白细胞介素-1受体拮抗剂对体外培养的大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性损伤的影响及其基因转染治疗
作者：梁卫兰 母得志 张国荣 吴希如
单位：北京医科大学第一医院儿科，北京 100034
关键词：受体；白细胞介素1；拮抗剂和抑制剂；大脑皮质；药物作用；细胞低氧；药物作用；转染；基因疗法
990314 摘 要 目的：观察IL-1的受体拮抗剂(IL-1ra)对缺氧性神经细胞的影响，探讨IL-1在神经细胞缺氧损伤中的作用以及基因转染治疗的可能性。方法：(1)以缺陷型HSV为载体构建的pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞为实验组，以pHSV-LacZ转染的体外培养的神经细胞为对照, 进行体外缺氧实验。以神经细胞的3H-GABA和3H-Glu摄取能力及细胞凋亡情况为判定损伤程度的指标。结果：转染pHSV-IL-1ra的神经细胞缺氧后，其3H-GABA和3H-Glu的摄取较转染pHSV-LacZ的神经细胞有所增高，神经细胞凋亡的程度少于对照。结论：pHSV-IL-1ra转染可减轻缺氧引起的神经细胞急性损伤和迟发性损伤。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R742-332
The effect of IL-1 receptor antagonist on the hypoxic damage
of cultured neurons of rat and the preliminary study of gene transfection
LIANG Wei-Lan, MU De-Zhi , ZHANG Guo-Rong , WU Xi-Ru
(Department of Pediatric， the Fist Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Receptors, interleukin-1/antag Cerebral cortex/drug eff Cell hypoxia/drug eff Transfection Gene therpy
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To observe the effect of IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) on the hypoxic damage of cultured neurons and study the possible treatment with experimental gene transfection. Methods: Hypoxic experiment was done in the experiment group (transfected neurons with pHSV-IL-1ra) and the control group (transfected neurons with pHSV-LacZ). The markers of hypoxic damage included the uptake ability of the neurons for 3H-GABA and 3H-Glu and the cell apoptosis. Results: After hypoxia, uptake ability of the 3H-GABA and 3H-Glu were higher in experiment group than in the control. Apoptotic cells were fewer in the experiment group than in the control. Conclusion: Transfection of pHSV-IL-1ra can reduce both the acute and the delayed hypoxic neurons damage.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:243-246)
近年越来越多的证据表明，免疫系统也参与了缺血缺氧性脑损伤这一复杂的病理过程，其中白细胞介素-1(IL-1)及其受体拮抗剂(IL-1ra)的作用尤其令人关注。我们在既往对惊厥发生机制的研究中发现，IL-1β可促进神经细胞NMDA受体mRNA的表达并使其受体活性增加[1]。而NMDA受体又在神经细胞缺血缺氧性损伤的发病中起重要作用。许多研究提示, 白细胞介素-1受体拮抗剂能抑制缺血和神经兴奋毒所致的脑损伤。因此我们结合前期的研究工作，以缺陷型单纯疱疹病毒(HSV-1)为载体构建的白细胞介素-1受体拮抗剂的重组质粒pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞[2]， 观察其对缺氧性神经细胞损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
本实验所用昆明小鼠由北京医科大学实验动物部提供。3H-谷氨酸(3H-Glu)、3H-γ-氨基丁酸(3H-GABA)购自上海原子能研究所。IL-1ra重组质粒(pHSV-IL-1ra)由本研究组张国荣博士构建。pHSV-LacZ由美国Harvard大学Geller教授惠赠。IL-1ra多克隆抗体购自北京医科大学免疫研究中心。
1.2 方法
1.2.1 胚胎大鼠大脑皮层神经细胞原代培养 基本按照吴希如等[3]方法进行。取妊娠16d的昆明小鼠，麻醉后，剖腹取出胎鼠，分离胎鼠大脑皮层，去除软脑膜，将皮层剪碎后用2.5 g.L-1的胰蛋白酶消化，37℃，30min。用含10%(体积分数)小牛血清的DMEM液终止胰酶作用， 吹打细胞使之成为细胞悬液，调节细胞数为1×106 ml-1，接种于预先用多聚赖氨酸铺好的24孔培养板或细胞培养皿 (培养皿中预先放置盖玻片，利于进行免疫组化等形态学研究)中。然后置于CO2培养箱内, 37℃培养。取体外培养第7天的细胞进行缺氧实验。
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1.2.2 pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞 取构建的IL-1ra重组质粒(pHSV-IL-1ra)，利用辅助病毒tsK包装成假病毒颗粒，感染包装细胞(VERO细胞)，收集细胞上清液，并测定上清液中pHSV-IL-1ra滴度，106pfu.ml-1感染体外培养4 d的神经细胞，同时取相同滴度的pHSV-LacZ(含LacZ基因的HSV重组质粒，LacZ为β-半乳糖苷酶基因，是一种标记基因)作为对照。转染后继续培养72h。转染pHSV-Lac的神经细胞经X-gal染色证实pHSV-LacZ转染成功。转染pHSV-IL-1ra 的神经细胞采用抗IL-1ra多克隆抗体进行免疫荧光染色鉴定。
1.2.3 神经细胞缺氧实验 将体外培养第7天的神经细胞(包括转染后的神经细胞)，置于特制缺氧槽中，槽内通入95%(体积分数)N2和5%(体积分数)CO2，缺氧过程中监测槽中O2的体积分数，保持槽中O2体积分数小于4%。根据以往经验，我们选缺氧24h时间点进行观察。同时将同批培养的神经元继续培养24h(不缺氧)作为对照，以观察缺氧对神经细胞的影响。
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1.2.4 神经细胞缺氧损伤观察指标 (1)神经细胞3H-GABA、3H-Glu摄取：取24孔板培养的细胞用Hanks液0.3ml洗涤两遍，液体弃去；每孔细胞中加入0.3ml含3H-GABA/3H-Glu 1.85×104 Bq(0.5 μCi) 的Hanks液，37 ℃ 10 min；吸出孔中液体弃去，用Hanks液洗细胞3遍，然后在每细胞孔中加0.2 mol.L-1 NaOH 0.15ml，刮取细胞，分别收集液体，重复此步骤1次，两次液体合并。收集管中取出液体0.25ml加入液闪瓶中，加入5ml闪烁液，测量每分钟计数值；(2)电镜标本制作，透射电镜观察神经细胞形态学变化；(3)DNA 提取及电泳观察细胞凋亡：将上述各组神经细胞分别离心收获，按常规方法提取DNA，然后进行凝胶电泳，紫外灯下观察并摄片。
1.2.5 数据处理及统计学检验 实验结果以均值±标准差(
±s)表示，3组资料比较采用方差分析与q检验; 两两比较采用Student's t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 神经细胞的转染
转染pHSV-Lac的神经细胞，在转染后24 h就有β-半乳糖表达，在转染72 h后，经X-gal染色，约60%～70%的神经细胞染色阳性。转染pHSV-IL-1ra的神经细胞，经免疫组化染色，在转染后72 h也有相同比例的神经细胞为IL-1ra染色阳性(图1)。我们将转染和未转染的、培养天数相同的同组细胞进行3H-Glu和3H-GABA摄取实验，结果发现转染前、后神经细胞的摄取功能无显著变化(表1)。
图1 转染pHSV-IL-1ra 72 h后， 用抗IL-1ra多克隆抗体
免疫荧光染色，可见多数神经元为IL-1ra阳性细胞 ×200
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Figure 1 72 hours after transfected with pHSV-IL-1ra and stained
with immunofluorescence of multiclonal antibody
to IL-1ra, it was shown that most of the neurons
is IL-1ra positive×200
2.2 缺氧对体外培养的神经细胞功能的影响
将体外培养7 d且生长良好的神经细胞进行缺氧实验，以观察缺氧对神经元3H-Glu和3H-GABA摄取(cpm值)的影响。结果发现，神经细胞在缺氧24 h后，对3H-Glu和3H-GABA的摄取明显低于未缺氧组。尤其是神经细胞的3H-GABA摄取不足对照组的50%(表2)。缺氧24 h的神经元经透射电镜检测，发现有明显核浓缩，染色质聚集等典型的细胞凋亡现象(图2)。缺氧后神经细胞DNA提取后凝胶电泳发现有明显的阶梯式电泳图谱(DNA“ladder”图3)。
, 百拇医药
表1 假病毒颗粒转染神经细胞对其摄取功能的影响(±s)
Table 1 The effect of pHSV transfection on the uptake ability
of neurons(±s) Groups
n
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
, http://www.100md.com
(min-1)
Control
6
4112±251
14390±1963
Transfection with pHSV-LacZ
6
4072±863
13916±1483
Transfection with pHSV-IL-1ra
6
, 百拇医药
3998±468
15224±1235
Transfected groups compared with control， P>0.05.
图2 神经元缺氧24 h，电镜下可见细胞凋亡特征
——“核浓缩”×12000
Figure 2 24 hours after hypoxia of neurons,it showed the features of apoptosis under electromicroscope,especially condensation of nucleus×12000
, 百拇医药
1, molecular weight markers; 2, control cells; 3, the cells after 24 h hypoxia;4, pHSV-IL-1ra transfected cells after 24 h hypoxia;5, pHSV-LacZ transfected
cells after 24 h hypoxia.
图3 DNA ladder法检测细胞凋亡情况
Figure 3 The apoptosis in the hypoxic neurons by DNA ladder
表2 缺氧对神经元摄取功能的影响(±s)
, 百拇医药
Table 2 The effect of hypoxia on uptake ability
of neurons(±s) Groups
n
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
(min-1)
Hypoxic
5
, 百拇医药
3422±351**
9392±661**
Control
5
4472±363
20916±2183
t test， **P<0.01 compared with control.
2.3 IL-1ra对缺氧神经元的作用
在证实转染成功后，我们将转染pHSV-IL-1ra的神经细胞进行缺氧实验，同时利用转入pHSV-LacZ作为对照，以观察IL-1ra对缺氧神经元的保护作用。实验结果显示，转染pHSV-IL-1ra的神经细胞缺氧后，其对3H-GABA和3H-Glu的摄取较转染pHSV-LacZ的神经细胞增高，经统计学分析，差异具有显著意义(表3)。在对缺氧神经细胞凋亡的检测中发现pHSV-IL-1ra转染的神经细胞，经缺氧后DNA“ladder”虽然未完全消失，但较对照组明显减弱(图3) 。
, 百拇医药
表3 IL-1ra对神经元摄取功能的影响(±s)
Table 3 The effect of pHSV-IL-1ra on uptake ability
of neurons(±s) Groups
n
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
, 百拇医药
(min-1)
pHSV-IL-1ra
5
4121±121*
12314±517**
pHSV-LacZ
5
3420±495
10158±805
t test， *P<0.05， **P<0.01， compared with pHSV-LacZ group.3 讨论
, 百拇医药
随着病毒分子生物学的研究进展，对病毒载体的研究也取得了长足的进步。腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒等已广泛应用于基因转染的研究。但由于神经细胞成熟后不能再分裂，因此用于神经细胞基因转染的载体受到了限制。由于单纯疱疹病毒(HSV-1)具备特异亲神经性，能够感染动物体内、外的非分裂神经细胞，宿主范围广，可感染人类及其他灵长类动物，能在某些神经细胞中建立潜伏感染等特点，目前被广泛用作神经细胞基因转移的载体。HSV-1基因序列已全部清楚，便于操作，而且有较大的外源基因容量，有利于构建一种具有多种神经功能特性的重组表达载体。利用HSV的这些特点，我们研究组以缺陷型HSV-1为载体构建了白细胞介素-1受体拮抗剂[2]，此次我们应用重组IL-1ra质粒，成功地转染了体外培养的神经细胞，并用这些转染后的神经细胞进行缺氧实验，取得了一定的效果。由于此病毒载体为缺陷型病毒，对神经细胞的毒性比野生型的明显减轻。我们观察到，神经细胞感染72h时，形态和功能上均无明显损害现象(表1，图1)。但据Geller[4]报道，应用此载体接种动物，感染两周后仍有10%动物死亡。这一毒性作用是由于其辅助病毒造成的。因此，他们正在致力于无辅助病毒包装系统的研制。
, 百拇医药
神经系统和免疫系统构成一个复杂的细胞网络，并存在双向调控关系。白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)及其受体拮抗剂作为重要的细胞因子不仅参与了机体的免疫应答，而且也在某些神经系统疾病的病理生理过程中起着重要的作用。 据文献报道，大鼠前脑一过性缺血能诱发皮层、海马等脑区IL-1β mRNA的表达[5]。IL-1ra能抑制缺血和神经兴奋毒所致的脑损伤。大鼠缺血前或缺血后脑室内注射IL-1ra可使缺血所致的神经细胞的死亡减少50%，使兴奋性氨基酸NMDA所致的脑梗死区面积减少70%[6]。但这些结果属于整体研究，有可能为综合作用的结果。IL-1ra对缺氧保护作用的实现方式是直接还是间接的尚需进一步研究。我们在既往的研究中也证实了IL-1与神经细胞兴奋性及癫痫发生有密切的关系[2]。IL-1β可导致神经细胞NMDAR mRNA表达及受体活性增加，从而使其兴奋性增高[7]。本项研究选择了已构建的IL-1受体拮抗剂的重组质粒pHSV-IL-1ra，对IL-1ra在缺氧性神经细胞损伤中的作用进行了研究，研究结果证实pHSV-IL-1ra在培养神经元中转染成功；并选择了能反映神经元摄取功能的3H-Glu和3H-GABA的摄取及缺氧后神经元凋亡的情况作为神经细胞的损伤指标。结果显示转染pHSV-IL-1ra后的神经细胞对3H-GABA和3H-Glu的摄取均高于对照组，具有统计学意义，说明 IL-1ra对神经元的缺氧损伤具有直接的保护作用。
, 百拇医药
目前研究发现，神经细胞受到缺氧损伤后，不仅可造成急性细胞坏死，同时也诱发了细胞凋亡[8]。我们通过细胞DNA“ladder”以及电镜观察也证实了这一点。后者即所谓的神经细胞迟发性死亡。这种迟发性神经细胞死亡常发生在缺氧后相当长的一段时间内，而且这种损伤有时要比缺氧当时还严重。这一点提示临床对缺氧缺血脑损伤早期干预及密切观察病情发展并采取相应措施，可减轻缺氧引起的恶果 。本研究用pHSV-IL-1ra转染后的细胞进行缺氧实验发现该组的细胞凋亡明显低于对照。说明IL-1ra对缺氧后神经细胞的迟发性损伤也具有保护作用。由此也可推测IL-1及其受体拮抗剂可能参与了缺氧诱发细胞凋亡的过程。当缺氧引起细胞急性损伤后，其抗原性可能会发生改变，并可能由此激发免疫系统的异常应答。对于这种反应的存在与否及其与缺氧引起细胞凋亡的关系我们正在研究中。
*“九五”国家科技攻关项目(96-904-04)。
参考文献
, http://www.100md.com
1 张国荣，单巍松，梁英武,等.白介素-1与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究.中国免疫学杂志,1997,13：94-96
2 张国荣，单巍松，吴希如.HSV转基因表达IL-1ra抑制P77PMC大鼠的惊厥发作. 中国科学,1998,28(2):71-76
3 吴希如，张 一，马守兴.胚胎大鼠大脑皮层神经细胞原代分离培养方法.北京医科大学学报，1983，15：169-173
4 Geller AI, Ahandan K, Bran J， et al. An defective deletion mutant packaging system for defective herpes simplex virus vectors: potent application to human gene therapy and neuronal physiology. Proc Natl Acad Sci USA， 1990, 87:8950-8954
, 百拇医药
5 Minami M, Kurasinshi Y, Yamaguchi K， et al. Induction of interleukin-1 β mRNA in rat brain after transient forebrain ischemia. J Neurochem, 1992 58:390-396
6 Relton JK， Rothwell NJ. Interleukin-1 receptor antagonist inhibits ischemic and excitotoxic neuronal damage in rat. Brain Res Bull， 1992, 29:243-248
7 王朝晖,单巍松,梁英武，等. 白介素-1对神经细胞内谷氨酸及游离钙的作用. 中华医学杂志, 1995, 3(3) 174-176
8 Rosenbaum D, Michaelson M, Batter DK, et al. Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons. Ann Neurol, 1994, 36:864-870
(1999-01-11收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第一医院儿科，北京 100034
关键词：受体；白细胞介素1；拮抗剂和抑制剂；大脑皮质；药物作用；细胞低氧；药物作用；转染；基因疗法
990314 摘 要 目的：观察IL-1的受体拮抗剂(IL-1ra)对缺氧性神经细胞的影响，探讨IL-1在神经细胞缺氧损伤中的作用以及基因转染治疗的可能性。方法：(1)以缺陷型HSV为载体构建的pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞为实验组，以pHSV-LacZ转染的体外培养的神经细胞为对照, 进行体外缺氧实验。以神经细胞的3H-GABA和3H-Glu摄取能力及细胞凋亡情况为判定损伤程度的指标。结果：转染pHSV-IL-1ra的神经细胞缺氧后，其3H-GABA和3H-Glu的摄取较转染pHSV-LacZ的神经细胞有所增高，神经细胞凋亡的程度少于对照。结论：pHSV-IL-1ra转染可减轻缺氧引起的神经细胞急性损伤和迟发性损伤。
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中国图书资料分类法分类号 R742-332
The effect of IL-1 receptor antagonist on the hypoxic damage
of cultured neurons of rat and the preliminary study of gene transfection
LIANG Wei-Lan, MU De-Zhi , ZHANG Guo-Rong , WU Xi-Ru
(Department of Pediatric， the Fist Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Receptors, interleukin-1/antag Cerebral cortex/drug eff Cell hypoxia/drug eff Transfection Gene therpy
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To observe the effect of IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) on the hypoxic damage of cultured neurons and study the possible treatment with experimental gene transfection. Methods: Hypoxic experiment was done in the experiment group (transfected neurons with pHSV-IL-1ra) and the control group (transfected neurons with pHSV-LacZ). The markers of hypoxic damage included the uptake ability of the neurons for 3H-GABA and 3H-Glu and the cell apoptosis. Results: After hypoxia, uptake ability of the 3H-GABA and 3H-Glu were higher in experiment group than in the control. Apoptotic cells were fewer in the experiment group than in the control. Conclusion: Transfection of pHSV-IL-1ra can reduce both the acute and the delayed hypoxic neurons damage.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:243-246)
近年越来越多的证据表明，免疫系统也参与了缺血缺氧性脑损伤这一复杂的病理过程，其中白细胞介素-1(IL-1)及其受体拮抗剂(IL-1ra)的作用尤其令人关注。我们在既往对惊厥发生机制的研究中发现，IL-1β可促进神经细胞NMDA受体mRNA的表达并使其受体活性增加[1]。而NMDA受体又在神经细胞缺血缺氧性损伤的发病中起重要作用。许多研究提示, 白细胞介素-1受体拮抗剂能抑制缺血和神经兴奋毒所致的脑损伤。因此我们结合前期的研究工作，以缺陷型单纯疱疹病毒(HSV-1)为载体构建的白细胞介素-1受体拮抗剂的重组质粒pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞[2]， 观察其对缺氧性神经细胞损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
本实验所用昆明小鼠由北京医科大学实验动物部提供。3H-谷氨酸(3H-Glu)、3H-γ-氨基丁酸(3H-GABA)购自上海原子能研究所。IL-1ra重组质粒(pHSV-IL-1ra)由本研究组张国荣博士构建。pHSV-LacZ由美国Harvard大学Geller教授惠赠。IL-1ra多克隆抗体购自北京医科大学免疫研究中心。
1.2 方法
1.2.1 胚胎大鼠大脑皮层神经细胞原代培养 基本按照吴希如等[3]方法进行。取妊娠16d的昆明小鼠，麻醉后，剖腹取出胎鼠，分离胎鼠大脑皮层，去除软脑膜，将皮层剪碎后用2.5 g.L-1的胰蛋白酶消化，37℃，30min。用含10%(体积分数)小牛血清的DMEM液终止胰酶作用， 吹打细胞使之成为细胞悬液，调节细胞数为1×106 ml-1，接种于预先用多聚赖氨酸铺好的24孔培养板或细胞培养皿 (培养皿中预先放置盖玻片，利于进行免疫组化等形态学研究)中。然后置于CO2培养箱内, 37℃培养。取体外培养第7天的细胞进行缺氧实验。
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1.2.2 pHSV-IL-1ra转染体外培养的神经细胞 取构建的IL-1ra重组质粒(pHSV-IL-1ra)，利用辅助病毒tsK包装成假病毒颗粒，感染包装细胞(VERO细胞)，收集细胞上清液，并测定上清液中pHSV-IL-1ra滴度，106pfu.ml-1感染体外培养4 d的神经细胞，同时取相同滴度的pHSV-LacZ(含LacZ基因的HSV重组质粒，LacZ为β-半乳糖苷酶基因，是一种标记基因)作为对照。转染后继续培养72h。转染pHSV-Lac的神经细胞经X-gal染色证实pHSV-LacZ转染成功。转染pHSV-IL-1ra 的神经细胞采用抗IL-1ra多克隆抗体进行免疫荧光染色鉴定。
1.2.3 神经细胞缺氧实验 将体外培养第7天的神经细胞(包括转染后的神经细胞)，置于特制缺氧槽中，槽内通入95%(体积分数)N2和5%(体积分数)CO2，缺氧过程中监测槽中O2的体积分数，保持槽中O2体积分数小于4%。根据以往经验，我们选缺氧24h时间点进行观察。同时将同批培养的神经元继续培养24h(不缺氧)作为对照，以观察缺氧对神经细胞的影响。
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1.2.4 神经细胞缺氧损伤观察指标 (1)神经细胞3H-GABA、3H-Glu摄取：取24孔板培养的细胞用Hanks液0.3ml洗涤两遍，液体弃去；每孔细胞中加入0.3ml含3H-GABA/3H-Glu 1.85×104 Bq(0.5 μCi) 的Hanks液，37 ℃ 10 min；吸出孔中液体弃去，用Hanks液洗细胞3遍，然后在每细胞孔中加0.2 mol.L-1 NaOH 0.15ml，刮取细胞，分别收集液体，重复此步骤1次，两次液体合并。收集管中取出液体0.25ml加入液闪瓶中，加入5ml闪烁液，测量每分钟计数值；(2)电镜标本制作，透射电镜观察神经细胞形态学变化；(3)DNA 提取及电泳观察细胞凋亡：将上述各组神经细胞分别离心收获，按常规方法提取DNA，然后进行凝胶电泳，紫外灯下观察并摄片。
1.2.5 数据处理及统计学检验 实验结果以均值±标准差(
±s)表示，3组资料比较采用方差分析与q检验; 两两比较采用Student's t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 神经细胞的转染
转染pHSV-Lac的神经细胞，在转染后24 h就有β-半乳糖表达，在转染72 h后，经X-gal染色，约60%～70%的神经细胞染色阳性。转染pHSV-IL-1ra的神经细胞，经免疫组化染色，在转染后72 h也有相同比例的神经细胞为IL-1ra染色阳性(图1)。我们将转染和未转染的、培养天数相同的同组细胞进行3H-Glu和3H-GABA摄取实验，结果发现转染前、后神经细胞的摄取功能无显著变化(表1)。
图1 转染pHSV-IL-1ra 72 h后， 用抗IL-1ra多克隆抗体
免疫荧光染色，可见多数神经元为IL-1ra阳性细胞 ×200
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Figure 1 72 hours after transfected with pHSV-IL-1ra and stained
with immunofluorescence of multiclonal antibody
to IL-1ra, it was shown that most of the neurons
is IL-1ra positive×200
2.2 缺氧对体外培养的神经细胞功能的影响
将体外培养7 d且生长良好的神经细胞进行缺氧实验，以观察缺氧对神经元3H-Glu和3H-GABA摄取(cpm值)的影响。结果发现，神经细胞在缺氧24 h后，对3H-Glu和3H-GABA的摄取明显低于未缺氧组。尤其是神经细胞的3H-GABA摄取不足对照组的50%(表2)。缺氧24 h的神经元经透射电镜检测，发现有明显核浓缩，染色质聚集等典型的细胞凋亡现象(图2)。缺氧后神经细胞DNA提取后凝胶电泳发现有明显的阶梯式电泳图谱(DNA“ladder”图3)。
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表1 假病毒颗粒转染神经细胞对其摄取功能的影响(
±s)Table 1 The effect of pHSV transfection on the uptake ability
of neurons(
±s) Groupsn
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
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(min-1)
Control
6
4112±251
14390±1963
Transfection with pHSV-LacZ
6
4072±863
13916±1483
Transfection with pHSV-IL-1ra
6
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3998±468
15224±1235
Transfected groups compared with control， P>0.05.
图2 神经元缺氧24 h，电镜下可见细胞凋亡特征
——“核浓缩”×12000
Figure 2 24 hours after hypoxia of neurons,it showed the features of apoptosis under electromicroscope,especially condensation of nucleus×12000
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1, molecular weight markers; 2, control cells; 3, the cells after 24 h hypoxia;4, pHSV-IL-1ra transfected cells after 24 h hypoxia;5, pHSV-LacZ transfected
cells after 24 h hypoxia.
图3 DNA ladder法检测细胞凋亡情况
Figure 3 The apoptosis in the hypoxic neurons by DNA ladder
表2 缺氧对神经元摄取功能的影响(
±s), 百拇医药
Table 2 The effect of hypoxia on uptake ability
of neurons(
±s) Groupsn
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
(min-1)
Hypoxic
5
, 百拇医药
3422±351**
9392±661**
Control
5
4472±363
20916±2183
t test， **P<0.01 compared with control.
2.3 IL-1ra对缺氧神经元的作用
在证实转染成功后，我们将转染pHSV-IL-1ra的神经细胞进行缺氧实验，同时利用转入pHSV-LacZ作为对照，以观察IL-1ra对缺氧神经元的保护作用。实验结果显示，转染pHSV-IL-1ra的神经细胞缺氧后，其对3H-GABA和3H-Glu的摄取较转染pHSV-LacZ的神经细胞增高，经统计学分析，差异具有显著意义(表3)。在对缺氧神经细胞凋亡的检测中发现pHSV-IL-1ra转染的神经细胞，经缺氧后DNA“ladder”虽然未完全消失，但较对照组明显减弱(图3) 。
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表3 IL-1ra对神经元摄取功能的影响(
±s)Table 3 The effect of pHSV-IL-1ra on uptake ability
of neurons(
±s) Groupsn
3H-Glu uptake
(min-1)
3H-GABA uptake
, 百拇医药
(min-1)
pHSV-IL-1ra
5
4121±121*
12314±517**
pHSV-LacZ
5
3420±495
10158±805
t test， *P<0.05， **P<0.01， compared with pHSV-LacZ group.3 讨论
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随着病毒分子生物学的研究进展，对病毒载体的研究也取得了长足的进步。腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒等已广泛应用于基因转染的研究。但由于神经细胞成熟后不能再分裂，因此用于神经细胞基因转染的载体受到了限制。由于单纯疱疹病毒(HSV-1)具备特异亲神经性，能够感染动物体内、外的非分裂神经细胞，宿主范围广，可感染人类及其他灵长类动物，能在某些神经细胞中建立潜伏感染等特点，目前被广泛用作神经细胞基因转移的载体。HSV-1基因序列已全部清楚，便于操作，而且有较大的外源基因容量，有利于构建一种具有多种神经功能特性的重组表达载体。利用HSV的这些特点，我们研究组以缺陷型HSV-1为载体构建了白细胞介素-1受体拮抗剂[2]，此次我们应用重组IL-1ra质粒，成功地转染了体外培养的神经细胞，并用这些转染后的神经细胞进行缺氧实验，取得了一定的效果。由于此病毒载体为缺陷型病毒，对神经细胞的毒性比野生型的明显减轻。我们观察到，神经细胞感染72h时，形态和功能上均无明显损害现象(表1，图1)。但据Geller[4]报道，应用此载体接种动物，感染两周后仍有10%动物死亡。这一毒性作用是由于其辅助病毒造成的。因此，他们正在致力于无辅助病毒包装系统的研制。
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神经系统和免疫系统构成一个复杂的细胞网络，并存在双向调控关系。白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)及其受体拮抗剂作为重要的细胞因子不仅参与了机体的免疫应答，而且也在某些神经系统疾病的病理生理过程中起着重要的作用。 据文献报道，大鼠前脑一过性缺血能诱发皮层、海马等脑区IL-1β mRNA的表达[5]。IL-1ra能抑制缺血和神经兴奋毒所致的脑损伤。大鼠缺血前或缺血后脑室内注射IL-1ra可使缺血所致的神经细胞的死亡减少50%，使兴奋性氨基酸NMDA所致的脑梗死区面积减少70%[6]。但这些结果属于整体研究，有可能为综合作用的结果。IL-1ra对缺氧保护作用的实现方式是直接还是间接的尚需进一步研究。我们在既往的研究中也证实了IL-1与神经细胞兴奋性及癫痫发生有密切的关系[2]。IL-1β可导致神经细胞NMDAR mRNA表达及受体活性增加，从而使其兴奋性增高[7]。本项研究选择了已构建的IL-1受体拮抗剂的重组质粒pHSV-IL-1ra，对IL-1ra在缺氧性神经细胞损伤中的作用进行了研究，研究结果证实pHSV-IL-1ra在培养神经元中转染成功；并选择了能反映神经元摄取功能的3H-Glu和3H-GABA的摄取及缺氧后神经元凋亡的情况作为神经细胞的损伤指标。结果显示转染pHSV-IL-1ra后的神经细胞对3H-GABA和3H-Glu的摄取均高于对照组，具有统计学意义，说明 IL-1ra对神经元的缺氧损伤具有直接的保护作用。
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目前研究发现，神经细胞受到缺氧损伤后，不仅可造成急性细胞坏死，同时也诱发了细胞凋亡[8]。我们通过细胞DNA“ladder”以及电镜观察也证实了这一点。后者即所谓的神经细胞迟发性死亡。这种迟发性神经细胞死亡常发生在缺氧后相当长的一段时间内，而且这种损伤有时要比缺氧当时还严重。这一点提示临床对缺氧缺血脑损伤早期干预及密切观察病情发展并采取相应措施，可减轻缺氧引起的恶果 。本研究用pHSV-IL-1ra转染后的细胞进行缺氧实验发现该组的细胞凋亡明显低于对照。说明IL-1ra对缺氧后神经细胞的迟发性损伤也具有保护作用。由此也可推测IL-1及其受体拮抗剂可能参与了缺氧诱发细胞凋亡的过程。当缺氧引起细胞急性损伤后，其抗原性可能会发生改变，并可能由此激发免疫系统的异常应答。对于这种反应的存在与否及其与缺氧引起细胞凋亡的关系我们正在研究中。
*“九五”国家科技攻关项目(96-904-04)。
参考文献
, http://www.100md.com
1 张国荣，单巍松，梁英武,等.白介素-1与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究.中国免疫学杂志,1997,13：94-96
2 张国荣，单巍松，吴希如.HSV转基因表达IL-1ra抑制P77PMC大鼠的惊厥发作. 中国科学,1998,28(2):71-76
3 吴希如，张 一，马守兴.胚胎大鼠大脑皮层神经细胞原代分离培养方法.北京医科大学学报，1983，15：169-173
4 Geller AI, Ahandan K, Bran J， et al. An defective deletion mutant packaging system for defective herpes simplex virus vectors: potent application to human gene therapy and neuronal physiology. Proc Natl Acad Sci USA， 1990, 87:8950-8954
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5 Minami M, Kurasinshi Y, Yamaguchi K， et al. Induction of interleukin-1 β mRNA in rat brain after transient forebrain ischemia. J Neurochem, 1992 58:390-396
6 Relton JK， Rothwell NJ. Interleukin-1 receptor antagonist inhibits ischemic and excitotoxic neuronal damage in rat. Brain Res Bull， 1992, 29:243-248
7 王朝晖,单巍松,梁英武，等. 白介素-1对神经细胞内谷氨酸及游离钙的作用. 中华医学杂志, 1995, 3(3) 174-176
8 Rosenbaum D, Michaelson M, Batter DK, et al. Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons. Ann Neurol, 1994, 36:864-870
(1999-01-11收稿), 百拇医药