Staurosporine 对人低分化鼻咽癌细胞系细胞周期和 DNA 倍体含量影响的动态观察
作者：何志巍 陈南岳 蔡康荣
单位：(何志巍)湖南医科大学肿瘤研究所 长沙 410078；(陈南岳 蔡康荣)广东医学院病理生理学教研室 湛江 524023
关键词：蛋白激酶C；抑制剂；鼻咽肿痛；细胞周期；凋亡DNA倍体含量；细胞系
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 摘要 目的：探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂Staurosporine(ST)诱导CNE-2Z细胞凋亡时，对细胞周期的选择性和对DNA含量及细胞周期的动态影响.方法：以PKC催化区抑制剂ST作用于CNE-2Z细胞不同时间后，收集细胞进行PI染色和流式细胞仪检测.结果：ST以2×10-6 mol/L终浓度分别作用至3，6，12，24 h后，发现G2期百分比分别为30.43±7.16、30.83±6.25、42.43±3.98和
, 百拇医药
71.80±7.55，均较对照组12.08±3.49增高明显.比较差异有显著性(P<0.01)；而G1期在3，6，12，24 h分别为34.70±1.56，37.03±6.47，16.63±1.77和15.30±5.46，均较对照组62.56±6.57明显降低，比较差异有显著性(P<0.01).亚二倍体峰百分比在12、24 h分别为37.10±7.21和43.72±6.73，均较对照组9.81±1.78显著增加(P<0.01)；而12 h以前该峰增加不明显.结论：ST在终浓度为2×10-6 mol/L诱导CNE-2 Z细胞至12 h后即可出现明显的DNA含量降低的凋亡细胞，对G2期细胞敏感而使之逐渐阻滞，且存在明显的细胞周期选择性表现.
Investigation on changes of cell cycle and DNA diploid in CNE-2Z cells affected by staurosporine
, 百拇医药
He Zhiwei，Chen Nanyue，Cai Kangrong
(Department of Pathophysiology，Guangdong Medical College， Zhanjiang 5244023)
Abstract Objective：To investigate the changes of cell cycle and DNA diploid in CNE-2Z cells induced by the inhibitor of protein kinase C(PKC).Methods：CNE-2Z cells were treated by PKC inhibitor staurosporine(ST)，acting on the catalytic domain，at the concentration of 2×10-6 mol/L for various hours，stained with propidium iodide(PI)，and tested by flowcytometry (FCM).Results：Within 3，6，12，and 24 hours，the percentages of G2 phase were 30.43±7.16，30.83±6.25，42.43±3.98and71.80±7.55
, 百拇医药
respectively，all of which were higher than that of control groups12.08±3.49(P<0.01).Thepercentages of G1phage were 34.70±1.56，37.03±7.21，16.63±1.77，and 15.30±5.46respectively，all of which were lower than that of control groups 62.56±6.57(P<0.01).The percentage of hypodiploid was 37.10±7.21 and 43.72±6.73 for 12 and 24 hours respectively，and both obviously increased compared with that of control groups 9.81±1.78(P<0.01).Conclusion：The results showed that the number of apoptotic cell induced by ST at the concentration of 2×10-6 mol/L gradually increased while the G2 phase increasing and G1phase decreasing within 24 hours，and it suggested that ST could induce CNE-2Z cells apoptosis and selectively affect G2 phase of cell cycle.
, 百拇医药
Key words：protein kinase C(PKC)；CNE-2Z cell；cell cycle；apoptosis；DNA diploid
蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)因在多种肿瘤细胞中活性异常增高或存在突变，而逐渐倍受人们的重视[1，2].已发现PKC催化区抑制剂Staurosporine(ST)可抑制人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z生长并诱导其凋亡，且存在明显的剂量效应关系[3，4].但ST诱导该细胞凋亡时，是否存在周期选择性，及对细胞周期和DNA含量的动态影响，目前尚无报道 .本文拟采用流式细胞仪(FCM)分析技术，对此加以讨论.
1 材料和方法
1.1 人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z培养 CNE-2Z细胞由广东医学院肿瘤研究所提供.用 RPMI1640液加15%灭活小牛血清培养，对数生长期传代培养.
, http://www.100md.com
1.2 实验分组及处理 生长良好的CNE-2Z细胞传入4mL 培养瓶培养，设立不加任何处理的对照组A，B-E组为用ST(Sigma)终浓度为2×10-6mol/L诱导细胞3、6、12、24 h，相同条件下重复4次 .
1.3 流式细胞仪检测 将以上处理的细胞，用PBS洗两次，体积分数为70%乙醇4°C固定30min，PBS洗2次，加入PI染液：Propidium Iodide(Sigma)50μg/mL，0.% TritonX-100，RNase (Sigma)100μg/ml.染色4°C，30min后，用流式细胞仪(Coulter公司EXPICSX2型，(USA)检测10000个细胞以上，分析亚二倍体细胞的百分比及细胞周期各期的百分比.
1.4 统计学处理 实验组与对照组间样本均数间比较采用F检验后作D和q检验 .
2 结 果
, 百拇医药
2.1 ST对CNE-2Z细胞周期的动态影响 CNE-2Z细胞在ST终浓度为2×10-6mol/L，诱导3、6、12、24 h后，细胞周期发生了明显变化，主要表现为G1期逐渐减少同时G2期逐渐增加，如图中 A～E所示.ST作用CNE-2Z细胞后所引起的各时间点上细胞周期的动态变化，见表1所示.ST作用 3 h即可导致CNE-2Z细胞G1期减少和G2期的增加，且较对照组改变明显(P<0.01).
图1 ST 对 NCE-2Z 细胞周期及 DNA 倍体含量的动态影响
A：对照组；B～E：ST 分别作用 3、6、12、24 h。
表1 ST 对CNE-2Z 细胞周期的动态影响 (
±s) 组别
, 百拇医药
n
细胞周期百分比/%
G1
P
S
P
G2
P
A 对照
4
62.6±6.6
28.2±2.8
12.1±3.5
, 百拇医药
B 3 h
4
34.7±5.6**
0.01
34.3±4.9**
0.05
30.4±7.2
0.01
C6 h
4
37.0±6.5**
0.01
30.4±3.3**
, http://www.100md.com
0.05
30.8±6.3
0.01
D12 h
4
16.6±3.8**
0.01
42.4±3.9**
0.01
42.4±3.9
0.01
E24 h
4
, http://www.100md.com
15.3±5.5**
0.01
14.1±4.2**
0.01
71.8±2.6
0.01
注：n：实验次数；A对照组；B～E：ST分别作用3，6，12，24 h.G1∶A vs B、A vs C、A vs D、A vs E∶**P<0.01；S：A vs B和A vs C：P>0.5；而A vs D和A vs E：**P<0.01；G2∶A vs B、A vs C、A vs D、A vs E∶**P<0.01.
, 百拇医药
2.2 ST对CNE-2Z细胞倍体含量的动态影响 从图1可见，随ST作用时间延长，在G1期逐渐减少及 G2逐渐增加的同时，DNA含量减低的亚二倍体峰(即凋亡峰ApoptoticPeak，AP)正逐渐增加.ST作用至12 h后，AP峰才较对照组有显著增加，P<0.01.24 h时AP峰进一步增加，如表2所示.表2 ST 对 CNE-2Z 细胞倍体含量的动态影响 (±s) 组别
n
亚二倍体细胞百分比
A 对照
4
9.8±1.8
B 3 h
, 百拇医药
4
13.4±4.5
C 6 h
4
16.9±5.5
D 12 h
4
37.1±7.2**
E 24 h
4
43.7±6.7**
A：对照组，B～E：ST分别作用3，6，12，24 h.n：实验次数.A vs B和 A vs C：P>0.05；A vs D 和A vs D：P<0.01；B vs E：P<0.01 B vs D：P<0.001，B vs C：P>0.05，C vs E：P<0.001，C vs D：P<0.001 D vs E：P>0.05
, 百拇医药
3 讨 论
肿瘤细胞的无限增殖能力是其生物学恶性表现的特征之一，而细胞周期的异常是细胞无限增殖的基础，故对肿瘤细胞周期的调节是肿瘤防治的重要策略之一.
某些抑癌基因产物可使受损伤的细胞阻滞于细胞周期的某一阶段，以便让细胞能自行修复，或诱导细胞凋亡，而不致于细胞因受损而突变产生异常增殖[5].某些药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡时，存在细胞周期选择性.如氮芥诱导G1期细胞凋亡，PKC抑制剂H7则诱导G2/M期细胞凋亡，而拓朴异构酶抑制剂Fostriectin(FST)则无细胞周期选择性[6].采用 PKC催化区抑制剂ST在诱导人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z 24 h后发生凋亡，且有明显的剂量效应关系[3，4].但对该细胞周期是否存在明显的选择性及对DNA含量和周期的动态影响如何，目前尚无报道.本文采用ST终浓度为2×10-6mol/L，分别作用CNE-2Z细胞3、6、12和24 h后，收集细胞PI染色及流式细胞仪检测.结果发现：在该浓度的ST作用细胞3 h开始便有细胞周期G1的减少和G2期的增加，至12和24 h此改变更加明显，同时表示细胞凋亡的AP峰在12、24 h才有明显改变，即细胞周期的改变较早，而AP峰出现较晚.这进一步提示细胞周期的阻滞改变可能是ST诱导细胞凋亡的重要机制[4].
, 百拇医药
本研究结果表明，PKC抑制剂ST在诱导CNE-2Z细胞凋亡时，对细胞周期和DNA倍体含量均有影响及明显的细胞周期选择性.采用抗细胞信息传递药物有可能成为抗癌治疗的手段之一[7]，PKC抑制剂有可能成为鼻咽癌化疗中起重要作用的药物之一.
作者简介：何志巍 广东省科委课题资助
4 参考文献
1 Blumberg PM.Protein Kinase C as the receptor for the phorbol ester tumor
promoter：Sixth roads memorial award lecture.Cancer Research，1988，48：1
2 陈南岳，赵明伦，鲍 波.蛋白激酶C亚型在鼻咽癌细胞中的分布及在增殖中的作用.中国病理生理杂志，1994，10(6)：566
, http://www.100md.com
3 何志巍，陈南岳，鲍波等.蛋白激酶C抑制剂诱导人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z凋亡的研究.中国病理生理杂志，1998，14(1)：22
4 何志巍，陈南岳，廖新波，等.细胞周期和骨架在CNE-2Z细胞凋亡中的变化.生物化学与生物物理进展，1997，24(3)：245
5 Oren M.p53：The ultimate tumor supressor gene？FASEB J，1992，6：3169
6 Gorczyca W，Gong J，Ardelt B，et al.The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by varied antitumor agents.Cancer Research，1993，53：3186.
7 Bazu A.The potential of protein kinase C asatargetforanticancertreatment.Pharmac Ther，1993，59：257
收稿日期：1998-04-15, http://www.100md.com
单位：(何志巍)湖南医科大学肿瘤研究所 长沙 410078；(陈南岳 蔡康荣)广东医学院病理生理学教研室 湛江 524023
关键词：蛋白激酶C；抑制剂；鼻咽肿痛；细胞周期；凋亡DNA倍体含量；细胞系
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 摘要 目的：探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂Staurosporine(ST)诱导CNE-2Z细胞凋亡时，对细胞周期的选择性和对DNA含量及细胞周期的动态影响.方法：以PKC催化区抑制剂ST作用于CNE-2Z细胞不同时间后，收集细胞进行PI染色和流式细胞仪检测.结果：ST以2×10-6 mol/L终浓度分别作用至3，6，12，24 h后，发现G2期百分比分别为30.43±7.16、30.83±6.25、42.43±3.98和
, 百拇医药
71.80±7.55，均较对照组12.08±3.49增高明显.比较差异有显著性(P<0.01)；而G1期在3，6，12，24 h分别为34.70±1.56，37.03±6.47，16.63±1.77和15.30±5.46，均较对照组62.56±6.57明显降低，比较差异有显著性(P<0.01).亚二倍体峰百分比在12、24 h分别为37.10±7.21和43.72±6.73，均较对照组9.81±1.78显著增加(P<0.01)；而12 h以前该峰增加不明显.结论：ST在终浓度为2×10-6 mol/L诱导CNE-2 Z细胞至12 h后即可出现明显的DNA含量降低的凋亡细胞，对G2期细胞敏感而使之逐渐阻滞，且存在明显的细胞周期选择性表现.
Investigation on changes of cell cycle and DNA diploid in CNE-2Z cells affected by staurosporine
, 百拇医药
He Zhiwei，Chen Nanyue，Cai Kangrong
(Department of Pathophysiology，Guangdong Medical College， Zhanjiang 5244023)
Abstract Objective：To investigate the changes of cell cycle and DNA diploid in CNE-2Z cells induced by the inhibitor of protein kinase C(PKC).Methods：CNE-2Z cells were treated by PKC inhibitor staurosporine(ST)，acting on the catalytic domain，at the concentration of 2×10-6 mol/L for various hours，stained with propidium iodide(PI)，and tested by flowcytometry (FCM).Results：Within 3，6，12，and 24 hours，the percentages of G2 phase were 30.43±7.16，30.83±6.25，42.43±3.98and71.80±7.55
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respectively，all of which were higher than that of control groups12.08±3.49(P<0.01).Thepercentages of G1phage were 34.70±1.56，37.03±7.21，16.63±1.77，and 15.30±5.46respectively，all of which were lower than that of control groups 62.56±6.57(P<0.01).The percentage of hypodiploid was 37.10±7.21 and 43.72±6.73 for 12 and 24 hours respectively，and both obviously increased compared with that of control groups 9.81±1.78(P<0.01).Conclusion：The results showed that the number of apoptotic cell induced by ST at the concentration of 2×10-6 mol/L gradually increased while the G2 phase increasing and G1phase decreasing within 24 hours，and it suggested that ST could induce CNE-2Z cells apoptosis and selectively affect G2 phase of cell cycle.
, 百拇医药
Key words：protein kinase C(PKC)；CNE-2Z cell；cell cycle；apoptosis；DNA diploid
蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)因在多种肿瘤细胞中活性异常增高或存在突变，而逐渐倍受人们的重视[1，2].已发现PKC催化区抑制剂Staurosporine(ST)可抑制人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z生长并诱导其凋亡，且存在明显的剂量效应关系[3，4].但ST诱导该细胞凋亡时，是否存在周期选择性，及对细胞周期和DNA含量的动态影响，目前尚无报道 .本文拟采用流式细胞仪(FCM)分析技术，对此加以讨论.
1 材料和方法
1.1 人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z培养 CNE-2Z细胞由广东医学院肿瘤研究所提供.用 RPMI1640液加15%灭活小牛血清培养，对数生长期传代培养.
, http://www.100md.com
1.2 实验分组及处理 生长良好的CNE-2Z细胞传入4mL 培养瓶培养，设立不加任何处理的对照组A，B-E组为用ST(Sigma)终浓度为2×10-6mol/L诱导细胞3、6、12、24 h，相同条件下重复4次 .
1.3 流式细胞仪检测 将以上处理的细胞，用PBS洗两次，体积分数为70%乙醇4°C固定30min，PBS洗2次，加入PI染液：Propidium Iodide(Sigma)50μg/mL，0.% TritonX-100，RNase (Sigma)100μg/ml.染色4°C，30min后，用流式细胞仪(Coulter公司EXPICSX2型，(USA)检测10000个细胞以上，分析亚二倍体细胞的百分比及细胞周期各期的百分比.
1.4 统计学处理 实验组与对照组间样本均数间比较采用F检验后作D和q检验 .
2 结 果
, 百拇医药
2.1 ST对CNE-2Z细胞周期的动态影响 CNE-2Z细胞在ST终浓度为2×10-6mol/L，诱导3、6、12、24 h后，细胞周期发生了明显变化，主要表现为G1期逐渐减少同时G2期逐渐增加，如图中 A～E所示.ST作用CNE-2Z细胞后所引起的各时间点上细胞周期的动态变化，见表1所示.ST作用 3 h即可导致CNE-2Z细胞G1期减少和G2期的增加，且较对照组改变明显(P<0.01).
图1 ST 对 NCE-2Z 细胞周期及 DNA 倍体含量的动态影响
A：对照组；B～E：ST 分别作用 3、6、12、24 h。
表1 ST 对CNE-2Z 细胞周期的动态影响 (
±s) 组别, 百拇医药
n
细胞周期百分比/%
G1
P
S
P
G2
P
A 对照
4
62.6±6.6
28.2±2.8
12.1±3.5
, 百拇医药
B 3 h
4
34.7±5.6**
0.01
34.3±4.9**
0.05
30.4±7.2
0.01
C6 h
4
37.0±6.5**
0.01
30.4±3.3**
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0.05
30.8±6.3
0.01
D12 h
4
16.6±3.8**
0.01
42.4±3.9**
0.01
42.4±3.9
0.01
E24 h
4
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15.3±5.5**
0.01
14.1±4.2**
0.01
71.8±2.6
0.01
注：n：实验次数；A对照组；B～E：ST分别作用3，6，12，24 h.G1∶A vs B、A vs C、A vs D、A vs E∶**P<0.01；S：A vs B和A vs C：P>0.5；而A vs D和A vs E：**P<0.01；G2∶A vs B、A vs C、A vs D、A vs E∶**P<0.01.
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2.2 ST对CNE-2Z细胞倍体含量的动态影响 从图1可见，随ST作用时间延长，在G1期逐渐减少及 G2逐渐增加的同时，DNA含量减低的亚二倍体峰(即凋亡峰ApoptoticPeak，AP)正逐渐增加.ST作用至12 h后，AP峰才较对照组有显著增加，P<0.01.24 h时AP峰进一步增加，如表2所示.表2 ST 对 CNE-2Z 细胞倍体含量的动态影响 (
±s) 组别n
亚二倍体细胞百分比
A 对照
4
9.8±1.8
B 3 h
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13.4±4.5
C 6 h
4
16.9±5.5
D 12 h
4
37.1±7.2**
E 24 h
4
43.7±6.7**
A：对照组，B～E：ST分别作用3，6，12，24 h.n：实验次数.A vs B和 A vs C：P>0.05；A vs D 和A vs D：P<0.01；B vs E：P<0.01 B vs D：P<0.001，B vs C：P>0.05，C vs E：P<0.001，C vs D：P<0.001 D vs E：P>0.05
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3 讨 论
肿瘤细胞的无限增殖能力是其生物学恶性表现的特征之一，而细胞周期的异常是细胞无限增殖的基础，故对肿瘤细胞周期的调节是肿瘤防治的重要策略之一.
某些抑癌基因产物可使受损伤的细胞阻滞于细胞周期的某一阶段，以便让细胞能自行修复，或诱导细胞凋亡，而不致于细胞因受损而突变产生异常增殖[5].某些药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡时，存在细胞周期选择性.如氮芥诱导G1期细胞凋亡，PKC抑制剂H7则诱导G2/M期细胞凋亡，而拓朴异构酶抑制剂Fostriectin(FST)则无细胞周期选择性[6].采用 PKC催化区抑制剂ST在诱导人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z 24 h后发生凋亡，且有明显的剂量效应关系[3，4].但对该细胞周期是否存在明显的选择性及对DNA含量和周期的动态影响如何，目前尚无报道.本文采用ST终浓度为2×10-6mol/L，分别作用CNE-2Z细胞3、6、12和24 h后，收集细胞PI染色及流式细胞仪检测.结果发现：在该浓度的ST作用细胞3 h开始便有细胞周期G1的减少和G2期的增加，至12和24 h此改变更加明显，同时表示细胞凋亡的AP峰在12、24 h才有明显改变，即细胞周期的改变较早，而AP峰出现较晚.这进一步提示细胞周期的阻滞改变可能是ST诱导细胞凋亡的重要机制[4].
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本研究结果表明，PKC抑制剂ST在诱导CNE-2Z细胞凋亡时，对细胞周期和DNA倍体含量均有影响及明显的细胞周期选择性.采用抗细胞信息传递药物有可能成为抗癌治疗的手段之一[7]，PKC抑制剂有可能成为鼻咽癌化疗中起重要作用的药物之一.
作者简介：何志巍 广东省科委课题资助
4 参考文献
1 Blumberg PM.Protein Kinase C as the receptor for the phorbol ester tumor
promoter：Sixth roads memorial award lecture.Cancer Research，1988，48：1
2 陈南岳，赵明伦，鲍 波.蛋白激酶C亚型在鼻咽癌细胞中的分布及在增殖中的作用.中国病理生理杂志，1994，10(6)：566
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3 何志巍，陈南岳，鲍波等.蛋白激酶C抑制剂诱导人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z凋亡的研究.中国病理生理杂志，1998，14(1)：22
4 何志巍，陈南岳，廖新波，等.细胞周期和骨架在CNE-2Z细胞凋亡中的变化.生物化学与生物物理进展，1997，24(3)：245
5 Oren M.p53：The ultimate tumor supressor gene？FASEB J，1992，6：3169
6 Gorczyca W，Gong J，Ardelt B，et al.The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by varied antitumor agents.Cancer Research，1993，53：3186.
7 Bazu A.The potential of protein kinase C asatargetforanticancertreatment.Pharmac Ther，1993，59：257
收稿日期：1998-04-15, http://www.100md.com