车前草中熊果酸、齐墩果酸的HPLC测定
作者：袁珂 李根林 李俊芝 杨怡
单位：河南中医学院(郑州 450003)
关键词：车前草；熊果酸；齐墩果酸；HPLC法
中草药991208摘 要 采用HPLC法同时测定车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量。选用 C18 ODS 色谱柱，流动相：甲醇-水(88∶12)，检测波长：220 nm，流速：0.6 mL/min，柱温：25 ℃。熊果酸和齐墩果酸分别在 0.4042～2.020 μg(r=0.9984)和 0.410～2.050 μg(r=0.9997)范围内呈线性；熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为 98.2%(RSD=1.74%)和97.8%(RSD=2.24%)。该法准确、快速、灵敏，重现性好。
Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in
, 百拇医药
Asiatic Plantain(Plantago asiatica) by HPLC
Yuan Ke Li Genlin Li Junzhi et al.
(He'nan College of TCM, Zhengzhou 450003)
Abstract The contents of ursolic acid and oleanolic acid in Plantago asiatica L. was determined by HPLC. The HPLC system consisted of C18-ODS, mobile phase of methanol-water (96∶4) mixture, with detection at 220 nm, flow rate 0.6 mL/min and column temperature 25 ℃. The linear ranges of determination of ursolic acid and oleanolic acid were 0.404～2.020 μg, r=0.998 4 and 0.410～2.050 μg, r=0.999 7, respectively. The mean recovery of 98.2%, RSD 1.74%, for ursolic acid and 97.8%, RSD 2.24% for oleanolic acid is obtained. The method is sensitive, rapid and accurate with good reproducibility.
, 百拇医药
Key words Plantago major L. ursolic acid oleanolic acid
车前草为车前科植物车前 Plantago asiatica L.或平车前 P.depressa Willd.的干燥全草。车前草为传统中药，具有清热利尿、祛痰、凉血、解毒的功能，并且有致泻、护肝、降压、降低血清转氨酶、抗癌、抑菌和降低血清胆固醇的作用[1～5]。熊果酸和齐墩果酸为车前草中的主要有效成分，其含量测定方法未见报道。我们研究建立了HPLC法同时测定车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量。该法准确、快速、灵敏，重现性好。
1 仪器、样品及试剂
LC-5A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-5A 型紫外-可见检测器，C-R3 Ae plus 型数据处理机。
, 百拇医药 熊果酸、齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。
本实验所用车前草于1997年7月采自河南省郑州市郊，采集的植物标本由本院标本室王中会副教授鉴定为车前科车前 P.asiatica L.及平车前 P. depressa Willd. 的干燥全草。甲醇(色谱纯)，水(双蒸水)。
2 色谱条件
流动相为甲醇-水(88∶12)，色谱柱：C18-ODS 柱(日本岛津)，检测波长 λ=220 nm，灵敏度：0.005 AUFS，流速：0.6 mL/min，柱温：25 ℃。
3 实验方法
3.1 对照品溶液的配制：精密称取减压干燥至恒重的熊果酸对照品 2.02 mg，齐墩果酸对照品 2.05 mg，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品混合溶液，分别为 0.202 mg/mL 和 0.205 mg/mL。
, 百拇医药
3.2 样品的预处理：车前全草去泥土，阴干后经 50 ℃ 鼓风干燥 3 h，粉碎研细并过 60 目筛。精密称取 20 g，加乙醚 250 mL 置索氏提取器中提取至近无色 (16 h)，将乙醚提取液抽滤后浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至 50 mL 容量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
3.3 线性关系的考察：取上述对照品的混合溶液分别以 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL 进样分析，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为横坐标、以对照品的进样量为纵坐标作图，分别得到通过原点的直线。回归方程分别为：
Y (熊果酸)=1365732.7X-32752.9，r=0.9984
Y (齐墩果酸)=718563.7X-1591.9，r=0.9997
结果表明熊果酸进样量在 0.404～2.02 μg 范围内线性关系良好，齐墩果酸进样量在 0.410～2.050 μg 范围内线性关系良好。
, 百拇医药
3.4 精密度试验：精密吸取对照品混合溶液 5 μL，重复进样 5 次，分别测定峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 1.68%，齐墩果酸的 RSD 为 1.37%。
3.5 重复性试验：取 5 μL 同一浓度的含对照品的甲醇溶液，在上述色谱条件下连续进样 5 次，根据峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 2.74%，齐墩果酸的RSD 为 2.63%。
3.6 加样回收率试验：精密称取干燥恒重并过 60 目筛的车前草 4 份，每份 5 g，其中 2 份加入已精密称定的熊果酸、齐墩果酸各 0.5 mg，4 份样品同时提取，其方法同样品的预处理，用甲醇定容 50 mL，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为 98.21%，97.82%，RSD 分别为 1.74%，2.24%。
3.7 样品测定：分别精密吸取对照品混合溶液与样品溶液各 5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标法计算出样品中熊果酸和齐墩果酸的含量，结果见图1及表1。
, 百拇医药
A-对照品 B-样品
1-齐墩果酸 2-熊果酸
图1 对照品及样品的 HPLC 图谱
表1 车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量 熊果酸含量(%)
RSD(%)
齐墩果酸含量(%)
RSD(%)
车 前 0.284
1.08
0.227
2.84
, 百拇医药
平车前 0.276
1.63
0.204
1.92
4 讨论
4.1 由于熊果酸和齐墩果酸均属三萜酸，且结构极为相似，两者极性几乎无差别，因此在薄层板上很难将两种成分分离开，从而无法建立薄层扫描法对其进行测定。而这两种成分在天然植物中似乎又是共生共存的，因此建立 HPLC 法对其进行含量测定就显得尤为重要。但由于波长在 220 nm处，溶剂甲醇也有强吸收，故测定前必须消除背景。
4.2 从表1可以看出车前草中熊果酸的含量高于齐墩果酸。
4.3 本法简便易行、准确灵敏，适应范围广，可用于检验、评价车前草及其产品质量及生产工艺控制。
, 百拇医药
基金项目：河南省自然科学基金资助课题第9940240号
参考文献
1 中华人民共和国药典.一部.北京：人民卫生出版社，1985：50
2 江苏新医学院编：中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1977：401
3 国家医药管理局中草药情报中心站编.植物药有效成分手册.北京：人民出版社，1986(3)：968
4 成都中医学院.中药学.上海：上海科学技术出版社，1978：199
5 贾丹兵，等.中草药，1990，21(1)：24
收稿日期：1998-11-30, 百拇医药
单位：河南中医学院(郑州 450003)
关键词：车前草；熊果酸；齐墩果酸；HPLC法
中草药991208摘 要 采用HPLC法同时测定车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量。选用 C18 ODS 色谱柱，流动相：甲醇-水(88∶12)，检测波长：220 nm，流速：0.6 mL/min，柱温：25 ℃。熊果酸和齐墩果酸分别在 0.4042～2.020 μg(r=0.9984)和 0.410～2.050 μg(r=0.9997)范围内呈线性；熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为 98.2%(RSD=1.74%)和97.8%(RSD=2.24%)。该法准确、快速、灵敏，重现性好。
Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in
, 百拇医药
Asiatic Plantain(Plantago asiatica) by HPLC
Yuan Ke Li Genlin Li Junzhi et al.
(He'nan College of TCM, Zhengzhou 450003)
Abstract The contents of ursolic acid and oleanolic acid in Plantago asiatica L. was determined by HPLC. The HPLC system consisted of C18-ODS, mobile phase of methanol-water (96∶4) mixture, with detection at 220 nm, flow rate 0.6 mL/min and column temperature 25 ℃. The linear ranges of determination of ursolic acid and oleanolic acid were 0.404～2.020 μg, r=0.998 4 and 0.410～2.050 μg, r=0.999 7, respectively. The mean recovery of 98.2%, RSD 1.74%, for ursolic acid and 97.8%, RSD 2.24% for oleanolic acid is obtained. The method is sensitive, rapid and accurate with good reproducibility.
, 百拇医药
Key words Plantago major L. ursolic acid oleanolic acid
车前草为车前科植物车前 Plantago asiatica L.或平车前 P.depressa Willd.的干燥全草。车前草为传统中药，具有清热利尿、祛痰、凉血、解毒的功能，并且有致泻、护肝、降压、降低血清转氨酶、抗癌、抑菌和降低血清胆固醇的作用[1～5]。熊果酸和齐墩果酸为车前草中的主要有效成分，其含量测定方法未见报道。我们研究建立了HPLC法同时测定车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量。该法准确、快速、灵敏，重现性好。
1 仪器、样品及试剂
LC-5A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-5A 型紫外-可见检测器，C-R3 Ae plus 型数据处理机。
, 百拇医药 熊果酸、齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。
本实验所用车前草于1997年7月采自河南省郑州市郊，采集的植物标本由本院标本室王中会副教授鉴定为车前科车前 P.asiatica L.及平车前 P. depressa Willd. 的干燥全草。甲醇(色谱纯)，水(双蒸水)。
2 色谱条件
流动相为甲醇-水(88∶12)，色谱柱：C18-ODS 柱(日本岛津)，检测波长 λ=220 nm，灵敏度：0.005 AUFS，流速：0.6 mL/min，柱温：25 ℃。
3 实验方法
3.1 对照品溶液的配制：精密称取减压干燥至恒重的熊果酸对照品 2.02 mg，齐墩果酸对照品 2.05 mg，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品混合溶液，分别为 0.202 mg/mL 和 0.205 mg/mL。
, 百拇医药
3.2 样品的预处理：车前全草去泥土，阴干后经 50 ℃ 鼓风干燥 3 h，粉碎研细并过 60 目筛。精密称取 20 g，加乙醚 250 mL 置索氏提取器中提取至近无色 (16 h)，将乙醚提取液抽滤后浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至 50 mL 容量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
3.3 线性关系的考察：取上述对照品的混合溶液分别以 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL 进样分析，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为横坐标、以对照品的进样量为纵坐标作图，分别得到通过原点的直线。回归方程分别为：
Y (熊果酸)=1365732.7X-32752.9，r=0.9984
Y (齐墩果酸)=718563.7X-1591.9，r=0.9997
结果表明熊果酸进样量在 0.404～2.02 μg 范围内线性关系良好，齐墩果酸进样量在 0.410～2.050 μg 范围内线性关系良好。
, 百拇医药
3.4 精密度试验：精密吸取对照品混合溶液 5 μL，重复进样 5 次，分别测定峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 1.68%，齐墩果酸的 RSD 为 1.37%。
3.5 重复性试验：取 5 μL 同一浓度的含对照品的甲醇溶液，在上述色谱条件下连续进样 5 次，根据峰面积值，计算出熊果酸的 RSD 为 2.74%，齐墩果酸的RSD 为 2.63%。
3.6 加样回收率试验：精密称取干燥恒重并过 60 目筛的车前草 4 份，每份 5 g，其中 2 份加入已精密称定的熊果酸、齐墩果酸各 0.5 mg，4 份样品同时提取，其方法同样品的预处理，用甲醇定容 50 mL，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果熊果酸、齐墩果酸的平均回收率分别为 98.21%，97.82%，RSD 分别为 1.74%，2.24%。
3.7 样品测定：分别精密吸取对照品混合溶液与样品溶液各 5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标法计算出样品中熊果酸和齐墩果酸的含量，结果见图1及表1。
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A-对照品 B-样品
1-齐墩果酸 2-熊果酸
图1 对照品及样品的 HPLC 图谱
表1 车前草中熊果酸、齐墩果酸的含量 熊果酸含量(%)
RSD(%)
齐墩果酸含量(%)
RSD(%)
车 前 0.284
1.08
0.227
2.84
, 百拇医药
平车前 0.276
1.63
0.204
1.92
4 讨论
4.1 由于熊果酸和齐墩果酸均属三萜酸，且结构极为相似，两者极性几乎无差别，因此在薄层板上很难将两种成分分离开，从而无法建立薄层扫描法对其进行测定。而这两种成分在天然植物中似乎又是共生共存的，因此建立 HPLC 法对其进行含量测定就显得尤为重要。但由于波长在 220 nm处，溶剂甲醇也有强吸收，故测定前必须消除背景。
4.2 从表1可以看出车前草中熊果酸的含量高于齐墩果酸。
4.3 本法简便易行、准确灵敏，适应范围广，可用于检验、评价车前草及其产品质量及生产工艺控制。
, 百拇医药
基金项目：河南省自然科学基金资助课题第9940240号
参考文献
1 中华人民共和国药典.一部.北京：人民卫生出版社，1985：50
2 江苏新医学院编：中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1977：401
3 国家医药管理局中草药情报中心站编.植物药有效成分手册.北京：人民出版社，1986(3)：968
4 成都中医学院.中药学.上海：上海科学技术出版社，1978：199
5 贾丹兵，等.中草药，1990，21(1)：24
收稿日期：1998-11-30, 百拇医药
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