超临界流体萃取-HPLC法测定何首乌中大黄酸、大黄素及大黄素甲醚的含量
作者：袁海龙 柳正良 张 纯 郭澄 李仙逸
单位：袁海龙 柳正良 第二军医大学药学院(上海 200433)；张纯 郭澄 第二军医大学附属长征医院；李仙逸 中国人民解放军222医院
关键词：超临界流体萃取；HPLC；何首乌；蒽醌类成分
990409摘 要 采用超临界流体萃取法(SFE)提取中药何首乌中的蒽醌类成分，并用RP-HPLC法进行分离测定。在SFE中，通过对萃取条件的考察，确定萃取压力为42 MPa，温度70℃，改性剂量0.4 mL，静态萃取时间5 min及动态萃取体积5 mL。RP-HPLC中，以C8为固定相，甲醇-0.2%磷酸溶液(70∶30)为流动相，检测波长437 nm。本法准确可靠，何首乌中各成分的平均回收率分别为大黄酸99.1%(RSD 2.0%)、大黄素98.2%(RSD 1.1%)、大黄酚100.7%(RSD 2.6%)和大黄素甲醚99.5%(RSD 0.9%)。
, http://www.100md.com
Determination of Rhein,Emodin and Physcion in Tuber Fleeceflower
(Polygonum multiflorum)by Supercritical Fluid Extraction-HPLC
Yuan Hailong, Zhang Chun, Li Xianyi, et al.
(Pharmaceutical College of the Second Military Medical University,Shanghai 200433)
Abstract Supercritical fluid extraction(SFE)was used to extract anthraquinones in Polygonum multiflorum Thunb. and contents of rhein， emodin and physcion in the extract were determined by RP-HPLC. SFE conditions: pressure 42 MPa,temperature 70℃, 0.4 mL methanol as modifier, static extraction 5 min and dynamic extraction volume 5 mL. HPLC conditions: the HPLC column was packed with C8(5 μm); the mobile phase was methanol:0.2% phosphoric acid(70∶30);the detection wave-length was 437 nm. The method was accurate and reliable. The mean recovery was 99.1%(RSD 2.0%) for rhein, 98.2%(RSD 1.1%)for emodin,100.7%(RSD 2.6%)for chrysophanol and 99.5%(RSD 0.9%)for physcion.
, 百拇医药
Key words Ploygonum multiflorum Thunb. supercritical fluid extraction(SFE) HPLC
anthraquinones
何首乌为蓼科植物Polygonum multiflorum Thunb.的块根，具有滋补强壮、解毒消痛、润肠通便等功效。何首乌含有蒽醌类、二苯乙烯苷类及磷脂等有效成分，其中，蒽醌类是重要活性成分。已有报道采用分光光度法[1]、薄层层析法[2]及高效液相色谱法(3～6)等分析何首乌及其制剂中的蒽醌类成分，但预处理繁琐费时，分离效率不高。超临界流体萃取(SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除了可以减少有机溶剂使用外，还具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶媒便于挥发、提取物较为干净、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的萃取方法[7]。本文建立了SFE-HPLC法分离测定何首乌中的蒽醌类成分，为何首乌及其制剂的质量控制提供方法学依据。
, 百拇医药
1 仪器与试药
1.1 仪器：SP8800液相色谱仪，UV-2000检测仪，SP4400积分仪(美国光谱物理公司)；ISCO100注射泵，SFX-10超临界流体萃取仪(美国ISCO公司)；HA-202M电子天平(日本)。
1.2 试药：大黄素、大黄素甲醚、大黄酚及大黄酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)；何首乌药材购于安徽亳州药材市场，由第二军医大学药学院生药教研室鉴定；甲醇为色谱纯，氯仿为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件：色谱柱为Econosphere C85μ(250 mm×4.6 mm),流动相为甲醇-0.2%磷酸(70∶30)，流速1.2 mL/min,室温，检测波长437nm。
2.2 SFE萃取条件的选择
, 百拇医药
2.2.1 改性剂的选择：超临界CO2流体的极性与正己烷相似，因此在萃取极性成分时，一般要加入少量极性溶剂，以改善萃取效果。我们考察了甲醇、氯仿和乙酸乙酯三种溶剂，以选择甲醇萃取效率为最高，因此我们选择了甲醇作为改性剂。
2.2.2 萃取压力的选择：超临界流体具有很大的可压性，在一定温度下，压力增加，超临界流体的密度增加，溶质在流体中的溶解度增大，萃取效率提高。固定其他参数，改变压力从28～49 MPa，每隔7 MPa萃取一个点，结果见图1-A。从图可见，选择42 MPa作萃取压力较好。
2.2.3 温度的选择：恒压下，温度升高，流体密度下降，但溶解度是溶质挥发度的函数，提高温度可指数级地提高溶质的蒸气压，从而增加溶质的溶解度，提高萃取效率。改变温度40℃～80℃，每隔10℃萃取一个点，结果见图1-B。从图可见，选择萃取温度为70℃较好。
2.2.4 改性剂量的选择：加入一定量的极性改性剂可提高萃取量，但过高的改性剂量将使萃取状态在一种非临界状态下进行，往往达不到理想的萃取效果。我们选择了0.2、0.3、0.4、0.5 mL甲醇作为改性剂萃取效果良好。
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2.2.5 静态萃取时间的选择：整个超临界流体萃取过程既包含转运、又存在扩散，体质一定的静态萃取时间可提高萃取效率。我们选择了3、5、7 min三个时间，结果见图1-D。由图可见，静态萃取时间5 min较好。
A-压力 B-温度 C-改性剂量 D-静态萃取时间
E-动态萃取量 1-大黄素甲醚 2-大黄酸 3-大黄素
图1 各因素对萃取率的影响
, 百拇医药 2.2.6 动态萃取体积的选择：动态萃取体积对萃取效率影响很大，固定其它四种萃取条件，改变萃取体积3、5、7 mL，结果见图1-E。我们选择了5 mL为动态萃取体积。
2.2.7 SFE萃取工艺：经系统法考察，我们选择了以下萃取条件：萃取压力为42 MPa，温度70℃，改性剂量0.4 mL，静态萃取时间5 min，动态萃取体积5 mL。
2.3 标准曲线绘制：精密吸取各对照品适量，用甲醇配制定容，使每1 mL含大黄素30 μg、大黄酚32 μg、大黄素甲醚22 μg及大黄酸32 μg的甲醇混合溶液。精密吸取0.5、1、2、4、8 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容后依次进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：
Y大黄酸=2970971.42X+29015.62，r=0.9997
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Y大黄素=4357216.14X+28261.46，r=0.9996
Y大黄酚=3619466.72X+32043.76，r=0.9996
Y大黄素甲醚=2164933.67X+2292.77，r=0.9992
2.4 精密度实验：取样品测定项下对照品混合溶液，重复进样5 次，每次10 μL，对照品峰面积积分值的RSD值分别为大黄酸1.2%、大黄素1.7%、大黄酚0.9%、大黄素甲醚1.3%。
2.5 加样回收率试验：取已知含量的何首乌药材0.5 g，分别加入对照品溶液适量，挥干，按样品方法萃取及测定， 5次测得平均回收率分别为大黄酸99.1%(RSD 2.6%)、大黄素 98.2%(RSD 1.1%)、大黄酚 100.7%(RSD 2.6%)和大黄素甲醚99.5%(RSD 0.9%)。
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2.6 样品测定：取何首乌药材粗粉0.5 g，精密称定，以上述最佳萃取条件进行萃取，定容10 mL,精取10 μL直接进样，结果是大黄酸为0.0089 mg/g,大黄素为0.0735 mg/g,大黄素甲醚为0.0893 mg/g,大黄酚未检测到，见图2。
A-对照 B-何首乌
1-大黄酸 2-大黄素 3-大黄酚 4-大黄素甲醚
图2 对照品与样品色谱图
3 讨论
本文考察了SFE与文献报道[5]的提取方法的提取效率，其结果见表1，经t检验，P值皆小于0.05，说明两种方法无显著性差异，但SFE时间短，效率高，后处理简单。
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表1 提取方法比较(n=3) 提取方法
溶媒
提取时间
(min)
大黄酸
(mg/g)
大黄素
(mg/g)
大黄素甲醚
(mg/g)
SFE
CO2
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20
0.0089
0.0735
0.0893
超声波
甲醇 氯仿
180
0.0087
0.0740
0.0824
本文建立的HPLC法使蒽醌类成分得到很好的分离，并对何首乌中大黄酸作了定量分析。本文的固定相采用C8柱，柱的极性强于C18柱，而大黄酸极性较强，经C8柱出峰时间较为合适，分离效果良好。蒽醌类属弱酸性成分，流动相呈弱酸性条件下其保留行为得到改善。本文考察了以磷酸甲醇水溶液分离得到的峰形对称，分离效果良好 。
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*Address:Yuan Hailong College of Pharmacy ,The Second The Second Military Medical University Shanghai
袁海龙 男，1992年毕业于第二军医大学药学院，学士学位，1996年攻读硕士研究生。主要研究方向为中草药提取工艺及质量控制。已获军队科技进步奖1项，先后发表论文10余篇，其中1篇第三届岛津杯优秀论文三等奖。
参 考 文 献
1 姚桂根，等.中成药研究，1982，4(4)：12
2 孙彤云，等.中成药研究，1985，7(11)：8
3 姚桂根，等.中成药研究，1984，6(3)：8
4 徐凯健，等.中国医院药学杂志，1989，9(11)：544
5 大岛俊幸，等.药物分析杂志，1996，16(4)：219
6 吴振洁，等.中国药科大学学报，1997，28(2)：123
7 Gawdzik J,et al.J High Resolution Chromatogr,1995,18:781
(1998-08-10收稿), 百拇医药
单位：袁海龙 柳正良 第二军医大学药学院(上海 200433)；张纯 郭澄 第二军医大学附属长征医院；李仙逸 中国人民解放军222医院
关键词：超临界流体萃取；HPLC；何首乌；蒽醌类成分
990409摘 要 采用超临界流体萃取法(SFE)提取中药何首乌中的蒽醌类成分，并用RP-HPLC法进行分离测定。在SFE中，通过对萃取条件的考察，确定萃取压力为42 MPa，温度70℃，改性剂量0.4 mL，静态萃取时间5 min及动态萃取体积5 mL。RP-HPLC中，以C8为固定相，甲醇-0.2%磷酸溶液(70∶30)为流动相，检测波长437 nm。本法准确可靠，何首乌中各成分的平均回收率分别为大黄酸99.1%(RSD 2.0%)、大黄素98.2%(RSD 1.1%)、大黄酚100.7%(RSD 2.6%)和大黄素甲醚99.5%(RSD 0.9%)。
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Determination of Rhein,Emodin and Physcion in Tuber Fleeceflower
(Polygonum multiflorum)by Supercritical Fluid Extraction-HPLC
Yuan Hailong, Zhang Chun, Li Xianyi, et al.
(Pharmaceutical College of the Second Military Medical University,Shanghai 200433)
Abstract Supercritical fluid extraction(SFE)was used to extract anthraquinones in Polygonum multiflorum Thunb. and contents of rhein， emodin and physcion in the extract were determined by RP-HPLC. SFE conditions: pressure 42 MPa,temperature 70℃, 0.4 mL methanol as modifier, static extraction 5 min and dynamic extraction volume 5 mL. HPLC conditions: the HPLC column was packed with C8(5 μm); the mobile phase was methanol:0.2% phosphoric acid(70∶30);the detection wave-length was 437 nm. The method was accurate and reliable. The mean recovery was 99.1%(RSD 2.0%) for rhein, 98.2%(RSD 1.1%)for emodin,100.7%(RSD 2.6%)for chrysophanol and 99.5%(RSD 0.9%)for physcion.
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Key words Ploygonum multiflorum Thunb. supercritical fluid extraction(SFE) HPLC
anthraquinones
何首乌为蓼科植物Polygonum multiflorum Thunb.的块根，具有滋补强壮、解毒消痛、润肠通便等功效。何首乌含有蒽醌类、二苯乙烯苷类及磷脂等有效成分，其中，蒽醌类是重要活性成分。已有报道采用分光光度法[1]、薄层层析法[2]及高效液相色谱法(3～6)等分析何首乌及其制剂中的蒽醌类成分，但预处理繁琐费时，分离效率不高。超临界流体萃取(SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除了可以减少有机溶剂使用外，还具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶媒便于挥发、提取物较为干净、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的萃取方法[7]。本文建立了SFE-HPLC法分离测定何首乌中的蒽醌类成分，为何首乌及其制剂的质量控制提供方法学依据。
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1 仪器与试药
1.1 仪器：SP8800液相色谱仪，UV-2000检测仪，SP4400积分仪(美国光谱物理公司)；ISCO100注射泵，SFX-10超临界流体萃取仪(美国ISCO公司)；HA-202M电子天平(日本)。
1.2 试药：大黄素、大黄素甲醚、大黄酚及大黄酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)；何首乌药材购于安徽亳州药材市场，由第二军医大学药学院生药教研室鉴定；甲醇为色谱纯，氯仿为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件：色谱柱为Econosphere C85μ(250 mm×4.6 mm),流动相为甲醇-0.2%磷酸(70∶30)，流速1.2 mL/min,室温，检测波长437nm。
2.2 SFE萃取条件的选择
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2.2.1 改性剂的选择：超临界CO2流体的极性与正己烷相似，因此在萃取极性成分时，一般要加入少量极性溶剂，以改善萃取效果。我们考察了甲醇、氯仿和乙酸乙酯三种溶剂，以选择甲醇萃取效率为最高，因此我们选择了甲醇作为改性剂。
2.2.2 萃取压力的选择：超临界流体具有很大的可压性，在一定温度下，压力增加，超临界流体的密度增加，溶质在流体中的溶解度增大，萃取效率提高。固定其他参数，改变压力从28～49 MPa，每隔7 MPa萃取一个点，结果见图1-A。从图可见，选择42 MPa作萃取压力较好。
2.2.3 温度的选择：恒压下，温度升高，流体密度下降，但溶解度是溶质挥发度的函数，提高温度可指数级地提高溶质的蒸气压，从而增加溶质的溶解度，提高萃取效率。改变温度40℃～80℃，每隔10℃萃取一个点，结果见图1-B。从图可见，选择萃取温度为70℃较好。
2.2.4 改性剂量的选择：加入一定量的极性改性剂可提高萃取量，但过高的改性剂量将使萃取状态在一种非临界状态下进行，往往达不到理想的萃取效果。我们选择了0.2、0.3、0.4、0.5 mL甲醇作为改性剂萃取效果良好。
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2.2.5 静态萃取时间的选择：整个超临界流体萃取过程既包含转运、又存在扩散，体质一定的静态萃取时间可提高萃取效率。我们选择了3、5、7 min三个时间，结果见图1-D。由图可见，静态萃取时间5 min较好。
A-压力 B-温度 C-改性剂量 D-静态萃取时间
E-动态萃取量 1-大黄素甲醚 2-大黄酸 3-大黄素
图1 各因素对萃取率的影响
, 百拇医药 2.2.6 动态萃取体积的选择：动态萃取体积对萃取效率影响很大，固定其它四种萃取条件，改变萃取体积3、5、7 mL，结果见图1-E。我们选择了5 mL为动态萃取体积。
2.2.7 SFE萃取工艺：经系统法考察，我们选择了以下萃取条件：萃取压力为42 MPa，温度70℃，改性剂量0.4 mL，静态萃取时间5 min，动态萃取体积5 mL。
2.3 标准曲线绘制：精密吸取各对照品适量，用甲醇配制定容，使每1 mL含大黄素30 μg、大黄酚32 μg、大黄素甲醚22 μg及大黄酸32 μg的甲醇混合溶液。精密吸取0.5、1、2、4、8 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容后依次进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：
Y大黄酸=2970971.42X+29015.62，r=0.9997
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Y大黄素=4357216.14X+28261.46，r=0.9996
Y大黄酚=3619466.72X+32043.76，r=0.9996
Y大黄素甲醚=2164933.67X+2292.77，r=0.9992
2.4 精密度实验：取样品测定项下对照品混合溶液，重复进样5 次，每次10 μL，对照品峰面积积分值的RSD值分别为大黄酸1.2%、大黄素1.7%、大黄酚0.9%、大黄素甲醚1.3%。
2.5 加样回收率试验：取已知含量的何首乌药材0.5 g，分别加入对照品溶液适量，挥干，按样品方法萃取及测定， 5次测得平均回收率分别为大黄酸99.1%(RSD 2.6%)、大黄素 98.2%(RSD 1.1%)、大黄酚 100.7%(RSD 2.6%)和大黄素甲醚99.5%(RSD 0.9%)。
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2.6 样品测定：取何首乌药材粗粉0.5 g，精密称定，以上述最佳萃取条件进行萃取，定容10 mL,精取10 μL直接进样，结果是大黄酸为0.0089 mg/g,大黄素为0.0735 mg/g,大黄素甲醚为0.0893 mg/g,大黄酚未检测到，见图2。
A-对照 B-何首乌
1-大黄酸 2-大黄素 3-大黄酚 4-大黄素甲醚
图2 对照品与样品色谱图
3 讨论
本文考察了SFE与文献报道[5]的提取方法的提取效率，其结果见表1，经t检验，P值皆小于0.05，说明两种方法无显著性差异，但SFE时间短，效率高，后处理简单。
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表1 提取方法比较(n=3) 提取方法
溶媒
提取时间
(min)
大黄酸
(mg/g)
大黄素
(mg/g)
大黄素甲醚
(mg/g)
SFE
CO2
, http://www.100md.com
20
0.0089
0.0735
0.0893
超声波
甲醇 氯仿
180
0.0087
0.0740
0.0824
本文建立的HPLC法使蒽醌类成分得到很好的分离，并对何首乌中大黄酸作了定量分析。本文的固定相采用C8柱，柱的极性强于C18柱，而大黄酸极性较强，经C8柱出峰时间较为合适，分离效果良好。蒽醌类属弱酸性成分，流动相呈弱酸性条件下其保留行为得到改善。本文考察了以磷酸甲醇水溶液分离得到的峰形对称，分离效果良好 。
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*Address:Yuan Hailong College of Pharmacy ,The Second The Second Military Medical University Shanghai
袁海龙 男，1992年毕业于第二军医大学药学院，学士学位，1996年攻读硕士研究生。主要研究方向为中草药提取工艺及质量控制。已获军队科技进步奖1项，先后发表论文10余篇，其中1篇第三届岛津杯优秀论文三等奖。
参 考 文 献
1 姚桂根，等.中成药研究，1982，4(4)：12
2 孙彤云，等.中成药研究，1985，7(11)：8
3 姚桂根，等.中成药研究，1984，6(3)：8
4 徐凯健，等.中国医院药学杂志，1989，9(11)：544
5 大岛俊幸，等.药物分析杂志，1996，16(4)：219
6 吴振洁，等.中国药科大学学报，1997，28(2)：123
7 Gawdzik J,et al.J High Resolution Chromatogr,1995,18:781
(1998-08-10收稿), 百拇医药