成纤维细胞生物学特性与扩张皮肤回缩的实验研究
作者：范志宏 崔磊 李伟 钱云良
单位：(上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科)
关键词：肌成纤维细胞；皮肤扩张术
中华医学美容杂志000110 摘 要：目的 通过对皮肤肌成纤维细胞(MFB)特征性标志α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的检测，研究扩张皮肤回缩的机理。方法 通过犬皮肤扩张实验，采用电镜观察和免疫组化等方法检测。结果 免疫组化研究发现，扩张后皮肤真皮组织内αSMA阳性成纤维细胞仅个别散在，但超微结构显示成纤维细胞内微丝粗大明显，出现密纤、密斑。结论 扩张刺激未使纤维细胞转变为肌成纤维细胞，但成纤维细胞功能活跃。具备了收缩功能的细胞结构，在细胞水平产生收缩动力，导致扩张皮肤回缩。
Experimental research on the relationship of the biological property of myofibroblasts in expanded skin contraction
, http://www.100md.com
FAN Zhihong CUI Lei LI Wei
(The plastic surgery department of the 9 peoples hospital affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011，China)
Abstract： Objective To study the mechanism of the expanded skin contraction by testing the α-SMA which is the characteristic marker of myofibroblasts. Method Immunohistochemistry stain and electromicroscopic observation were adopted in the experiments of dog skin expansion.Results The immunohistochemistry showed that the α-SMA stained negatively in the dermal fibroblast while the ultrastructure of fibroblast showed that the microfilament of FB was densely.Conclusion The result shows that the fibroblast do not transfer to myofibroblasts in expanding process, but with a functional activity, and suggests that FB in expanded skin keeps the ability to contract, it also indicates that FB is the force to make the skin contract.
, 百拇医药
Key words：Myofibooblasts；Expanded skin▲
以往研究表明，成纤维细胞fibroblast FB在扩张皮肤的一系列病理改变中发挥重要作用[1]，如胶原及其它基质的合成[2]、 真皮的改建及收缩等[3]。在很多病理改变中成纤维细胞均转变成一类具收缩功能的肌成纤维细胞(Myofibroblast, MFB)而产生收缩能力，以往研究虽推测FB的转化可能与扩张皮肤回缩有关，但对此尚存有争议，并缺乏明显的组织学证据[4]。本研究旨在观察在扩张作用下，FB生物学特性的改变，以明确FB与扩张皮肤回缩的关系。
材料与方法
一、材料
1.动物实验和分组：家养草犬20只(上海第九人民医院实验动物中心提供,雄性，2岁龄，体重(5～7) kg),分成4组，每组5只。在每只犬的背部两侧相同解剖部位,分别置入150 ml长方形硅胶扩张器，一侧为实验组，另一侧为对照组，两侧即时注入30 ml生理盐水,1周后拆线。以后实验侧每周注入生理盐水扩张1次，每次20 ml，共6次达到最终扩张容量150 ml。扩张完成后两侧同时取出扩张器，修整皮瓣原位缝合，各组分别在扩张完成取出扩张器后即时、3个月、6个月、1年取材。
, http://www.100md.com
2.主要仪器、试剂：普通光学显微镜，常规组织切片、HE染色试剂，αSMA免疫组化染色试剂盒(Sigma公司提供)。
二、方法
1.病理取材：上述各组动物扩张完成后取出扩张器，各组到取材时间后，在扩张皮肤中央切取2 cm×2 cm大小皮肤2等分，一份以10 %甲醛固定，分别行HE及免疫组化染色；另一份常规戊二醛固定透射电镜检查：
2.电镜标本制作：2.5 %戊二醛和1 %锇酸固定后，梯度酒精脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片(100 um)，铀铝双重染色，HITACHI600透射电镜观察。
3.组织切片免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡、水化、0.1 %胰蛋白酶消化20 min，3 % H202去离子水漂洗，20 %小牛血清阻断后，滴加2滴一抗(antiasmantism 1)，温育2 h，洗净后滴加2滴生物素化二抗及过氧化物酶作用2 h，漂洗后加底物混合液作用10 min，镜下观察染色满意后用去离子水漂洗，Mayers苏木精衬染，常规脱水、封片。
, 百拇医药
结果
1.扩张后犬真皮组织学、超微结构观察：扩张后表皮组织学结构无明显改变，仅见轻度增厚。真皮层可见胶原排列致密，超微结构显示表皮层基底细胞有丝分裂活跃，内含大量大而散在的张力丝。真皮层内含有大量排列紧密的胶原纤维束，FB功能活跃，表现为细胞体积大，胞浆丰富，胞核及核仁增大，胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，沿细胞长轴平行排列，未见细胞连接(图1)。
图1 扩张后皮肤真皮层FB核见密体密斑胞浆内微丝粗大,沿细胞长轴排列(×17 000)
2.扩张后FB αSMA免疫组化染色：扩张皮肤真皮组织内αSMA染色阳性的FB分散，而对照组未见表达阳性的FB，两组小血管壁表达均呈强阳性，多位于血管分布丰富区内(图2)。
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图2 扩张后皮肤真皮层αSMA免疫组化染色阳性FB分散存在 ×140
讨论
以往研究中，发现很多病理性的变化，FB均部分转化为MFB，MFB特征性地表达αSMA，从而导致纤维化组织的挛缩[2]，而ASMA是MFB特征性标志[4]。本研究采用免疫组化方法，首 次观察扩张 后真皮内αSMA的表达发现αSMA染色阳性的肌仅分散存在，通过与瘢痕组织内存在大量αSMA阳性的MFB对比，我们认为如比少量的MFB不足以产生足够的挛缩动力，结果表明扩张刺激不足以使FB转变为MFB。因此，扩张皮肤回缩的主要动力并非是在扩张刺激下转变为MFB所致。同时实验中发现在血管密集区αSMA阳性的FB分布较多，是否说明扩张后皮肤的血管增生与向MFB转化有关是今后值得研究的课题。
扩张后真皮FB的超微结构发现FB仍表现出MFB的一些特征：合成功能旺盛，核膜皱折增加、加深，大量密体、密斑出现，微丝粗大明显。因此我们认为，扩张刺激使静息的FB功能活跃，并表现出收缩特性，这种活跃的FB虽然没有ASMA的表达，但仍具有收缩功能的亚细胞结构。因此扩张刺激所致静息FB的转变成功能活跃的FB，数目增加，使FB结构上发生改变，从细胞水平产生收缩动力，而胶原纤维的平行排行，更利于FB收缩动力的传递和集中，导致扩张皮肤的回缩。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] Piscatelli S J, Partington M, Hobar C, et al. Breast capsule contracture is fibroblast activity associated with severity. Aesth Plast Surg，1994,18:75-80.
[2] Diegelmann RF, Cohen I E, Mccoy B J, et al. Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normal scar and keloid fibroblasts in vitro.J cell Physiol. 1979,98:341-348.
[3] Dierce G F, Vandsberg J, Rucdolph R, et al.Plateletderived gowth factorbeta and transforming growth factor beta selectively modulate glycosaminoglycans, collagen, and myofibroblasts in excision wounds.Am J Pathol.1991,138:629-633.
[4] Chang B, Tchler R E, Siebert J W, et al. The effect of tissue expansion on dermal fibroblast contraction. Annal Plast Surg,1992,28:315-319.
收稿日期：1998-01-08, 百拇医药
单位：(上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科)
关键词：肌成纤维细胞；皮肤扩张术
中华医学美容杂志000110 摘 要：目的 通过对皮肤肌成纤维细胞(MFB)特征性标志α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的检测，研究扩张皮肤回缩的机理。方法 通过犬皮肤扩张实验，采用电镜观察和免疫组化等方法检测。结果 免疫组化研究发现，扩张后皮肤真皮组织内αSMA阳性成纤维细胞仅个别散在，但超微结构显示成纤维细胞内微丝粗大明显，出现密纤、密斑。结论 扩张刺激未使纤维细胞转变为肌成纤维细胞，但成纤维细胞功能活跃。具备了收缩功能的细胞结构，在细胞水平产生收缩动力，导致扩张皮肤回缩。
Experimental research on the relationship of the biological property of myofibroblasts in expanded skin contraction
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FAN Zhihong CUI Lei LI Wei
(The plastic surgery department of the 9 peoples hospital affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011，China)
Abstract： Objective To study the mechanism of the expanded skin contraction by testing the α-SMA which is the characteristic marker of myofibroblasts. Method Immunohistochemistry stain and electromicroscopic observation were adopted in the experiments of dog skin expansion.Results The immunohistochemistry showed that the α-SMA stained negatively in the dermal fibroblast while the ultrastructure of fibroblast showed that the microfilament of FB was densely.Conclusion The result shows that the fibroblast do not transfer to myofibroblasts in expanding process, but with a functional activity, and suggests that FB in expanded skin keeps the ability to contract, it also indicates that FB is the force to make the skin contract.
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Key words：Myofibooblasts；Expanded skin▲
以往研究表明，成纤维细胞fibroblast FB在扩张皮肤的一系列病理改变中发挥重要作用[1]，如胶原及其它基质的合成[2]、 真皮的改建及收缩等[3]。在很多病理改变中成纤维细胞均转变成一类具收缩功能的肌成纤维细胞(Myofibroblast, MFB)而产生收缩能力，以往研究虽推测FB的转化可能与扩张皮肤回缩有关，但对此尚存有争议，并缺乏明显的组织学证据[4]。本研究旨在观察在扩张作用下，FB生物学特性的改变，以明确FB与扩张皮肤回缩的关系。
材料与方法
一、材料
1.动物实验和分组：家养草犬20只(上海第九人民医院实验动物中心提供,雄性，2岁龄，体重(5～7) kg),分成4组，每组5只。在每只犬的背部两侧相同解剖部位,分别置入150 ml长方形硅胶扩张器，一侧为实验组，另一侧为对照组，两侧即时注入30 ml生理盐水,1周后拆线。以后实验侧每周注入生理盐水扩张1次，每次20 ml，共6次达到最终扩张容量150 ml。扩张完成后两侧同时取出扩张器，修整皮瓣原位缝合，各组分别在扩张完成取出扩张器后即时、3个月、6个月、1年取材。
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2.主要仪器、试剂：普通光学显微镜，常规组织切片、HE染色试剂，αSMA免疫组化染色试剂盒(Sigma公司提供)。
二、方法
1.病理取材：上述各组动物扩张完成后取出扩张器，各组到取材时间后，在扩张皮肤中央切取2 cm×2 cm大小皮肤2等分，一份以10 %甲醛固定，分别行HE及免疫组化染色；另一份常规戊二醛固定透射电镜检查：
2.电镜标本制作：2.5 %戊二醛和1 %锇酸固定后，梯度酒精脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片(100 um)，铀铝双重染色，HITACHI600透射电镜观察。
3.组织切片免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡、水化、0.1 %胰蛋白酶消化20 min，3 % H202去离子水漂洗，20 %小牛血清阻断后，滴加2滴一抗(antiasmantism 1)，温育2 h，洗净后滴加2滴生物素化二抗及过氧化物酶作用2 h，漂洗后加底物混合液作用10 min，镜下观察染色满意后用去离子水漂洗，Mayers苏木精衬染，常规脱水、封片。
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结果
1.扩张后犬真皮组织学、超微结构观察：扩张后表皮组织学结构无明显改变，仅见轻度增厚。真皮层可见胶原排列致密，超微结构显示表皮层基底细胞有丝分裂活跃，内含大量大而散在的张力丝。真皮层内含有大量排列紧密的胶原纤维束，FB功能活跃，表现为细胞体积大，胞浆丰富，胞核及核仁增大，胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，沿细胞长轴平行排列，未见细胞连接(图1)。
图1 扩张后皮肤真皮层FB核见密体密斑胞浆内微丝粗大,沿细胞长轴排列(×17 000)
2.扩张后FB αSMA免疫组化染色：扩张皮肤真皮组织内αSMA染色阳性的FB分散，而对照组未见表达阳性的FB，两组小血管壁表达均呈强阳性，多位于血管分布丰富区内(图2)。
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图2 扩张后皮肤真皮层αSMA免疫组化染色阳性FB分散存在 ×140
讨论
以往研究中，发现很多病理性的变化，FB均部分转化为MFB，MFB特征性地表达αSMA，从而导致纤维化组织的挛缩[2]，而ASMA是MFB特征性标志[4]。本研究采用免疫组化方法，首 次观察扩张 后真皮内αSMA的表达发现αSMA染色阳性的肌仅分散存在，通过与瘢痕组织内存在大量αSMA阳性的MFB对比，我们认为如比少量的MFB不足以产生足够的挛缩动力，结果表明扩张刺激不足以使FB转变为MFB。因此，扩张皮肤回缩的主要动力并非是在扩张刺激下转变为MFB所致。同时实验中发现在血管密集区αSMA阳性的FB分布较多，是否说明扩张后皮肤的血管增生与向MFB转化有关是今后值得研究的课题。
扩张后真皮FB的超微结构发现FB仍表现出MFB的一些特征：合成功能旺盛，核膜皱折增加、加深，大量密体、密斑出现，微丝粗大明显。因此我们认为，扩张刺激使静息的FB功能活跃，并表现出收缩特性，这种活跃的FB虽然没有ASMA的表达，但仍具有收缩功能的亚细胞结构。因此扩张刺激所致静息FB的转变成功能活跃的FB，数目增加，使FB结构上发生改变，从细胞水平产生收缩动力，而胶原纤维的平行排行，更利于FB收缩动力的传递和集中，导致扩张皮肤的回缩。■
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参考文献：
[1] Piscatelli S J, Partington M, Hobar C, et al. Breast capsule contracture is fibroblast activity associated with severity. Aesth Plast Surg，1994,18:75-80.
[2] Diegelmann RF, Cohen I E, Mccoy B J, et al. Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normal scar and keloid fibroblasts in vitro.J cell Physiol. 1979,98:341-348.
[3] Dierce G F, Vandsberg J, Rucdolph R, et al.Plateletderived gowth factorbeta and transforming growth factor beta selectively modulate glycosaminoglycans, collagen, and myofibroblasts in excision wounds.Am J Pathol.1991,138:629-633.
[4] Chang B, Tchler R E, Siebert J W, et al. The effect of tissue expansion on dermal fibroblast contraction. Annal Plast Surg,1992,28:315-319.
收稿日期：1998-01-08, 百拇医药