不同种类红豆杉愈伤组织的诱导及紫杉醇含量的差异
作者：陈永勤 朱蔚华 吴蕴祺 胡秋
单位：中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所 北京 100050
关键词：红豆杉属植物；愈伤组织诱导；紫杉醇
中草药000331摘 要 研究云南红豆杉、东北红豆杉、红豆杉、南方红豆杉和杂种红豆杉形成愈伤组织的一些因素，比较不同植株来源的愈伤组织系的生长特点和紫杉醇含量。通过考察愈伤组织形成的时间和比率来研究取样时间、光照条件、培养基中 2，4-D浓度和外植体类型对愈伤组织诱导的影响，用高效液相色谱法测定愈伤组织中紫杉醇含量。愈伤组织形成的迟早和比率在不同种类红豆杉之间和同一种类不同植株之间差异较大。在黑暗中，在添加有0.1 mg/L BAP和1.0～3.0mg/L 2，4-D 的B5培养基上，50%～100%的云南红豆杉、红豆杉、南方红豆杉、杂种红豆杉和春、夏季取样的东北红豆杉的茎段可以形成愈伤组织；云南红豆杉和红豆杉愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比较高，因此，这两种红豆杉可作为获得高紫杉醇含量愈伤组织系的外植体源。
, 百拇医药
Differences in Callus Induction and Taxol Contents of Several Yew (Taxus L.) Species
Chen Yongqin,Wu Yunqi and Hu Qiu
( Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)
Zhu Weihua
(College of Life Sciences,Hubei Universit)
Abstract Factors affecting callus induction of Taxus yunnanensis， T.cuspidata,T.chinensis,T.chinensis var.mairei and T.media were studied and the growth characteristics and taxol contents in the callus strains derived from different plants compared.Effects of sampling times,illumination,2,4-D concentrations in medium and explant types on callus induction were studied by examining callus formation time and rate; HPLC method was used to determine taxol contents in callus cultures.50%～100% of the stem segments of T.yunnanensis,T.chinensis,T.chinensis var.mairei,T.media and T.cuspidata sampled in spring or summer formed calli very well when they were cultured in dark on B5 medium supplemented with 0.1 mg/L BAP and 1.0 mg/L 2,4-D.Generally,taxol contents in the callus strains of T.yunnanensis and T.chinensis were higher,so these two Taxus species can be used as the first choice explant source to obtain high taxol content callus strains.
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Key words Taxus L.callus induction taxol▲
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物(Taxus L.)中分离出来的一个二萜生物碱，具有抗多种肿瘤活性。由于红豆杉属植物生长非常缓慢，极少成林，资源十分有限；再加之植物体内紫杉醇含量很低(约为树皮干重的 0.02%)，所以应寻找解决该问题的方法。用红豆杉属植物组织培养技术生产紫杉醇被认为是一种有潜力的方法。
虽然人们已对多种红豆杉进行了愈伤组织的诱导和培养[1]，但对不同植株的愈伤组织诱导情况及愈伤组织中紫杉醇含量差异的比较报道甚少[2]。本试验研究了影响云南红豆杉 T.yunnanensis Cheng et L.K.Fu、东北红豆杉 T.cuspidata Sieb.et Zucc.、红豆杉 T.chinensis (Pilger) Rehd.、南方红豆杉 T.chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu 和杂种红豆杉 T.media Rehd.愈伤组织形成的一些因素，并比较了不同植株来源的愈伤组织系的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的差异。
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1 材料与方法
1.1 试验材料：云南红豆杉、东北红豆杉和南方红豆杉的枝条取自本所的盆栽植株；杂种红豆杉枝条系方起程研究员从加拿大带回；红豆杉的枝条取自四川省林业学校校园内的成年植株，无菌苗(6个月)由成熟胚离体萌发而来。夏季和秋季取当年生枝条，春季取前一年生老枝条。
1.2 外植体的消毒：枝条洗净后剪成小段，分别用 70% 乙醇和 0.1% HgCl2 消毒 2 min 和 20 min。用无菌水漂洗 6 次后，将茎段剪成长约 1.5～2.0 cm 的小段，斜插在诱导培养基上。杂种红豆杉的叶片剪成约 2.0 cm 长的小段，平放在诱导培养基上。
1.3 培养基：愈伤组织诱导培养基为 B5 培养基[3]的无机盐，添加 100.0 mg/L 肌醇、1.25 mg/L 烟酸、1.0 mg/L 维生素 B1、0.5 mg/L 维生素 B6、20.0 g/L 蔗糖、1.0 g/L 水解乳蛋白、0.1 mg/L BAP、1.0～3.0 mg/L 2，4-D、琼脂 8.0 g/L。愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，但无水解乳蛋白，2，4-D 浓度为 1.0 mg/L。培养基的 pH 值为 5.8。
, 百拇医药
1.4 培养条件：试验材料在黑暗或光照培养室中培养。培养室温度为 (22±2) ℃。光照培养时光照强度约为 1 500 lx，光周期为 14 h。诱导结束时，将外植体上形成的较大块(直径 0.5 cm 以上)愈伤组织剥离下来，接种在增殖培养基上继代培养。
1.5 紫杉醇的测定：样品中紫杉醇含量的测定用高效液相色谱法[4]。高效液相色谱条件为 Shimadzu LC-6A 高效液相色谱仪，Shimadzu SPD-6A 紫外检测器，Rheodyne 7725 进样阀和 Shimadzu C-R3A 积分仪；色谱柱为 Plantinum C18 柱(250 nm×4.6 mm,5 μm,Alltech,USA)；流动相为甲醇-乙腈-水(25∶35∶45)，流速为 1.0 mL/min，检测波长为 227 nm。外标法计算得出。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com 在诱导培养基上，云南红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉均能形成愈伤组织。但愈伤组织形成的情况因红豆杉种类和植株不同而异，同时也受到 2，4-D 浓度、光照条件、采样季节和外植体类型的影响。
2.1 云南红豆杉愈伤组织的诱导：由表1和表2可以看出，几乎 100% 的云南红豆杉茎段都可以形成愈伤组织，但不同植株来源的茎段在愈伤组织形成的迟早和形成可继代愈伤组织的比率等方面差异较大。从 TY5 和 TY6 的茎段形成愈伤组织的情况来看，云南红豆杉以在 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L 的培养基上和黑暗条件下诱导效果最好；早春取样的茎段形成愈伤组织的时间要比秋季取样的早得多。
2.2 东北红豆杉愈伤组织的诱导：2，4-D 浓度和取样季节对东北红豆杉愈伤组织的诱导影响很大(表3)。秋季取样的 TC4、TC5 和 TC7 的茎段形成愈伤组织的比率随培养基中 2，4-D 浓度的增加而明显提高。东北红豆杉在秋季取样时不仅形成愈伤组织的时间晚、比率低，而且大部分外植体上的愈伤组织在形成后不久就由淡黄色变成综红色，停止生长，因而较难形成较大的愈伤组织块而进行继代培养。春、夏季取样的茎段是培养在 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L 的培养基中，但形成愈伤组织的时间早、比率高，愈伤组织的颜色也浅，为淡黄色。
, 百拇医药
表1 云南红豆杉不同植株的茎段形成愈伤组织的情况 植株
采样时间
2，4-D
(mg/L)
接种
外植体数
形成愈伤组织
的最早时间(d)
愈伤组织
形成率(%)
可继代愈伤
组织比率(%)
, 百拇医药
TY6
1995-10-06
1.0
12
18
100.0
66.7
2.0
10
18
100.0
80.0
3.0
, 百拇医药
14
18
100.0
57.1
TY5
1995-10-07
1.0
16
25
93.8
70.0
2.0
11
, http://www.100md.com
25
100.0
90.9
3.0
12
25
100.0
66.7
TY8
1995-10-24
2.0
20
17
, http://www.100md.com
100.0
70.0
TY7
1996-04-15
2.0
16
10
100.0
87.5
TY2
1996-04-24
2.0
31
, 百拇医药
15
100.0
90.3
注：外植体在黑暗中诱导，TY6，TY5 和 TY8 的诱导时间为 70 d，TY7 和 TY2 的诱导时间为 60 d。表2 光照条件对云南红豆杉的茎段形成愈伤组织的影响 植株
光照条件
接种外
植体数
形成最早
时间(d)
形成率
(%)
, 百拇医药
可继代愈伤
组织比率(%)
TY6
光
14
7
100.0
71.4
黑暗
50
7
100.0
84.0
, 百拇医药
TY5
光
21
6
100.0
76.2
黑暗
32
5
100.0
93.8
注：1996年3月22日采样：培养基中 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L，诱导时间为 60 d。表3 东北红豆杉不同植株的茎段形成愈伤组织的情况 植株
, 百拇医药
采样季节
2，4-D
(mg/L)
外植体数
发生最早
时间(d)
形成率
(%)
可继代愈伤
组织率(%)
TC5
1995-10-12
1.0
, http://www.100md.com
17
24
25.0
16.7
2.0
16
26
68.8
43.8
3.0
13
24
76.9
, http://www.100md.com
61.5
TC4
1995-10-13
1.0
11
23
72.7
9.1
2.0
10
23
50.0
20.0
, http://www.100md.com
3.0
8
23
100.0
25.0
TC7
1995-10-14
1.0
14
36
7.1
7.1
2.0
, 百拇医药
24
36
8.3
4.2
3.0
15
34
33.3
26.7
TC1
1996-04-20
1.0
27
, http://www.100md.com
16
96.3
74.1
TC3
1996-06-10
1.0
23
10
100.0
68.0
注：外植体在黑暗中培养；TC5、TC4 和 TC7 的诱导时间为 90 d，TC1 和 TC3 的诱导时间为 35 d。
2.3 南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织的诱导：南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆的茎段都比较容易形成愈伤组织(表4)。南方红豆杉以在 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L 的培养基上诱导效果最好。红豆杉无菌幼苗的茎段要比以成年植株上的老枝条形成愈伤组织的时间更早、比率更高。杂种红豆杉的茎段和叶片最早发生愈伤组织的时间没有差异，但叶片形成愈伤组织的比率要比茎段低得多。
, 百拇医药
表4 南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织的诱导 红豆杉
种类
采样
时间
外植体
类型
2，4-D
(mg/L)
外植
体数
最早发
生时间
(d)
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形成率
(%)
可继代
愈伤组
织率(%)
南方红豆杉
1995-10-08
茎段
1.0
15
17
100.0
53.3
, 百拇医药
2.0
12
17
100.0
75.0
3.0
13
17
100.0
69.2
红豆杉
1996-03-14
茎段
, 百拇医药
2.0
28
14
89.3
71.4
幼苗
1.0
20
6
100.0
100.0
杂种红豆杉
1996-11-23
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茎段
2.0
16
21
100.0
100.0
叶片
2.0
63
21
38.5
30.1
注：外植体培养在黑暗中；南方红豆杉、中国红豆杉茎段和杂种红豆杉的诱导时间为 60 d，红豆杉幼苗的诱导时间为 35 d。
, 百拇医药
2.4 不同愈伤组织系的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的比较：由表5可见，分为 3 种类型：1)颜色浅、生长快、高度分散的愈伤组织系；2)颜色较深、生长较慢、呈颗粒状的愈伤组织系；3)颜色较深、生长慢、呈结实块状的愈伤组织系。第一种类型的愈伤组织系不产生紫杉醇或产生紫杉醇的能力极低，而第二种和第三种大都能产生紫杉醇。云南红豆杉和红豆杉老茎段形成的愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比东北红豆杉和杂种红豆杉的高。
3 小结
愈伤组织形成的迟早和比率在不同种类红豆杉和同一种类不同植株之间存在差异。但红豆杉属植物愈伤组织的诱导比较容易，在本试验条件下，50%～100% 的云南红豆杉、红豆杉、南方红豆杉、杂种红豆杉和春、夏季取样的东北红豆杉茎段可以形成可继代的愈伤组织。在春、夏季采样时东北红豆杉的茎段比较容易形成愈伤组织，而在秋季采样时则比较困难。黑暗比光照更有利于愈伤组织的诱导。
表5 不同红豆杉愈伤组织的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的比较 愈伤组织系
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形 态 特 点
生长指数
紫杉醇含量(%干重)
TY5
浅黄色，高度分散，湿沙状
4.245±0.321
ND
TY6
淡黄至浅红色，颗粒状，比较松散
1.477±0.116
0.023 6±0.001 8
TY8
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灰白至黄色，结实的块状
0.976±0.075
0.014 9±0.001 0
TY2
灰白至黄色，结实的块状
0.937±0.284
0.015 3±0.001 0
TY7
灰白至黄色，结实的块状
1.107±0.086
0.013 6±0.001 7
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TC5
棕红色，颗粒状，比较松散
0.883±0.172
0.011 7±0.000 6
TC7
深褐色，颗粒状，比较松散
0.648±0.115
0.007 3±0.000 5
TC1
浅黄色，高度分散，湿沙状
3.183±0.241
, 百拇医药 ND
TC3
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
-
0.003 5±0.000 4
TCH1
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.375±0.164
0.016 8±0.001 5
TCH2
黄色，颗粒状，比较松散
1.648±0.086
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0.005 3±0.000 7
TCM
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.452±0.133
ND
TM1
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.736±0.147
0.008 4±0.000 9
TM2
黄色，颗粒状，比较松散
1.627±0.258
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0.002 5±0.000 6
注：TY=云南红豆杉；TC=东北红豆杉；TCH=红豆杉；1和2分别代表由老茎和无菌苗诱导出来的愈伤组织；TCM=南方红豆杉；TM=杂种红豆杉，1和2分别代表由茎段和叶片诱导出来的愈伤组织；ND=未检测到。
由于云南红豆杉和红豆杉老茎段所形成的愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比较高，可以作为获得紫杉醇高含量愈伤组织系的外植体源。
致谢：杂种红豆杉枝条由本所植化室方起程研究员从加拿大带回，方唯硕博士提供了紫杉醇标准品。特致谢意。■
本文在1998年11月中国药学会主办的全国红豆杉和银杏等药用植物基础及应用研究学术研讨会上交流。
陈永勤，男，博士，湖北大学生命科学学院副教授。主要从事重要经济植物的快速繁殖技术、药用植物细胞工程和有效成分的研究。曾完成了数种重要观赏兰花和杜仲的快繁技术的研究，目前正在从事红豆杉属植物和小丛红景天的组织培养工作。在国内外发表论文20余篇。
参考文献
1，陈永勤，等.植物生理学通讯，1997，33(3)：213
2，朱蔚华，等.中药材，1999，14(9)：5
3，Gamborg O L,et al.Exp Cell Res,1968,50:151
4，Wu Y Q,et al.J Lig Chromatogr & Related Techol,1997,20:3147
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药
单位：中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所 北京 100050
关键词：红豆杉属植物；愈伤组织诱导；紫杉醇
中草药000331摘 要 研究云南红豆杉、东北红豆杉、红豆杉、南方红豆杉和杂种红豆杉形成愈伤组织的一些因素，比较不同植株来源的愈伤组织系的生长特点和紫杉醇含量。通过考察愈伤组织形成的时间和比率来研究取样时间、光照条件、培养基中 2，4-D浓度和外植体类型对愈伤组织诱导的影响，用高效液相色谱法测定愈伤组织中紫杉醇含量。愈伤组织形成的迟早和比率在不同种类红豆杉之间和同一种类不同植株之间差异较大。在黑暗中，在添加有0.1 mg/L BAP和1.0～3.0mg/L 2，4-D 的B5培养基上，50%～100%的云南红豆杉、红豆杉、南方红豆杉、杂种红豆杉和春、夏季取样的东北红豆杉的茎段可以形成愈伤组织；云南红豆杉和红豆杉愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比较高，因此，这两种红豆杉可作为获得高紫杉醇含量愈伤组织系的外植体源。
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Differences in Callus Induction and Taxol Contents of Several Yew (Taxus L.) Species
Chen Yongqin,Wu Yunqi and Hu Qiu
( Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing 100050)
Zhu Weihua
(College of Life Sciences,Hubei Universit)
Abstract Factors affecting callus induction of Taxus yunnanensis， T.cuspidata,T.chinensis,T.chinensis var.mairei and T.media were studied and the growth characteristics and taxol contents in the callus strains derived from different plants compared.Effects of sampling times,illumination,2,4-D concentrations in medium and explant types on callus induction were studied by examining callus formation time and rate; HPLC method was used to determine taxol contents in callus cultures.50%～100% of the stem segments of T.yunnanensis,T.chinensis,T.chinensis var.mairei,T.media and T.cuspidata sampled in spring or summer formed calli very well when they were cultured in dark on B5 medium supplemented with 0.1 mg/L BAP and 1.0 mg/L 2,4-D.Generally,taxol contents in the callus strains of T.yunnanensis and T.chinensis were higher,so these two Taxus species can be used as the first choice explant source to obtain high taxol content callus strains.
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Key words Taxus L.callus induction taxol▲
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物(Taxus L.)中分离出来的一个二萜生物碱，具有抗多种肿瘤活性。由于红豆杉属植物生长非常缓慢，极少成林，资源十分有限；再加之植物体内紫杉醇含量很低(约为树皮干重的 0.02%)，所以应寻找解决该问题的方法。用红豆杉属植物组织培养技术生产紫杉醇被认为是一种有潜力的方法。
虽然人们已对多种红豆杉进行了愈伤组织的诱导和培养[1]，但对不同植株的愈伤组织诱导情况及愈伤组织中紫杉醇含量差异的比较报道甚少[2]。本试验研究了影响云南红豆杉 T.yunnanensis Cheng et L.K.Fu、东北红豆杉 T.cuspidata Sieb.et Zucc.、红豆杉 T.chinensis (Pilger) Rehd.、南方红豆杉 T.chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu 和杂种红豆杉 T.media Rehd.愈伤组织形成的一些因素，并比较了不同植株来源的愈伤组织系的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的差异。
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1 材料与方法
1.1 试验材料：云南红豆杉、东北红豆杉和南方红豆杉的枝条取自本所的盆栽植株；杂种红豆杉枝条系方起程研究员从加拿大带回；红豆杉的枝条取自四川省林业学校校园内的成年植株，无菌苗(6个月)由成熟胚离体萌发而来。夏季和秋季取当年生枝条，春季取前一年生老枝条。
1.2 外植体的消毒：枝条洗净后剪成小段，分别用 70% 乙醇和 0.1% HgCl2 消毒 2 min 和 20 min。用无菌水漂洗 6 次后，将茎段剪成长约 1.5～2.0 cm 的小段，斜插在诱导培养基上。杂种红豆杉的叶片剪成约 2.0 cm 长的小段，平放在诱导培养基上。
1.3 培养基：愈伤组织诱导培养基为 B5 培养基[3]的无机盐，添加 100.0 mg/L 肌醇、1.25 mg/L 烟酸、1.0 mg/L 维生素 B1、0.5 mg/L 维生素 B6、20.0 g/L 蔗糖、1.0 g/L 水解乳蛋白、0.1 mg/L BAP、1.0～3.0 mg/L 2，4-D、琼脂 8.0 g/L。愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，但无水解乳蛋白，2，4-D 浓度为 1.0 mg/L。培养基的 pH 值为 5.8。
, 百拇医药
1.4 培养条件：试验材料在黑暗或光照培养室中培养。培养室温度为 (22±2) ℃。光照培养时光照强度约为 1 500 lx，光周期为 14 h。诱导结束时，将外植体上形成的较大块(直径 0.5 cm 以上)愈伤组织剥离下来，接种在增殖培养基上继代培养。
1.5 紫杉醇的测定：样品中紫杉醇含量的测定用高效液相色谱法[4]。高效液相色谱条件为 Shimadzu LC-6A 高效液相色谱仪，Shimadzu SPD-6A 紫外检测器，Rheodyne 7725 进样阀和 Shimadzu C-R3A 积分仪；色谱柱为 Plantinum C18 柱(250 nm×4.6 mm,5 μm,Alltech,USA)；流动相为甲醇-乙腈-水(25∶35∶45)，流速为 1.0 mL/min，检测波长为 227 nm。外标法计算得出。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com 在诱导培养基上，云南红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉均能形成愈伤组织。但愈伤组织形成的情况因红豆杉种类和植株不同而异，同时也受到 2，4-D 浓度、光照条件、采样季节和外植体类型的影响。
2.1 云南红豆杉愈伤组织的诱导：由表1和表2可以看出，几乎 100% 的云南红豆杉茎段都可以形成愈伤组织，但不同植株来源的茎段在愈伤组织形成的迟早和形成可继代愈伤组织的比率等方面差异较大。从 TY5 和 TY6 的茎段形成愈伤组织的情况来看，云南红豆杉以在 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L 的培养基上和黑暗条件下诱导效果最好；早春取样的茎段形成愈伤组织的时间要比秋季取样的早得多。
2.2 东北红豆杉愈伤组织的诱导：2，4-D 浓度和取样季节对东北红豆杉愈伤组织的诱导影响很大(表3)。秋季取样的 TC4、TC5 和 TC7 的茎段形成愈伤组织的比率随培养基中 2，4-D 浓度的增加而明显提高。东北红豆杉在秋季取样时不仅形成愈伤组织的时间晚、比率低，而且大部分外植体上的愈伤组织在形成后不久就由淡黄色变成综红色，停止生长，因而较难形成较大的愈伤组织块而进行继代培养。春、夏季取样的茎段是培养在 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L 的培养基中，但形成愈伤组织的时间早、比率高，愈伤组织的颜色也浅，为淡黄色。
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表1 云南红豆杉不同植株的茎段形成愈伤组织的情况 植株
采样时间
2，4-D
(mg/L)
接种
外植体数
形成愈伤组织
的最早时间(d)
愈伤组织
形成率(%)
可继代愈伤
组织比率(%)
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TY6
1995-10-06
1.0
12
18
100.0
66.7
2.0
10
18
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80.0
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57.1
TY5
1995-10-07
1.0
16
25
93.8
70.0
2.0
11
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25
100.0
90.9
3.0
12
25
100.0
66.7
TY8
1995-10-24
2.0
20
17
, http://www.100md.com
100.0
70.0
TY7
1996-04-15
2.0
16
10
100.0
87.5
TY2
1996-04-24
2.0
31
, 百拇医药
15
100.0
90.3
注：外植体在黑暗中诱导，TY6，TY5 和 TY8 的诱导时间为 70 d，TY7 和 TY2 的诱导时间为 60 d。表2 光照条件对云南红豆杉的茎段形成愈伤组织的影响 植株
光照条件
接种外
植体数
形成最早
时间(d)
形成率
(%)
, 百拇医药
可继代愈伤
组织比率(%)
TY6
光
14
7
100.0
71.4
黑暗
50
7
100.0
84.0
, 百拇医药
TY5
光
21
6
100.0
76.2
黑暗
32
5
100.0
93.8
注：1996年3月22日采样：培养基中 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L，诱导时间为 60 d。表3 东北红豆杉不同植株的茎段形成愈伤组织的情况 植株
, 百拇医药
采样季节
2，4-D
(mg/L)
外植体数
发生最早
时间(d)
形成率
(%)
可继代愈伤
组织率(%)
TC5
1995-10-12
1.0
, http://www.100md.com
17
24
25.0
16.7
2.0
16
26
68.8
43.8
3.0
13
24
76.9
, http://www.100md.com
61.5
TC4
1995-10-13
1.0
11
23
72.7
9.1
2.0
10
23
50.0
20.0
, http://www.100md.com
3.0
8
23
100.0
25.0
TC7
1995-10-14
1.0
14
36
7.1
7.1
2.0
, 百拇医药
24
36
8.3
4.2
3.0
15
34
33.3
26.7
TC1
1996-04-20
1.0
27
, http://www.100md.com
16
96.3
74.1
TC3
1996-06-10
1.0
23
10
100.0
68.0
注：外植体在黑暗中培养；TC5、TC4 和 TC7 的诱导时间为 90 d，TC1 和 TC3 的诱导时间为 35 d。
2.3 南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织的诱导：南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆的茎段都比较容易形成愈伤组织(表4)。南方红豆杉以在 2，4-D 浓度为 2.0 mg/L 的培养基上诱导效果最好。红豆杉无菌幼苗的茎段要比以成年植株上的老枝条形成愈伤组织的时间更早、比率更高。杂种红豆杉的茎段和叶片最早发生愈伤组织的时间没有差异，但叶片形成愈伤组织的比率要比茎段低得多。
, 百拇医药
表4 南方红豆杉、红豆杉和杂种红豆杉愈伤组织的诱导 红豆杉
种类
采样
时间
外植体
类型
2，4-D
(mg/L)
外植
体数
最早发
生时间
(d)
, http://www.100md.com
形成率
(%)
可继代
愈伤组
织率(%)
南方红豆杉
1995-10-08
茎段
1.0
15
17
100.0
53.3
, 百拇医药
2.0
12
17
100.0
75.0
3.0
13
17
100.0
69.2
红豆杉
1996-03-14
茎段
, 百拇医药
2.0
28
14
89.3
71.4
幼苗
1.0
20
6
100.0
100.0
杂种红豆杉
1996-11-23
, http://www.100md.com
茎段
2.0
16
21
100.0
100.0
叶片
2.0
63
21
38.5
30.1
注：外植体培养在黑暗中；南方红豆杉、中国红豆杉茎段和杂种红豆杉的诱导时间为 60 d，红豆杉幼苗的诱导时间为 35 d。
, 百拇医药
2.4 不同愈伤组织系的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的比较：由表5可见，分为 3 种类型：1)颜色浅、生长快、高度分散的愈伤组织系；2)颜色较深、生长较慢、呈颗粒状的愈伤组织系；3)颜色较深、生长慢、呈结实块状的愈伤组织系。第一种类型的愈伤组织系不产生紫杉醇或产生紫杉醇的能力极低，而第二种和第三种大都能产生紫杉醇。云南红豆杉和红豆杉老茎段形成的愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比东北红豆杉和杂种红豆杉的高。
3 小结
愈伤组织形成的迟早和比率在不同种类红豆杉和同一种类不同植株之间存在差异。但红豆杉属植物愈伤组织的诱导比较容易，在本试验条件下，50%～100% 的云南红豆杉、红豆杉、南方红豆杉、杂种红豆杉和春、夏季取样的东北红豆杉茎段可以形成可继代的愈伤组织。在春、夏季采样时东北红豆杉的茎段比较容易形成愈伤组织，而在秋季采样时则比较困难。黑暗比光照更有利于愈伤组织的诱导。
表5 不同红豆杉愈伤组织的形态特点、生长速率和紫杉醇含量的比较 愈伤组织系
, http://www.100md.com
形 态 特 点
生长指数
紫杉醇含量(%干重)
TY5
浅黄色，高度分散，湿沙状
4.245±0.321
ND
TY6
淡黄至浅红色，颗粒状，比较松散
1.477±0.116
0.023 6±0.001 8
TY8
, http://www.100md.com
灰白至黄色，结实的块状
0.976±0.075
0.014 9±0.001 0
TY2
灰白至黄色，结实的块状
0.937±0.284
0.015 3±0.001 0
TY7
灰白至黄色，结实的块状
1.107±0.086
0.013 6±0.001 7
, http://www.100md.com
TC5
棕红色，颗粒状，比较松散
0.883±0.172
0.011 7±0.000 6
TC7
深褐色，颗粒状，比较松散
0.648±0.115
0.007 3±0.000 5
TC1
浅黄色，高度分散，湿沙状
3.183±0.241
, 百拇医药 ND
TC3
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
-
0.003 5±0.000 4
TCH1
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.375±0.164
0.016 8±0.001 5
TCH2
黄色，颗粒状，比较松散
1.648±0.086
, 百拇医药
0.005 3±0.000 7
TCM
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.452±0.133
ND
TM1
黄色至褐色，颗粒状，比较松散
1.736±0.147
0.008 4±0.000 9
TM2
黄色，颗粒状，比较松散
1.627±0.258
, http://www.100md.com
0.002 5±0.000 6
注：TY=云南红豆杉；TC=东北红豆杉；TCH=红豆杉；1和2分别代表由老茎和无菌苗诱导出来的愈伤组织；TCM=南方红豆杉；TM=杂种红豆杉，1和2分别代表由茎段和叶片诱导出来的愈伤组织；ND=未检测到。
由于云南红豆杉和红豆杉老茎段所形成的愈伤组织系的紫杉醇含量普遍比较高，可以作为获得紫杉醇高含量愈伤组织系的外植体源。
致谢：杂种红豆杉枝条由本所植化室方起程研究员从加拿大带回，方唯硕博士提供了紫杉醇标准品。特致谢意。■
本文在1998年11月中国药学会主办的全国红豆杉和银杏等药用植物基础及应用研究学术研讨会上交流。
陈永勤，男，博士，湖北大学生命科学学院副教授。主要从事重要经济植物的快速繁殖技术、药用植物细胞工程和有效成分的研究。曾完成了数种重要观赏兰花和杜仲的快繁技术的研究，目前正在从事红豆杉属植物和小丛红景天的组织培养工作。在国内外发表论文20余篇。
参考文献
1，陈永勤，等.植物生理学通讯，1997，33(3)：213
2，朱蔚华，等.中药材，1999，14(9)：5
3，Gamborg O L,et al.Exp Cell Res,1968,50:151
4，Wu Y Q,et al.J Lig Chromatogr & Related Techol,1997,20:3147
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药