蓖麻毒素诱导U937细胞分泌IL-6和IL-8的作用
作者：董巨莹 张小光 赵英 药立波 苏成芝
单位：董巨莹(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；张小光(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；赵英(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；药立波(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；苏成芝(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)
关键词：蓖麻毒素；U937细胞；IL-6；IL-8
中国免疫学杂志000802 摘 要 目的：进一步研究蓖麻毒素是否具有诱生U937细胞分泌细胞因子的作用。方法：采用MTT法检测了蓖麻毒素对U937细胞的毒性，并采用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-6和IL-8。结果：蓖麻毒素对U937细胞的毒性具有时间效应和剂量效应。随着作用时间的延长，诱生2种细胞因子的量逐渐增加；随蓖麻毒素剂量的增加，诱生2种细胞因子的量均减少。结论：蓖麻毒素诱导2种细胞因子的产生为其抗癌应用或其它作用提供理论依据。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.31
Induction of IL-6 and IL-8 on U937 cell by ricin
DONG Ju-Ying，ZHANG Xiao-Guang，ZHAO Ying et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032
Abstract Objective:Ricin is a glycoprotein from ricinus communis seeds.In order to study induction of cytokine by ricin.Methods:The toxicity has been detected by MTT method and production of IL-6 and IL-8 has been detected by Kit.Results:It showed that the toxicity of ricin for U937 cell has time-responses and dose-responses. Both of cytokines have increased as the time is prolonged.Conclusion： Production of cytokines may have a role in the pathogenesis of ricin toxic effect and anticancer.
, 百拇医药
Key words Ricin U937 cells Interleukin-6(IL-6) Interleukin-8(IL-8)
蓖麻毒素(ricin)是存在于蓖麻籽中的一种糖蛋白。以往认为，它能使真核细胞内的核糖体60 S亚基灭活，从而抑制细胞内蛋白质合成导致细胞死亡[1]。近期研究表明，ricin的毒性作用除可抑制核糖体外，还能诱导人外周血单核细胞或U937细胞产生TNF-α和IL-1β[2，3]，这些细胞因子的产生对正常组织具有强烈的毒性作用，但对癌细胞也具有杀伤力。本研究采用ELISA法检测了蓖麻毒素诱生U937细胞产生IL-6和IL-8的作用，该研究为蓖麻毒素的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 噻唑蓝(MTT)为Fluke公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司。细胞培养液RPMI1640购于Gibco公司。IL-6和IL-8检测试剂盒购于美国Genzyme公司，深圳晶美公司分装。U937细胞购于上海细胞生物所。蓖麻毒素按Lappi方法提取[4]，纯化的蓖麻毒素经非还原性的SDS-PAGE鉴定为单一条带，相对分子质量(Mr)为65 000 kD。
, 百拇医药
1.2 蓖麻毒素对U937细胞的毒性测定 U937细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI1640在CO2孵箱中培养至对数生长期时，收集计数后，在96孔培养板中每孔加入1×105个细胞。实验分为2组，一组加入不同浓度的蓖麻毒素，作用24 h；另一组加入1 pmol/L 的蓖麻素素作用不同的时间。同时设阴性及阳性对照，阴性对照不加细胞，其他同实验组；阳性对照加细胞，不加蓖麻毒素，其它同实验组。每5孔为1组，细胞浓度相同，每孔体积为200 μl。培养一定时间后，移去上清液，用培养液洗涤2次，加入新鲜配制的MTT(以5 mg/ml的浓度每孔加入20 μl)。作用4 h后，出现蓝黑色结晶，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡15 min，使结晶充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸收值，记录结果。
1.3 蓖麻毒素对细胞因子的诱生 细胞培养上清的收集：以含10%的小牛血清、20 mmol/L HEPES的RPMI1640培养液，于37℃ CO2孵箱中培养U937细胞。将细胞分装于96孔培养板中，每孔细胞数为1×105个，每5孔为1组，分别加入1 pmol/L的ricin及其修饰物，于6、12、24和48 h收集培养上清。按不同浓度(0、1、10及100 pmol/L)的蓖麻毒素作用于U937细胞，24 h后收集细胞培养上清，于-80℃冻存备用。细胞因子的检测：按照kit的要求进行操作。数据整理和结果判断：以标准品的浓度为横座标，A值为纵座标，绘制标准曲线。根据标本的A值可从标准曲线上查出其浓度。每个标准品和标本的A值应减去空白对照的A值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 蓖麻毒素对U937细胞的毒性 用ELISA于波长490 nm检测同一时间不同浓度的蓖麻素素与U937细胞作用的A值(见图1)，以及同一浓度、不同作用时间的蓖麻毒素与U937细胞作用的A值(见图2)。取每组5个数据的均数，进行统计学处理，两两比较，观察各组间相差是否显著。由结果可看出：随蓖麻毒素浓度的增加和作用时间的延长，对U937细胞的毒性也增加。
图1 不同浓度的蓖麻毒素与U937细胞作用24 h时的A值
Fig.1 A value of interaction of ricin in different concentration with U937 at 24 h
, http://www.100md.com
图2 1 pmol/L蓖麻毒素与U937细胞作用不同时间的A值
Fig.2 A value of interaction of ricin in 1 pmol/L with U937 at each time points
2.2 蓖麻毒素对U937细胞的诱生作用
2.2.1 蓖麻毒素作用不同时间对诱生IL-6和IL-8的影响 1 pmol/L的蓖麻毒素作用于U937细胞后，在不同时间点测定IL-6和IL-8的分泌量。由图3可看出，蓖麻毒素作用U937细胞后，分泌IL-8的量随作用时间的延长而逐渐增高；而蓖麻毒素诱生IL-6 的量则随时间的延长也逐渐增高，但增高的幅度很小。
2.2.2 不同剂量的蓖麻毒素对诱生IL-6和IL-8的影响 将不同浓度的蓖麻毒素作用于U937细胞24 h，检测U937细胞分泌IL-6和IL-8的量。图4显示，总的趋势IL-8的量较IL-6 的量要高。IL-6随蓖麻毒素浓度的增高变化不大，而IL-8随浓度的增高明显降低。
, http://www.100md.com
图3 蓖麻毒素作用不同时间对诱生细胞因子的影响
Fig.3 The effect of ricin inducing cytokine at each time points
Note:The concentration of ricin is 10-12mol/L;cytokine concentration of untreated cell is ajusted to zero at each time point
图4 不同浓度的蓖麻毒素诱生细胞因子作用
Fig.4 The effect of ricin inducing cytokine at different concentration
, 百拇医药
Note:The time of ricin interaction with U937 cell at 24 h
3 讨论
蓖麻毒素是由A、B两条肽链通过二硫键构成的糖蛋白。以往认为蓖麻毒素的中毒机理是由于蓖麻毒素分子中有半乳糖结合位点可非特异地与真核细胞膜表面的β-1，4-甙键半乳糖残基结合，而后A链穿过细胞膜，与核糖体60 S亚基结合而抑制蛋白质合成，导致细胞中毒死亡。但小鼠蓖麻毒素中毒后病理解剖观察各个组织脏器均出现不同程度的出血、炎症和坏死等症状[5]，这些现象用目前的中毒机理是不能完全解释的。本研究小组已经证实蓖麻毒素能够诱生TNF-α和IL-β的作用，又采用同样的方法检测了其作用于U937细胞后对IL-6和IL-8的诱生作用。研究结果表明蓖麻毒素对U937细胞的毒性具有时间依赖性和剂量依赖性，从MTT检测结果找出恰当的作用时间点和剂量点，较低剂量的蓖麻毒素能够诱导细胞产生细胞因子，且诱生的IL-8的量明显高于IL-6，而高剂量的蓖麻毒素对细胞具有强烈的毒性作用，可杀伤细胞而不诱导其活化，因此释放的细胞因子明显减少。
, 百拇医药
在蓖麻毒素诱导细胞的时间效应图显示：IL-6和IL-8都是在6 h后才产生，随着时间的延长，IL-8的量明显增大，达48 h时维持在一个坪值；而IL-6的量随时间的延长变化不大。实验证实蓖麻毒素TNF和IL-1也是蓖麻毒素作用6 h后才产生，由此推测蓖麻毒素本身的作用能够诱导IL-8的产生。随着时间的延长，U937细胞可能受到TNF、IL-1的协同作用，而致细胞分泌IL-8持续增高。
蓖麻毒素诱导分泌IL-6和IL-8的机制可能由于蓖麻毒素结构中的半乳糖配体与细胞膜表面含半乳糖残基的受体相互作用的结果[6]。蓖麻毒素通过其结构中的糖结合位点，刺激细胞受体后，可能激活了Ras-MAPK途径、JAK-STAT途径或导致Ca2+的升高，介导核转录因子使其表达细胞因子[7]。蓖麻毒素诱导细胞因子的产生在免疫及抗肿瘤等方面的活性，使它在临床应用中具有诱人的前景。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39500122)
, 百拇医药
通讯作者，福建厦门大学生物系，厦门361005
作者简介：董巨莹，女，34岁，博士，主要从事蓖麻毒素及其修饰的研究
4 参考文献
[1]Robert B W，John F H，Mark A P.Ricin:mechanism of action，detection，and intoxication.J Toxiol，1995;14(4):483
[2]Federico L，Mana C M.Ricin induces the production of tumour necrosis factor-α and interleukin-1β by human peripheral-blood mononuclear cells.Biochem J，1993;294:517
, http://www.100md.com
[3]董巨莹，李 琦，赵 英.蓖麻毒素及其修饰物对U937细胞诱生TNF和IL-1的作用.细胞与分子免疫学杂志，1999；15(2)：17
[4]Lappi D A.Dissulfide bond connecting chains of ricin.Proc Natl Acad Sci USA，1978;75:1096
[5]董巨莹，王文学，曹云新.蓖麻毒素被修饰前后在小鼠主要脏器的定位比较研究.第四军医大学学报，1995；16(1)：17
[6]Gerard N P，Gerard C.The chemotactic receptor for human C5a anaphylatoxin.Nature，1991;349:614
[7]Peiech S Z，Sanghera J S.MAP kinases:charting the regulation pathway.Science，1992;257:1333
[收稿：1999-03-21 修回：1999-06-20], http://www.100md.com
单位：董巨莹(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；张小光(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；赵英(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；药立波(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)；苏成芝(第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安710032)
关键词：蓖麻毒素；U937细胞；IL-6；IL-8
中国免疫学杂志000802 摘 要 目的：进一步研究蓖麻毒素是否具有诱生U937细胞分泌细胞因子的作用。方法：采用MTT法检测了蓖麻毒素对U937细胞的毒性，并采用ELISA法测定细胞培养上清中的IL-6和IL-8。结果：蓖麻毒素对U937细胞的毒性具有时间效应和剂量效应。随着作用时间的延长，诱生2种细胞因子的量逐渐增加；随蓖麻毒素剂量的增加，诱生2种细胞因子的量均减少。结论：蓖麻毒素诱导2种细胞因子的产生为其抗癌应用或其它作用提供理论依据。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.31
Induction of IL-6 and IL-8 on U937 cell by ricin
DONG Ju-Ying，ZHANG Xiao-Guang，ZHAO Ying et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032
Abstract Objective:Ricin is a glycoprotein from ricinus communis seeds.In order to study induction of cytokine by ricin.Methods:The toxicity has been detected by MTT method and production of IL-6 and IL-8 has been detected by Kit.Results:It showed that the toxicity of ricin for U937 cell has time-responses and dose-responses. Both of cytokines have increased as the time is prolonged.Conclusion： Production of cytokines may have a role in the pathogenesis of ricin toxic effect and anticancer.
, 百拇医药
Key words Ricin U937 cells Interleukin-6(IL-6) Interleukin-8(IL-8)
蓖麻毒素(ricin)是存在于蓖麻籽中的一种糖蛋白。以往认为，它能使真核细胞内的核糖体60 S亚基灭活，从而抑制细胞内蛋白质合成导致细胞死亡[1]。近期研究表明，ricin的毒性作用除可抑制核糖体外，还能诱导人外周血单核细胞或U937细胞产生TNF-α和IL-1β[2，3]，这些细胞因子的产生对正常组织具有强烈的毒性作用，但对癌细胞也具有杀伤力。本研究采用ELISA法检测了蓖麻毒素诱生U937细胞产生IL-6和IL-8的作用，该研究为蓖麻毒素的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 噻唑蓝(MTT)为Fluke公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司。细胞培养液RPMI1640购于Gibco公司。IL-6和IL-8检测试剂盒购于美国Genzyme公司，深圳晶美公司分装。U937细胞购于上海细胞生物所。蓖麻毒素按Lappi方法提取[4]，纯化的蓖麻毒素经非还原性的SDS-PAGE鉴定为单一条带，相对分子质量(Mr)为65 000 kD。
, 百拇医药
1.2 蓖麻毒素对U937细胞的毒性测定 U937细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI1640在CO2孵箱中培养至对数生长期时，收集计数后，在96孔培养板中每孔加入1×105个细胞。实验分为2组，一组加入不同浓度的蓖麻毒素，作用24 h；另一组加入1 pmol/L 的蓖麻素素作用不同的时间。同时设阴性及阳性对照，阴性对照不加细胞，其他同实验组；阳性对照加细胞，不加蓖麻毒素，其它同实验组。每5孔为1组，细胞浓度相同，每孔体积为200 μl。培养一定时间后，移去上清液，用培养液洗涤2次，加入新鲜配制的MTT(以5 mg/ml的浓度每孔加入20 μl)。作用4 h后，出现蓝黑色结晶，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡15 min，使结晶充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸收值，记录结果。
1.3 蓖麻毒素对细胞因子的诱生 细胞培养上清的收集：以含10%的小牛血清、20 mmol/L HEPES的RPMI1640培养液，于37℃ CO2孵箱中培养U937细胞。将细胞分装于96孔培养板中，每孔细胞数为1×105个，每5孔为1组，分别加入1 pmol/L的ricin及其修饰物，于6、12、24和48 h收集培养上清。按不同浓度(0、1、10及100 pmol/L)的蓖麻毒素作用于U937细胞，24 h后收集细胞培养上清，于-80℃冻存备用。细胞因子的检测：按照kit的要求进行操作。数据整理和结果判断：以标准品的浓度为横座标，A值为纵座标，绘制标准曲线。根据标本的A值可从标准曲线上查出其浓度。每个标准品和标本的A值应减去空白对照的A值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 蓖麻毒素对U937细胞的毒性 用ELISA于波长490 nm检测同一时间不同浓度的蓖麻素素与U937细胞作用的A值(见图1)，以及同一浓度、不同作用时间的蓖麻毒素与U937细胞作用的A值(见图2)。取每组5个数据的均数，进行统计学处理，两两比较，观察各组间相差是否显著。由结果可看出：随蓖麻毒素浓度的增加和作用时间的延长，对U937细胞的毒性也增加。
图1 不同浓度的蓖麻毒素与U937细胞作用24 h时的A值
Fig.1 A value of interaction of ricin in different concentration with U937 at 24 h
, http://www.100md.com
图2 1 pmol/L蓖麻毒素与U937细胞作用不同时间的A值
Fig.2 A value of interaction of ricin in 1 pmol/L with U937 at each time points
2.2 蓖麻毒素对U937细胞的诱生作用
2.2.1 蓖麻毒素作用不同时间对诱生IL-6和IL-8的影响 1 pmol/L的蓖麻毒素作用于U937细胞后，在不同时间点测定IL-6和IL-8的分泌量。由图3可看出，蓖麻毒素作用U937细胞后，分泌IL-8的量随作用时间的延长而逐渐增高；而蓖麻毒素诱生IL-6 的量则随时间的延长也逐渐增高，但增高的幅度很小。
2.2.2 不同剂量的蓖麻毒素对诱生IL-6和IL-8的影响 将不同浓度的蓖麻毒素作用于U937细胞24 h，检测U937细胞分泌IL-6和IL-8的量。图4显示，总的趋势IL-8的量较IL-6 的量要高。IL-6随蓖麻毒素浓度的增高变化不大，而IL-8随浓度的增高明显降低。
, http://www.100md.com
图3 蓖麻毒素作用不同时间对诱生细胞因子的影响
Fig.3 The effect of ricin inducing cytokine at each time points
Note:The concentration of ricin is 10-12mol/L;cytokine concentration of untreated cell is ajusted to zero at each time point
图4 不同浓度的蓖麻毒素诱生细胞因子作用
Fig.4 The effect of ricin inducing cytokine at different concentration
, 百拇医药
Note:The time of ricin interaction with U937 cell at 24 h
3 讨论
蓖麻毒素是由A、B两条肽链通过二硫键构成的糖蛋白。以往认为蓖麻毒素的中毒机理是由于蓖麻毒素分子中有半乳糖结合位点可非特异地与真核细胞膜表面的β-1，4-甙键半乳糖残基结合，而后A链穿过细胞膜，与核糖体60 S亚基结合而抑制蛋白质合成，导致细胞中毒死亡。但小鼠蓖麻毒素中毒后病理解剖观察各个组织脏器均出现不同程度的出血、炎症和坏死等症状[5]，这些现象用目前的中毒机理是不能完全解释的。本研究小组已经证实蓖麻毒素能够诱生TNF-α和IL-β的作用，又采用同样的方法检测了其作用于U937细胞后对IL-6和IL-8的诱生作用。研究结果表明蓖麻毒素对U937细胞的毒性具有时间依赖性和剂量依赖性，从MTT检测结果找出恰当的作用时间点和剂量点，较低剂量的蓖麻毒素能够诱导细胞产生细胞因子，且诱生的IL-8的量明显高于IL-6，而高剂量的蓖麻毒素对细胞具有强烈的毒性作用，可杀伤细胞而不诱导其活化，因此释放的细胞因子明显减少。
, 百拇医药
在蓖麻毒素诱导细胞的时间效应图显示：IL-6和IL-8都是在6 h后才产生，随着时间的延长，IL-8的量明显增大，达48 h时维持在一个坪值；而IL-6的量随时间的延长变化不大。实验证实蓖麻毒素TNF和IL-1也是蓖麻毒素作用6 h后才产生，由此推测蓖麻毒素本身的作用能够诱导IL-8的产生。随着时间的延长，U937细胞可能受到TNF、IL-1的协同作用，而致细胞分泌IL-8持续增高。
蓖麻毒素诱导分泌IL-6和IL-8的机制可能由于蓖麻毒素结构中的半乳糖配体与细胞膜表面含半乳糖残基的受体相互作用的结果[6]。蓖麻毒素通过其结构中的糖结合位点，刺激细胞受体后，可能激活了Ras-MAPK途径、JAK-STAT途径或导致Ca2+的升高，介导核转录因子使其表达细胞因子[7]。蓖麻毒素诱导细胞因子的产生在免疫及抗肿瘤等方面的活性，使它在临床应用中具有诱人的前景。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39500122)
, 百拇医药
通讯作者，福建厦门大学生物系，厦门361005
作者简介：董巨莹，女，34岁，博士，主要从事蓖麻毒素及其修饰的研究
4 参考文献
[1]Robert B W，John F H，Mark A P.Ricin:mechanism of action，detection，and intoxication.J Toxiol，1995;14(4):483
[2]Federico L，Mana C M.Ricin induces the production of tumour necrosis factor-α and interleukin-1β by human peripheral-blood mononuclear cells.Biochem J，1993;294:517
, http://www.100md.com
[3]董巨莹，李 琦，赵 英.蓖麻毒素及其修饰物对U937细胞诱生TNF和IL-1的作用.细胞与分子免疫学杂志，1999；15(2)：17
[4]Lappi D A.Dissulfide bond connecting chains of ricin.Proc Natl Acad Sci USA，1978;75:1096
[5]董巨莹，王文学，曹云新.蓖麻毒素被修饰前后在小鼠主要脏器的定位比较研究.第四军医大学学报，1995；16(1)：17
[6]Gerard N P，Gerard C.The chemotactic receptor for human C5a anaphylatoxin.Nature，1991;349:614
[7]Peiech S Z，Sanghera J S.MAP kinases:charting the regulation pathway.Science，1992;257:1333
[收稿：1999-03-21 修回：1999-06-20], http://www.100md.com