L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织生长的影响
作者：陈永勤** 朱蔚华** 吴蕴祺 胡 秋
单位：中国协和医科大学药物研究所 北京 100050中国医学科学院
关键词：云南红豆杉；愈伤组织褐化；紫杉醇
中草药990732 摘 要 研究了不同化合物对褐化严重的云南红豆杉愈伤组织生长的影响。结果表明，在培养基中添加0.29 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸后能有效地抑制愈伤组织和培养基的褐化，显著改善愈伤组织的生长，并对紫杉醇的含量影响不大；桂皮酸浓度在0.30 mg/L以上时，则抑制愈伤组织的生长，但能提高其紫杉醇含量。
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物(Taxus L.)中分离出来的一个具有抗肿瘤活性的二萜生物碱，自1993年以来，已成为临床上治疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物。但由于红豆杉属植物资源十分有限，且生长非常缓慢，体内紫杉醇含量很低，所以紫杉醇的药源问题一开始就受到人们的高度关注，至今未得到很好的解决。用红豆杉属植物组织培养技术生产紫杉醇被认为是一种有潜力的方法，已成为研究热点，并取得一些进展[1]。但该研究仍处在试验阶段，还未见用此方法商业化生产紫杉醇的报道。
, 百拇医药
在进行红豆杉属植物组织培养时，愈伤组织的褐化是一个非常普遍的现象。褐化严重时，愈伤组织的生长会受到显著的抑制，甚至不能继代培养成功[2]。因此，寻找克服愈伤组织褐化的有效方法在红豆杉属植物组织培养的研究中具有非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 愈伤组织的诱导与培养：云南红豆杉Taxus yunnanensis当年生枝条洗净后，剪成小段，分别用70%乙醇消毒2 min和0.1% HgCl2消毒20 min。用无菌水漂洗6 次后，将茎段剪成长约1.5～2.0 cm的小段，斜插在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导；愈伤组织形成后，将愈伤组织转到增殖培养基上进行继代培养。
1.2 培养条件：基本培养基为B5培养基[3]的无机成分，100.0 mg/L肌醇、1.25 mg/L烟酸、1.0 mg/L维生素B1、0.5 mg/L维生素B6、20.0 g/L蔗糖、6-苄基氨基嘌呤(BAP)0.1 g/L、1.0～3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和8.0 g/L琼脂。愈伤组织诱导培养基中加有1.0 g/L水解乳蛋白，增殖培养基同基本培养基，2，4-D浓度为1.0 mg/L。后来为了改善一些褐化严重的愈伤组织系的生长，在培养基中分别添加了1.0 g/L的水解乳蛋白、1.0 g/L蛋白胨、1.0 g/L水解酪蛋白、1.5%聚乙烯吡咯烷酮、100.0 mg/L抗坏血酸、0.29 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸。所有培养基的pH值均为5.8。除抗坏血酸、L-谷氨酰胺和桂皮酸为过滤灭菌外，其余培养基成分均为高温灭菌。
, 百拇医药
试验在黑暗中进行，培养室温度为(22±2)°C。
1.3 愈伤组织生长量和紫杉醇含量的测定：愈伤组织生长量以生长指数表示。在本试验中，生长指数=(收获愈伤组织干重-接种愈伤组织干重)/接种愈伤组织干重。
愈伤组织中紫杉醇含量的测定按Wu等[4]建立的HPLC法进行。色谱柱为Plantinum C18柱，流动相为甲醇-乙腈-水(25∶35∶45)，流速为1.0 mL/min，检测波长为227 nm。用外标法计算样品中紫杉醇含量，以干重百分比表示。
2 结果
2.1 愈伤组织的诱导和培养：在本试验的诱导条件下，来自5株云南红豆杉的茎段都比较容易形成愈伤组织，诱导成功率均在80%以上。将所形成的愈伤组织转到增殖培养基上以后，有3个愈伤组织系褐化程度较轻，一直增殖较好，但另两个(TY6和TY5)在继代培养6个月后发生严重褐化，愈伤组织和培养基均呈深褐色至棕红色，长势显著减弱。虽然其新生的组织为淡黄色，但不久就变成棕褐色、老化、停止增殖。
, http://www.100md.com
为了改善一些褐化严重的TY6和TY5愈伤组织系的生长，在培养基中分别添加了水解乳蛋白、蛋白胨、水解酪蛋白(各 1 g/L)、1.5%聚乙烯吡咯烷酮或100.0 mg/L抗坏血酸。这些物质均不能有效地抑制这两个愈伤组织系的褐化。但添加0.15～0.29 mg/L L-谷氨酰胺的培养基上，这两个愈伤组织系的生长周期延长、颜色变浅、增殖较多。通过挑选新生的、颜色浅的愈伤组织块进行继代，经过3至4次继代培养就可形成生长良好的愈伤组织系。在有谷氨酰胺时，添加一定浓度(0.15～0.22 mg/L)的桂皮酸能有效地抑制愈伤组织和培养基变红，并能改善愈伤组织的生长。
2.2 L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织系(TY6)生长和紫杉醇含量的影响：将原来在加有谷氨酰胺的增殖培养基上继代生长的TY6愈伤组织再转到无谷氨酰胺的培养基上后，其生长速率有所下降，而且培养基的棕红色较深；而在有谷氨酰胺(0.15 mg/L和0.29 mg/L)的培养基上，愈伤组织增殖很好，培养基的棕红色较浅。同无谷氨酰胺的处理相比，有谷氨酰胺的处理的紫杉醇含量有所下降，但不显著。
, 百拇医药
在无谷氨酰胺时，0.15 mg/L的桂皮酸对TY6愈伤组织的生长有强烈的抑制作用；在有谷氨酰胺时，较低浓度(0.074～0.22 mg/L)的桂皮酸对愈伤组织的生长有一定的促进作用，但浓度达到0.30 mg/L和更高时则抑制愈伤组织的生长，培养基变红的程度随桂皮酸浓度的增加而减轻。当浓度达到0.22 mg/L时，培养基变红的现象完全被抑制。虽然高浓度的桂皮酸会抑制愈伤组织的生长，但可提高愈伤组织中紫杉醇的含量(表1)。
表1 L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织系(TY6)生长和紫杉醇含量的影响 处 理
收获干愈伤组织
(g/L)
生长指数
紫杉醇含量
(%)
, 百拇医药
紫杉醇产量
(mg/L)
谷氨酰胺(mg/L)
桂皮酸(mg/L)
0.0
0.0
9.67±1.04
1.132±0.276a
0.0218±0.0017a
2.11
0.15
0.0
, http://www.100md.com
12.21±0.98
1.238±0.178a
0.0207±0.0014a
2.53
0.29
0.0
12.42±1.15
1.331±0.183a
0.0210±0.0016a
2.56
0.0
, 百拇医药
0.15
6.85±0.77
0.787±0.315a
0.0389±0.0008b
2.66
0.29
0.074
11.80±0.72
1.405±0.238a
0.0189±0.0018a
2.23
, 百拇医药
0.29
0.15
11.90±1.02
1.366±0.355a
0.0191±0.0011a
2.28
0.29
0.22
11.38±1.03
1.187±0.191a
0.0237±0.0014c
, http://www.100md.com
2.70
0.29
0.30
9.60±0.92
0.884±0.169a
0.0278±0.0021c
2.67
0.29
0.44
7.23±1.48
0.412±0.238b
, http://www.100md.com
0.0355±0.0013b
2.57
注：数据为
±s。生长数据n=6，紫杉醇含量和产量的n=3。数据间的差异性用LSR测验，P<0.05，具有相同字母的数据表示相互之间没有显著性差异。
谷氨酰胺和桂皮酸克服愈伤组织的褐化和促进生长的作用在TY5愈伤组织系上也得到了证实(资料略)。
3 讨论
用红豆杉属植物细胞大规模培养方法商业化生产紫杉醇是当今植物次生代谢研究中的一个热点。因为红豆杉属植物细胞培养都是用愈伤组织建立起来的，所以维持愈伤组织的长期培养是该研究的基础。愈伤组织的褐化是妨碍其长期继代培养的主要因素。Fett-Neto等[5]认为红豆杉属植物愈伤组织的褐化是由于愈伤组织形成的酚类物质氧化所致。但在我们的试验中，培养基中添加酚类物质的吸附剂(聚乙烯吡咯烷酮)和抗氧化剂(抗坏血酸)等并没有能有效地抑制2 个褐化严重的云南红豆杉愈伤组织系的褐化、改善其生长，而同时添加0.30 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸则效果很好。在植物细胞的氮代谢中，谷氨酰胺是转移氨基的重要中间体，它与谷氨酸构成一个转移氨基的谷氨酰胺-谷氨酸循环；桂皮酸是植物细胞中苯丙烷类物质代谢的关键酶-苯丙氨酸裂解酶的抑制剂，可以阻止黄酮和类黄酮类植物色素的形成[5]。因此，红豆杉属植物愈伤组织的褐化可能与其细胞中谷氨酰胺—谷氨酸循环受阻及黄酮和类黄酮类的形成有关。我们的试验结果表明，在培养基中添加0.30 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸可以改善愈伤组织的严重褐化现象而使其能长期培养继代。
, http://www.100md.com
致谢：紫杉醇标准品由本所方唯硕博士提供。
参考文献
1 陈永勤，等.植物生理学通讯，1997，33(3)：213
2 Wickremesinhe ERM,et al.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1993,38:181
3 Gamborg OL,et al.Exp.Cell Res,1968,50:151
4 Wu YQ,et al.J.Liq Chromatgr & Re?ated Technol,1997,21:3147
5 Fett-Neto AG,et al.Bio/Technology,1992,10:1572
6 Bolwell GP,et al.Planta,1986.169:97
收稿日期：1998-08-24, 百拇医药(陈永勤** 朱蔚华** 吴蕴祺 胡 秋)
单位：中国协和医科大学药物研究所 北京 100050中国医学科学院
关键词：云南红豆杉；愈伤组织褐化；紫杉醇
中草药990732 摘 要 研究了不同化合物对褐化严重的云南红豆杉愈伤组织生长的影响。结果表明，在培养基中添加0.29 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸后能有效地抑制愈伤组织和培养基的褐化，显著改善愈伤组织的生长，并对紫杉醇的含量影响不大；桂皮酸浓度在0.30 mg/L以上时，则抑制愈伤组织的生长，但能提高其紫杉醇含量。
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物(Taxus L.)中分离出来的一个具有抗肿瘤活性的二萜生物碱，自1993年以来，已成为临床上治疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物。但由于红豆杉属植物资源十分有限，且生长非常缓慢，体内紫杉醇含量很低，所以紫杉醇的药源问题一开始就受到人们的高度关注，至今未得到很好的解决。用红豆杉属植物组织培养技术生产紫杉醇被认为是一种有潜力的方法，已成为研究热点，并取得一些进展[1]。但该研究仍处在试验阶段，还未见用此方法商业化生产紫杉醇的报道。
, 百拇医药
在进行红豆杉属植物组织培养时，愈伤组织的褐化是一个非常普遍的现象。褐化严重时，愈伤组织的生长会受到显著的抑制，甚至不能继代培养成功[2]。因此，寻找克服愈伤组织褐化的有效方法在红豆杉属植物组织培养的研究中具有非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 愈伤组织的诱导与培养：云南红豆杉Taxus yunnanensis当年生枝条洗净后，剪成小段，分别用70%乙醇消毒2 min和0.1% HgCl2消毒20 min。用无菌水漂洗6 次后，将茎段剪成长约1.5～2.0 cm的小段，斜插在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导；愈伤组织形成后，将愈伤组织转到增殖培养基上进行继代培养。
1.2 培养条件：基本培养基为B5培养基[3]的无机成分，100.0 mg/L肌醇、1.25 mg/L烟酸、1.0 mg/L维生素B1、0.5 mg/L维生素B6、20.0 g/L蔗糖、6-苄基氨基嘌呤(BAP)0.1 g/L、1.0～3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和8.0 g/L琼脂。愈伤组织诱导培养基中加有1.0 g/L水解乳蛋白，增殖培养基同基本培养基，2，4-D浓度为1.0 mg/L。后来为了改善一些褐化严重的愈伤组织系的生长，在培养基中分别添加了1.0 g/L的水解乳蛋白、1.0 g/L蛋白胨、1.0 g/L水解酪蛋白、1.5%聚乙烯吡咯烷酮、100.0 mg/L抗坏血酸、0.29 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸。所有培养基的pH值均为5.8。除抗坏血酸、L-谷氨酰胺和桂皮酸为过滤灭菌外，其余培养基成分均为高温灭菌。
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试验在黑暗中进行，培养室温度为(22±2)°C。
1.3 愈伤组织生长量和紫杉醇含量的测定：愈伤组织生长量以生长指数表示。在本试验中，生长指数=(收获愈伤组织干重-接种愈伤组织干重)/接种愈伤组织干重。
愈伤组织中紫杉醇含量的测定按Wu等[4]建立的HPLC法进行。色谱柱为Plantinum C18柱，流动相为甲醇-乙腈-水(25∶35∶45)，流速为1.0 mL/min，检测波长为227 nm。用外标法计算样品中紫杉醇含量，以干重百分比表示。
2 结果
2.1 愈伤组织的诱导和培养：在本试验的诱导条件下，来自5株云南红豆杉的茎段都比较容易形成愈伤组织，诱导成功率均在80%以上。将所形成的愈伤组织转到增殖培养基上以后，有3个愈伤组织系褐化程度较轻，一直增殖较好，但另两个(TY6和TY5)在继代培养6个月后发生严重褐化，愈伤组织和培养基均呈深褐色至棕红色，长势显著减弱。虽然其新生的组织为淡黄色，但不久就变成棕褐色、老化、停止增殖。
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为了改善一些褐化严重的TY6和TY5愈伤组织系的生长，在培养基中分别添加了水解乳蛋白、蛋白胨、水解酪蛋白(各 1 g/L)、1.5%聚乙烯吡咯烷酮或100.0 mg/L抗坏血酸。这些物质均不能有效地抑制这两个愈伤组织系的褐化。但添加0.15～0.29 mg/L L-谷氨酰胺的培养基上，这两个愈伤组织系的生长周期延长、颜色变浅、增殖较多。通过挑选新生的、颜色浅的愈伤组织块进行继代，经过3至4次继代培养就可形成生长良好的愈伤组织系。在有谷氨酰胺时，添加一定浓度(0.15～0.22 mg/L)的桂皮酸能有效地抑制愈伤组织和培养基变红，并能改善愈伤组织的生长。
2.2 L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织系(TY6)生长和紫杉醇含量的影响：将原来在加有谷氨酰胺的增殖培养基上继代生长的TY6愈伤组织再转到无谷氨酰胺的培养基上后，其生长速率有所下降，而且培养基的棕红色较深；而在有谷氨酰胺(0.15 mg/L和0.29 mg/L)的培养基上，愈伤组织增殖很好，培养基的棕红色较浅。同无谷氨酰胺的处理相比，有谷氨酰胺的处理的紫杉醇含量有所下降，但不显著。
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在无谷氨酰胺时，0.15 mg/L的桂皮酸对TY6愈伤组织的生长有强烈的抑制作用；在有谷氨酰胺时，较低浓度(0.074～0.22 mg/L)的桂皮酸对愈伤组织的生长有一定的促进作用，但浓度达到0.30 mg/L和更高时则抑制愈伤组织的生长，培养基变红的程度随桂皮酸浓度的增加而减轻。当浓度达到0.22 mg/L时，培养基变红的现象完全被抑制。虽然高浓度的桂皮酸会抑制愈伤组织的生长，但可提高愈伤组织中紫杉醇的含量(表1)。
表1 L-谷氨酰胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织系(TY6)生长和紫杉醇含量的影响 处 理
收获干愈伤组织
(g/L)
生长指数
紫杉醇含量
(%)
, 百拇医药
紫杉醇产量
(mg/L)
谷氨酰胺(mg/L)
桂皮酸(mg/L)
0.0
0.0
9.67±1.04
1.132±0.276a
0.0218±0.0017a
2.11
0.15
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12.21±0.98
1.238±0.178a
0.0207±0.0014a
2.53
0.29
0.0
12.42±1.15
1.331±0.183a
0.0210±0.0016a
2.56
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0.15
6.85±0.77
0.787±0.315a
0.0389±0.0008b
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0.29
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11.80±0.72
1.405±0.238a
0.0189±0.0018a
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11.90±1.02
1.366±0.355a
0.0191±0.0011a
2.28
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0.22
11.38±1.03
1.187±0.191a
0.0237±0.0014c
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2.70
0.29
0.30
9.60±0.92
0.884±0.169a
0.0278±0.0021c
2.67
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0.44
7.23±1.48
0.412±0.238b
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0.0355±0.0013b
2.57
注：数据为
±s。生长数据n=6，紫杉醇含量和产量的n=3。数据间的差异性用LSR测验，P<0.05，具有相同字母的数据表示相互之间没有显著性差异。谷氨酰胺和桂皮酸克服愈伤组织的褐化和促进生长的作用在TY5愈伤组织系上也得到了证实(资料略)。
3 讨论
用红豆杉属植物细胞大规模培养方法商业化生产紫杉醇是当今植物次生代谢研究中的一个热点。因为红豆杉属植物细胞培养都是用愈伤组织建立起来的，所以维持愈伤组织的长期培养是该研究的基础。愈伤组织的褐化是妨碍其长期继代培养的主要因素。Fett-Neto等[5]认为红豆杉属植物愈伤组织的褐化是由于愈伤组织形成的酚类物质氧化所致。但在我们的试验中，培养基中添加酚类物质的吸附剂(聚乙烯吡咯烷酮)和抗氧化剂(抗坏血酸)等并没有能有效地抑制2 个褐化严重的云南红豆杉愈伤组织系的褐化、改善其生长，而同时添加0.30 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸则效果很好。在植物细胞的氮代谢中，谷氨酰胺是转移氨基的重要中间体，它与谷氨酸构成一个转移氨基的谷氨酰胺-谷氨酸循环；桂皮酸是植物细胞中苯丙烷类物质代谢的关键酶-苯丙氨酸裂解酶的抑制剂，可以阻止黄酮和类黄酮类植物色素的形成[5]。因此，红豆杉属植物愈伤组织的褐化可能与其细胞中谷氨酰胺—谷氨酸循环受阻及黄酮和类黄酮类的形成有关。我们的试验结果表明，在培养基中添加0.30 mg/L L-谷氨酰胺和0.074～0.22 mg/L桂皮酸可以改善愈伤组织的严重褐化现象而使其能长期培养继代。
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致谢：紫杉醇标准品由本所方唯硕博士提供。
参考文献
1 陈永勤，等.植物生理学通讯，1997，33(3)：213
2 Wickremesinhe ERM,et al.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1993,38:181
3 Gamborg OL,et al.Exp.Cell Res,1968,50:151
4 Wu YQ,et al.J.Liq Chromatgr & Re?ated Technol,1997,21:3147
5 Fett-Neto AG,et al.Bio/Technology,1992,10:1572
6 Bolwell GP,et al.Planta,1986.169:97
收稿日期：1998-08-24, 百拇医药(陈永勤** 朱蔚华** 吴蕴祺 胡 秋)