研究和临床检验等领域得到迅速发展和广泛的应用。本文试用斑点-ELISA检测血清标本甲胎蛋白(AFP)的含量，并对实验有关问题进行探讨，现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 材料 AFP标准品，批号940922，含量为400 μg.L-1，上海生物制品研究所；马抗人AFP抗体，批号940701，蛋白含量为36 g.L-1，上海生物制品研究所；辣根过氧化物酶，批号940411，上海丽珠东风生物技术有限公司；硝酸纤维素膜：浙江四青生化材料厂(孔径分别为0.22、0.3、0.45 μm)，北京化工学校(孔径分别为0.22、0.3 μm)，Sigma公司(孔径为0.3 μm)；显色剂：二氨基联苯胺四盐酸(批号931014，北京化工厂)30 mg溶于40 ml pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，避光搅拌3 h过滤，临用前加入H2O2，终浓度为0.1%。
1.2 酶标马抗人AFP抗体的制备 采用改良过碘酸钠法，作HRP标记马抗人AFP抗体，小量分装，-30℃冻存。
1.3 双抗体夹心斑点-ELISA法 按照沈大康等〔4〕报道的方法并做改良。将硝酸纤维素膜切割成条状，画上格子，用pH 7.4的PBS浸泡10 min，室温干燥后在每格中央点加100 mg.L-1的抗AFP抗体2 μl，室温放置1 h使抗体蛋白与膜条充分结合，然后放置于10%小牛血清中孵育2 h以封闭膜条上剩余的蛋白质结合位点，PBS洗涤后于4℃或-20℃保存。检测标本时，在膜上每格中央滴加不同浓度的AFP标准品或待检血清标本2 μl，孵育1 h后，用含0.05%吐温的PBS振荡洗涤5 min×3次，然后将膜条置于1∶4 000稀释的酶标抗体中孵育30 min，同上洗涤后将膜条置于新鲜配制的显色剂中，室温避光5 min流水冲洗终止反应。1.4 结果观察 结果目测，阴性反应膜条不显色，如在膜上出现棕色的染色斑点，即为阳性反应，并且斑点颜色的深浅随血清标本中AFP含量的高低而变化。
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1.5 常规ELISA检测血清标本AFP的含量 试剂盒购自上海生物制品研究所，按说明书操作。
2 结果
2.1 检测系统条件的确定
2.1.1 包被抗体浓度的选择 分别用200、100、50、25 mg.L-1的抗AFP抗体包被硝酸纤维素膜，与含量分别为400、200、100、50、25 μg.L-1的AFP标准品做方阵滴定，同时设立阴性对照及空白对照。当包被抗体浓度为100 mg.L-1，随着样本AFP含量的减少，膜条显色依次递减，结果最佳，故选用100 mg.L-1的抗AFP抗体为包被浓度(表1)。
表1 包被抗体浓度的选择 包被抗体的浓度
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(mg.L-1)
甲胎蛋白含量(μg.L-1)
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注：“#、
、”代表膜条斑点显色的深浅；“-”代表膜条不显色, 百拇医药
2.1.2 酶标抗体最适稀释度的选择 将酶标抗AFP抗体从1∶1 000起倍比稀释至1∶8 000，分别与AFP标准品及阴性对照进行测定，发现当酶标抗AFP抗体稀释度为1∶4 000时，阳性的膜条呈明显的棕色而阴性对照不显色，故选1∶4 000为酶标抗体的稀释度。
2.1.3 不同封闭条件的影响 用10%小牛血清、10%兔血清、1% BSA分别对膜条进行封闭并比较，结果表明均能满意地封闭膜条上的剩余的蛋白质结合位点。因此，实际工作中我们选用10%小牛血清作为封闭剂。
2.1.4 不同膜的比较 经过对浙江四青公司、北京化工学校和Sigma公司生产的不同孔径的硝酸纤维素膜的比较，各种膜之间在敏感性、特异性及背景颜色方面无显著差异，但北京产品较薄，试验过程中易于划痕，浙江产0.3 μm的硝酸纤维素膜质地较厚，点样不易扩散，吸附蛋白质性能好。
2.2 方法学考察
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2.2.1 灵敏度与重复性 在确定的最佳试验条件下，用AFP标准品重复试验，可见随着AFP含量的增加，硝酸纤维素膜显色也逐渐加深，在AFP含量为50 μg.L-1时，膜条显色为浅棕色，与阴性对照对比明显。结果如表2所示，表明该法的检测灵敏度可达50 μg.L-1。
表2 甲胎蛋白含量与硝酸纤维素膜显色的关系 AFP含量
(μg.L-1)
400
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阴性对照
膜条显色深浅
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2.2.2 特异性 以pH 7.4 PBS代替抗AFP抗体包被硝酸纤维素膜，测定不同浓度的AFP标准抗原，结果硝酸纤维素膜上无斑点显示。用该法重复3次以上检测正常人血清3份，均为阴性。
2.2.3 稳定性 硝酸纤维素膜经抗AFP抗体包被、10%小牛血清封闭、洗涤印干后分为3组，分别于即刻及在4℃放置1、2周后进行实验，检测AFP标准品及阴性对照，实验表明3组结果完全相同。说明吸附抗体的硝酸纤维素膜至少能稳定地贮存2周。
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2.3 检测临床病人血清标本的结果 用斑点ELISA和常规ELISA同时检测10例临床血清标本，用斑点-ELISA检测时，每份血清标本均从原液～1∶16作倍比稀释后进行测定，以50 μg.L-1 AFP标准品为阳性对照，正常人血清为阴性对照。结果以硝酸纤维素膜呈浅棕色为反应终点，根据血清稀释度的分布，粗略计算其AFP的含量，并与常规ELISA测定的结果相比较，两者基本吻合(表3)。常规ELISA检测按操作说明书进行。3 讨论
AFP含量检测通常需要灵敏度较高的方法如RIA、ELISA等，由于RIA需要一些要求较高的条件和设备，因而在基层单位的广泛开展和普及就受到限制。而ELISA是目前公认的敏感而简便的免疫检测法，已广泛地用于临床各种标本的检测，特别是以硝酸纤维素膜为固相支持物的双抗体夹心斑点-ELISA法是一种灵敏而稳定的检测AFP的新技术。它具有简便、快速、稳定、省材料等优点〔5〕，尤其是它不需要任何复杂的条件设备也能半定量检测标本的含量，更适宜在基层单位推广和普及。表3 斑点-ELISA与常规ELISA检测临床
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病人血清标本结果的比较 组别
标本号
常规ELISA测定值
AFP含量(μg.L-1)
血清滴度
斑点ELISA计算值
AFP含量(μg.L-1)
肝癌
1
>400
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肝炎
16
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鼻咽癌
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阳性对照
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阴性对照
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硝酸纤维素膜具有很强的结合蛋白质的能力，不需要溴化氰活化即能很稳定地与蛋白质结合。在本研究中，我们利用硝酸纤维素膜为固相载体建立了斑点-ELISA双抗体夹心法检测AFP。在硝酸纤维素膜上包被抗体点样后，经室温干燥处理，使抗AFP抗体在膜条上不过度扩散，才能斑点显色清晰。抗原抗体在微湿环境中起免疫反应，使膜条得以充分洗涤减少非特异性显色，以保证试验的准确性和敏感性；为消除膜载体的非特异性吸附，必须以较高浓度的牛血清白蛋白或异种动物血清封闭活性位点，并在加酶标抗体后，要在搅拌下充分振荡洗涤，否则膜条显色本底深，影响结果和敏感性。通过应用本法检测临床血清标本，结果显示正常人均为阴性，表明无非特异性。本法操作简便，所用抗体抗原量少，在5 mm×4 mm的膜条上，可操作8个标本，在膜上包被抗体的量仅为0.2 μg即能与50 μg.L-1的AFP反应出现肉眼辨别的棕色斑点，表明其敏感性优于聚苯乙烯板，与常规ELISA比较具有省时省力的特点；本法的另一显著优点是吸附了抗体的硝酸纤维素膜可长期保存，这也为实际工作提供了便利。
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作者简介：黄保军，男，31岁，硕士，讲师
参考文献
1，娄文娴，俞安洲. 组合单克隆抗体夹心斑点-ELISA检测日本血吸虫循环抗原的研究. 上海免疫学杂志， 1995；15(3)：141～143
2，蒋燕群，倪语星. 用斑点-ELISA检测副溶血弧菌的耐热溶血毒(TDH)和TDH类似毒(TRH). 上海医学检验杂志， 1997；12(3)：143～144
3，Rahman H. Dot-ELISA for detection of Salmonella enterotoxin. Indian J Med Res, 1999;110(1):47～49
4，沈大康，娄文娴，郑志国. 夹心dot-ELISA检测钉螺体内血吸虫抗原的研究. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 1997；15(6)：353～355
5，Tapchaisri P, Wangroongsarb P, Panbangred W et al. Detection of Salmonella contamination in food samples by dot-ELISA, DNA amplification and bacterial culture. Asian Pac J Allergy Immunol, 1999;17(1):41～51
2000-04-04收稿，2000-06-01修回, 百拇医药