抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达*
作者：陈云春 于文彬 陈萍 韩骅 马越云 苏明权 丁振若
单位：陈云春，于文彬，马越云，苏明权，丁振若：第四军医大学，西京医院检验科分子生物学研究室；陈萍，韩骅：生物化学与分子生物学教研室,西安，710032参考文献
关键词：单链抗体；内毒素；核苷酸序列；基因表达
细胞与分子免疫学杂志990207摘 要：目的：构建抗内毒素(LPS)单链抗体基因，并尝试其在E.coli中的表达。方法：采用linker Primer Mix，按VH-linker-VL的结构将鼠抗LPS mAb C3A2的VH，VL基因拼接成单链抗体(ScFv)基因；用PE 373-A型全自动DNA序列分析仪测定其核苷酸序列。PCR扩增抗LPS ScFv基因并更换两端接头序列后，插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1；转染E.coli JM109，以IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。结果：扩增出的ScFv基因长735bp,序列分析表明，该序列完整、正确；SDS-PAGE显示，转染入重组质粒p4T-C3A2Fv的JM109菌经诱导后，有相对分子质量(Mr)约为52000的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗LPSScFv基因，并在E.coliJM109中表达了GST-ScFv融合蛋白。
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中国图书资料分类号：Q78
Construction,sequencing of the anti-LPS ScFv gene and
expression of GST-ScFv fusion protein
Chen Yunchun, Yu Wenbin, Chen Ping1, Han Hua1， Ma Yueyun, Su Mingquan Ding Zhenruo,(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, 1Department of Biochemistry and Molecular Biology; the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
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Keywords：ScFv lipopolysaccharide nucleotide sequence gene expression
Abstract：Aim: To construct anti-LPS single-chain Fv gene and attempt to express the GST-ScFv fusion protein in high efficiency. Methods: The VH and VL gene of mouse anti-LPS mAb were connected into ScFv gene by a flexible linker and the ScFv gene fragments were cloned into vector pGEX-4T-1. The recombinant plasmid were transfected into E.coli JM109 and the expression of targeted protein was induced with IPTG. The expressed protein was analysed by SDS-PAGE. Results: The length of ScFv gene fragments was 735 bp. The sequencing for it showed that the cloned ScFv gene fragment was correct. SDS-PAGE indicated that the recombinant plasmid p4T-C3A2 expressed a new protein band with a Mr about 52 000. Conclusion: The ScFv gene was sucessfully constructed and GST-ScFv fusion protein highly expressed in E.coli was obtained.
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在临床急症中，败血症和败血症休克为一种常见的具有生命危险的感染性疾病，多见于G-细菌引起的感染[1]。一般认为，引起败血症的主要致病因素为G-细菌的脂多糖(LPS)。长期以来，人们对败血症和败血症休克一直没有特效的治疗措施。80年代以后，人们开始研究抗不同菌属LPS的mAb并取得了一定的成功。但由于鼠源性mAb对人体具有免疫原性,而人源性mAb又存在产量低、不稳定及多为IgM类抗体等问题，致使这些mAb在临床中的应用受到了限制。
利用基因工程技术改造抗体，尤其是由连接肽连接抗体轻、重链构成的单链抗体(ScFv)，能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等优点，是进行抗体人源化改造的理想元件，为其治疗应用开辟了广阔的前景[2]。我们在获得高亲和力、与多种G-细菌均具有结合活性的抗LPS特异性mAbC3A2[3]，并已克隆出mAbC3A2VH和VL基因的基础上，构建了含抗LPSScFv基因的重组质粒，并将ScFv基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1，在E.coliJM109中得到了高水平的表达。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 E.coli JM109为本室保存。pGEM-TEasyVector:3.01kb,为Promega公司产品，有一多克隆酶切位点区域，含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、氨苄青霉素(Amp)抗性基因。pGEX-4T-1：4.97kb，(Pharmacia公司产品)，为含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达载体；含Ptac启动子和3个读框的终止码，Amp抗性，GST后接59bp的多克隆位点，GST与目的基因之间有凝血酶(thrombin)识别位点。
1.1.2 寡核苷酸引物 linker-Primer Mix，系带有linker序列的重链3′端和轻链5′端引物的等摩尔数混合物，为Pharmacia公司产品。小鼠Ig VH5′端和VL3′端引物参照文献[4]的设计，序列如下：
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引物A:5′GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG3′
引物D:5′CAGTCGACTAACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3′
1.1.3 酶及其他试剂 EcoR I和Sal I等限制性内切酶及T4DNA连接酶，均为Boehringer公司产品。pGEM-T Easy Vector Systems 和Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems，均购自Promega公司。mAb C3A2 VH和VL基因,由本室构建。
1.2 方法
1.2.1 VH和VL基因的拼接 将回收的VH和VL基因片段与linker primer Mix等摩尔浓度混合，加入dNTP至终浓度为2.5mmol/L，Taq DNA聚合酶5单位，反应体积为25μl，用液体石蜡封闭液面后进行7次循环，条件为：94℃1min，63℃4min。在上述反应液中，加入A，D引物各1μl，继续
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进行30次PCR循环，条件为：94℃1min，55℃50s，72℃1min，循环结束后于72℃保温10min。
1.2.2 ScFv基因的克隆 采用pGEM-T Easy Vector Systems试剂盒连接ScFv基因PCR产物与pGEM-T Easy Vector。以连接产物转染E.coliJM109感受态细胞，在含Amp的LB琼脂板上挑取单个菌落，小量提取质粒，并根据A，D引物所含EcoRI和SalI位点进行酶切鉴定。筛选出的含有插段的质粒，命名为pGEM-T-C3A2Fv。
1.2.3 ScFv基因的序列测定 将pGEM-T-C3A2Fv重组质粒，用Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems纯化。以10μl纯化后的DNA(0.2g/L)作为序列模板，用PE373-A型DNA序列分析仪测定其核苷酸序列并将序列输入计算机，用sequence软件进行分析。
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1.2.4 ScFv基因重组表达载体的构建 pGEM-T-C3A2Fv质粒经EcoRI和SalI双酶切,回收735bp片段，与用EcoRI和SalI双酶切开的pGEX-4T-1载体连接，构建成GST融合蛋白表达载体p4T-C3A2Fv，转化E.coli JM109感受态细胞，在含Amp的LB琼脂板上挑取单个菌落，小量提取质粒，经EcoR I和Sal I双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.5 GST-ScFv基因的诱导表达 取含p4T-C3A2-Fv正确克隆的菌种，接种于含Amp的LB液3ml中，37℃振荡培养过夜。从中取20μl转种入2ml含Amp的LB液中，37℃振荡培养2h～3h，加入0.1 mol/L IPTG5μl，37℃振荡培养4h。
1.2.6 表达蛋白的SDS-PAGE 取1ml诱导表达的菌液，离心收集菌体，加入30μl水重悬后，再加30μl2×加样缓冲液(0.125mmol/LTrisClpH6.8，10%甘油，4%SDS，4%β-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝)，混匀，煮沸(10min)，12000g离心5min，取上清用于SDS-PAGE。
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2 结果
2.1 ScFv基因的扩增 经与DNA PCR marker比较，ScFv基因扩增片段的大小约为740bp(图1)。
图1 C3A2 ScFv基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of C3A2 ScFv gene
1:DNA PCR marker; 2:C3A2 ScFv gene PCR products; 3:Negative control
2.2 质粒pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv的酶切鉴定 pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv用EcoRI和SalI双酶切后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，均可见有切下的约740bp的片段(图2)。
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图2 质粒pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzymatic map of recombinant plasmid pGEM-T-C3A2Fv and p4T-C3A2Fv
1: Plasmid pGEX-4T-1 digested with EcoR I and Sal I；2: Recombinant plasmidp4T-C3A2Fv digested with EcoR I and Sal I;3: pGEM-T Easy Vector digested with EcoR I and Sal I ;4: Recombinant plasmid pGEM-T-C3A2Fv digested with EcoR I and Sal I ;5: DNA PCR marker
2.3 ScFv基因核苷酸序列的分析 序列分析表明，C3A2 ScFv基因为735bp，包括预期的C3A2 VH，VL基因和linker序列，C3A2 VH基因处于linker的上游，C3A2 VL基因处于linker的下游(图3)。
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图3 ScFv基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the anti-LPS mAb C3A2 ScFv gene
2.4 p4T-C3A2Fv的诱导表达 含p4T-C3A2Fv重组表达质粒的菌株，经IPTG诱导后，与未诱导的同一菌株比较，在SDS-PAGE电泳图上出现1条新的蛋白带，其Mr为52000，与预计的GST-ScFv蛋白大小一致(图4)。光密度扫描结果显示，GST-ScFv融合蛋白占菌体总蛋白的25%。
图4 p4T-C3A2Fv表达蛋白的SDS-PAGE
Fig4 SDS-PAGE of GST-ScFv fusion protein expressed by p4T-C3A2Fv
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1：Uninduced pGEX-4T-1；2: Induced pGEX-4T-1；3:Protein marker；4:Induced p4T-C3A2Fv
3 讨论
ScFv基因中的VH和VL基因片段由接头linker连在一起，VH和VL基因的取向可有两种方式：VH-linker-VL或VL-linker-VH。VH-linker-VL型结构的ScFv对抗原的亲和力较有利[5]，故我们构建的抗LPS的ScFv基因，选用了VH-linker-VL型结构。在ScFv基因的构建中，linker的设计是一个重要的环节，linker应能保持VH，VL自由、正确的折叠，使抗原结合位点处于适当构型。一般认为，linker的长度以14～25个氨基酸为宜，较长的linker对ScFv的折叠及稳定性有益，但易受蛋白酶的攻击；短于14个氨基酸残基的linker，则可能引起ScFv稳定性与活性降低[6]。我们采用了Huston设计的一段15肽linker：(Gly4Ser)3。此种linker与抗体Fab中的VH和VL间隙相当，VH和VL连接后不影响各结构域之间的相对位置和空间结构。
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本文将ScFv基因插入E.coli高效表达载体pGEX-4T-1中进行了融合表达。融合蛋白的表达系统，可克服在转录与转录后水平上对外源基因表达可能带来的不利影响[7]。在E.coli中表达融合蛋白也有其自身的优点：表达蛋白在细菌菌体内比较稳定，易实现高效表达，基因操作简便，一般经过特殊设计用特异的蛋白酶水解，即可切除融合蛋白氨基端的GST，获得具有生物学活性的天然蛋白分子。在pGEX-4T-1表达载体中，启动子的选择，SD与AUG之间的距离，核苷酸的组成，以及融合蛋白5′端的序列，均是优化后的搭配；其SD序列的下游是GST基因，外源基因连接在GST基因的下游，表达产物为GST与目的基因的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体形式出现，有利于防止蛋白酶对表达蛋白的水解及纯化。但包涵体形成后，表达蛋白不表现其生物学活性，还须进行溶解包涵体及复性表达蛋白等后期工作。
*国家自然科学基金资助项目，No.39800154
作者简介：陈云春，男，26岁，硕士生。西安市长乐西路15号，Tel(029)3375572
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参考文献
[1]Centers for Disease Control. Increase in National Hospital Survey Rates for Septicemia-Unitied States,(1979～1987). MMWR,1988; 26: 427～434
[2]Winter G, Milstein C. Man-made antibodies. Nature, 1991; 349: 293～299
[3]马越云，丁振若，于文彬,等.抗LPSHDLmAb的交叉反应性.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(4)：61～64
[4]杨安钢，吉昌华，韩骅，等.抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定.生物化学与生物物理进展，1992；19(4)：286～288
, 百拇医药
[5]Anand NN, Mandal S, Mackenzie CR，et al. Bacterial expression and secretion of various single-chain Fv genes encoding proteins specific for a Salmonella serotype B O-antigen. J Biol Chem, 1991;266(32): 21874～21879
[6]Pantoliono MW, Bird RE, Johnson S，et al.Conformtaional stability, folding and ligand- binding affinity of single-chain Fv immunoglobulin fragments expressed in Escherichia coli. Biochemistry, 1991;30:10117～10125
[7]龙建银，王会信.外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展.生物化学与生物物理进展，1997；24：126～132
收稿：1998-12-22
修回：1999-03-19, 百拇医药
单位：陈云春，于文彬，马越云，苏明权，丁振若：第四军医大学，西京医院检验科分子生物学研究室；陈萍，韩骅：生物化学与分子生物学教研室,西安，710032参考文献
关键词：单链抗体；内毒素；核苷酸序列；基因表达
细胞与分子免疫学杂志990207摘 要：目的：构建抗内毒素(LPS)单链抗体基因，并尝试其在E.coli中的表达。方法：采用linker Primer Mix，按VH-linker-VL的结构将鼠抗LPS mAb C3A2的VH，VL基因拼接成单链抗体(ScFv)基因；用PE 373-A型全自动DNA序列分析仪测定其核苷酸序列。PCR扩增抗LPS ScFv基因并更换两端接头序列后，插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1；转染E.coli JM109，以IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。结果：扩增出的ScFv基因长735bp,序列分析表明，该序列完整、正确；SDS-PAGE显示，转染入重组质粒p4T-C3A2Fv的JM109菌经诱导后，有相对分子质量(Mr)约为52000的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗LPSScFv基因，并在E.coliJM109中表达了GST-ScFv融合蛋白。
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中国图书资料分类号：Q78
Construction,sequencing of the anti-LPS ScFv gene and
expression of GST-ScFv fusion protein
Chen Yunchun, Yu Wenbin, Chen Ping1, Han Hua1， Ma Yueyun, Su Mingquan Ding Zhenruo,(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, 1Department of Biochemistry and Molecular Biology; the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
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Keywords：ScFv lipopolysaccharide nucleotide sequence gene expression
Abstract：Aim: To construct anti-LPS single-chain Fv gene and attempt to express the GST-ScFv fusion protein in high efficiency. Methods: The VH and VL gene of mouse anti-LPS mAb were connected into ScFv gene by a flexible linker and the ScFv gene fragments were cloned into vector pGEX-4T-1. The recombinant plasmid were transfected into E.coli JM109 and the expression of targeted protein was induced with IPTG. The expressed protein was analysed by SDS-PAGE. Results: The length of ScFv gene fragments was 735 bp. The sequencing for it showed that the cloned ScFv gene fragment was correct. SDS-PAGE indicated that the recombinant plasmid p4T-C3A2 expressed a new protein band with a Mr about 52 000. Conclusion: The ScFv gene was sucessfully constructed and GST-ScFv fusion protein highly expressed in E.coli was obtained.
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在临床急症中，败血症和败血症休克为一种常见的具有生命危险的感染性疾病，多见于G-细菌引起的感染[1]。一般认为，引起败血症的主要致病因素为G-细菌的脂多糖(LPS)。长期以来，人们对败血症和败血症休克一直没有特效的治疗措施。80年代以后，人们开始研究抗不同菌属LPS的mAb并取得了一定的成功。但由于鼠源性mAb对人体具有免疫原性,而人源性mAb又存在产量低、不稳定及多为IgM类抗体等问题，致使这些mAb在临床中的应用受到了限制。
利用基因工程技术改造抗体，尤其是由连接肽连接抗体轻、重链构成的单链抗体(ScFv)，能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等优点，是进行抗体人源化改造的理想元件，为其治疗应用开辟了广阔的前景[2]。我们在获得高亲和力、与多种G-细菌均具有结合活性的抗LPS特异性mAbC3A2[3]，并已克隆出mAbC3A2VH和VL基因的基础上，构建了含抗LPSScFv基因的重组质粒，并将ScFv基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1，在E.coliJM109中得到了高水平的表达。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 E.coli JM109为本室保存。pGEM-TEasyVector:3.01kb,为Promega公司产品，有一多克隆酶切位点区域，含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、氨苄青霉素(Amp)抗性基因。pGEX-4T-1：4.97kb，(Pharmacia公司产品)，为含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达载体；含Ptac启动子和3个读框的终止码，Amp抗性，GST后接59bp的多克隆位点，GST与目的基因之间有凝血酶(thrombin)识别位点。
1.1.2 寡核苷酸引物 linker-Primer Mix，系带有linker序列的重链3′端和轻链5′端引物的等摩尔数混合物，为Pharmacia公司产品。小鼠Ig VH5′端和VL3′端引物参照文献[4]的设计，序列如下：
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引物A:5′GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG3′
引物D:5′CAGTCGACTAACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3′
1.1.3 酶及其他试剂 EcoR I和Sal I等限制性内切酶及T4DNA连接酶，均为Boehringer公司产品。pGEM-T Easy Vector Systems 和Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems，均购自Promega公司。mAb C3A2 VH和VL基因,由本室构建。
1.2 方法
1.2.1 VH和VL基因的拼接 将回收的VH和VL基因片段与linker primer Mix等摩尔浓度混合，加入dNTP至终浓度为2.5mmol/L，Taq DNA聚合酶5单位，反应体积为25μl，用液体石蜡封闭液面后进行7次循环，条件为：94℃1min，63℃4min。在上述反应液中，加入A，D引物各1μl，继续
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进行30次PCR循环，条件为：94℃1min，55℃50s，72℃1min，循环结束后于72℃保温10min。
1.2.2 ScFv基因的克隆 采用pGEM-T Easy Vector Systems试剂盒连接ScFv基因PCR产物与pGEM-T Easy Vector。以连接产物转染E.coliJM109感受态细胞，在含Amp的LB琼脂板上挑取单个菌落，小量提取质粒，并根据A，D引物所含EcoRI和SalI位点进行酶切鉴定。筛选出的含有插段的质粒，命名为pGEM-T-C3A2Fv。
1.2.3 ScFv基因的序列测定 将pGEM-T-C3A2Fv重组质粒，用Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems纯化。以10μl纯化后的DNA(0.2g/L)作为序列模板，用PE373-A型DNA序列分析仪测定其核苷酸序列并将序列输入计算机，用sequence软件进行分析。
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1.2.4 ScFv基因重组表达载体的构建 pGEM-T-C3A2Fv质粒经EcoRI和SalI双酶切,回收735bp片段，与用EcoRI和SalI双酶切开的pGEX-4T-1载体连接，构建成GST融合蛋白表达载体p4T-C3A2Fv，转化E.coli JM109感受态细胞，在含Amp的LB琼脂板上挑取单个菌落，小量提取质粒，经EcoR I和Sal I双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.5 GST-ScFv基因的诱导表达 取含p4T-C3A2-Fv正确克隆的菌种，接种于含Amp的LB液3ml中，37℃振荡培养过夜。从中取20μl转种入2ml含Amp的LB液中，37℃振荡培养2h～3h，加入0.1 mol/L IPTG5μl，37℃振荡培养4h。
1.2.6 表达蛋白的SDS-PAGE 取1ml诱导表达的菌液，离心收集菌体，加入30μl水重悬后，再加30μl2×加样缓冲液(0.125mmol/LTrisClpH6.8，10%甘油，4%SDS，4%β-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝)，混匀，煮沸(10min)，12000g离心5min，取上清用于SDS-PAGE。
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2 结果
2.1 ScFv基因的扩增 经与DNA PCR marker比较，ScFv基因扩增片段的大小约为740bp(图1)。
图1 C3A2 ScFv基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of C3A2 ScFv gene
1:DNA PCR marker; 2:C3A2 ScFv gene PCR products; 3:Negative control
2.2 质粒pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv的酶切鉴定 pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv用EcoRI和SalI双酶切后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，均可见有切下的约740bp的片段(图2)。
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图2 质粒pGEM-T-C3A2Fv及p4T-C3A2Fv的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzymatic map of recombinant plasmid pGEM-T-C3A2Fv and p4T-C3A2Fv
1: Plasmid pGEX-4T-1 digested with EcoR I and Sal I；2: Recombinant plasmidp4T-C3A2Fv digested with EcoR I and Sal I;3: pGEM-T Easy Vector digested with EcoR I and Sal I ;4: Recombinant plasmid pGEM-T-C3A2Fv digested with EcoR I and Sal I ;5: DNA PCR marker
2.3 ScFv基因核苷酸序列的分析 序列分析表明，C3A2 ScFv基因为735bp，包括预期的C3A2 VH，VL基因和linker序列，C3A2 VH基因处于linker的上游，C3A2 VL基因处于linker的下游(图3)。
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图3 ScFv基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the anti-LPS mAb C3A2 ScFv gene
2.4 p4T-C3A2Fv的诱导表达 含p4T-C3A2Fv重组表达质粒的菌株，经IPTG诱导后，与未诱导的同一菌株比较，在SDS-PAGE电泳图上出现1条新的蛋白带，其Mr为52000，与预计的GST-ScFv蛋白大小一致(图4)。光密度扫描结果显示，GST-ScFv融合蛋白占菌体总蛋白的25%。
图4 p4T-C3A2Fv表达蛋白的SDS-PAGE
Fig4 SDS-PAGE of GST-ScFv fusion protein expressed by p4T-C3A2Fv
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1：Uninduced pGEX-4T-1；2: Induced pGEX-4T-1；3:Protein marker；4:Induced p4T-C3A2Fv
3 讨论
ScFv基因中的VH和VL基因片段由接头linker连在一起，VH和VL基因的取向可有两种方式：VH-linker-VL或VL-linker-VH。VH-linker-VL型结构的ScFv对抗原的亲和力较有利[5]，故我们构建的抗LPS的ScFv基因，选用了VH-linker-VL型结构。在ScFv基因的构建中，linker的设计是一个重要的环节，linker应能保持VH，VL自由、正确的折叠，使抗原结合位点处于适当构型。一般认为，linker的长度以14～25个氨基酸为宜，较长的linker对ScFv的折叠及稳定性有益，但易受蛋白酶的攻击；短于14个氨基酸残基的linker，则可能引起ScFv稳定性与活性降低[6]。我们采用了Huston设计的一段15肽linker：(Gly4Ser)3。此种linker与抗体Fab中的VH和VL间隙相当，VH和VL连接后不影响各结构域之间的相对位置和空间结构。
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本文将ScFv基因插入E.coli高效表达载体pGEX-4T-1中进行了融合表达。融合蛋白的表达系统，可克服在转录与转录后水平上对外源基因表达可能带来的不利影响[7]。在E.coli中表达融合蛋白也有其自身的优点：表达蛋白在细菌菌体内比较稳定，易实现高效表达，基因操作简便，一般经过特殊设计用特异的蛋白酶水解，即可切除融合蛋白氨基端的GST，获得具有生物学活性的天然蛋白分子。在pGEX-4T-1表达载体中，启动子的选择，SD与AUG之间的距离，核苷酸的组成，以及融合蛋白5′端的序列，均是优化后的搭配；其SD序列的下游是GST基因，外源基因连接在GST基因的下游，表达产物为GST与目的基因的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体形式出现，有利于防止蛋白酶对表达蛋白的水解及纯化。但包涵体形成后，表达蛋白不表现其生物学活性，还须进行溶解包涵体及复性表达蛋白等后期工作。
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作者简介：陈云春，男，26岁，硕士生。西安市长乐西路15号，Tel(029)3375572
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参考文献
[1]Centers for Disease Control. Increase in National Hospital Survey Rates for Septicemia-Unitied States,(1979～1987). MMWR,1988; 26: 427～434
[2]Winter G, Milstein C. Man-made antibodies. Nature, 1991; 349: 293～299
[3]马越云，丁振若，于文彬,等.抗LPSHDLmAb的交叉反应性.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(4)：61～64
[4]杨安钢，吉昌华，韩骅，等.抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定.生物化学与生物物理进展，1992；19(4)：286～288
, 百拇医药
[5]Anand NN, Mandal S, Mackenzie CR，et al. Bacterial expression and secretion of various single-chain Fv genes encoding proteins specific for a Salmonella serotype B O-antigen. J Biol Chem, 1991;266(32): 21874～21879
[6]Pantoliono MW, Bird RE, Johnson S，et al.Conformtaional stability, folding and ligand- binding affinity of single-chain Fv immunoglobulin fragments expressed in Escherichia coli. Biochemistry, 1991;30:10117～10125
[7]龙建银，王会信.外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展.生物化学与生物物理进展，1997；24：126～132
收稿：1998-12-22
修回：1999-03-19, 百拇医药