表皮生长因子对大鼠肺表面活性物质合成的调控及机制

http://www.100md.com 《中国应用生理学杂志》 2000年第4期

     作者：李建华 孙秀鸿 罗自强

    单位：湖南医科大学生理学教 研室，长沙 410078

    关键词：表皮生长因子；肺表面活性物质；酪氨酸蛋白激酶；蛋白激酶C

    中国应用生理学杂志000413

    摘要 目的和方法：采用无血清成年大鼠肺组织培养，用液体闪烁计数器测 定³H-胆碱掺入磷脂酰胆碱量，消化定磷法测总磷脂，薄层层析及薄层扫描测磷脂各组 分含量变化，观察生理浓度表皮生长因子对成年大鼠肺表面活性物质合成的调控。 结果：①10^-9 mol/L EGF作用8 h后，PC合成量显著增加，16 h达高峰； ②E GF可显著增加总磷脂、PS特征性成分PC、PG合成(P<0.01)。而细胞膜特征性组分PE、PS e、SM、PI均无显著影响(P>0.05)；③PTK抑制剂Tyrphostin 47、PKC抑制剂H₇均对E GF促PS合成有阻断效应。④EGF、TP47、H₇对肺组织LDH释放量无显著影响。结论 ：EGF参与生理状态下成年大鼠PS合成的调控，其信号转导与EGF受体PTK和细胞内PK C途径有关。

    中图分类号： R332.2；Q47文献标识码：A

    文章编号： 1000-6834(2000)04-0335-04

    MODULATION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR ON

    THE SYNTHESIS OF PULMONARY SURFACTANT

    AND ITS MECHANISM

    LI Jian-hua

    (Department of physiology Guangzhou medical college Guangzhou 510182)

    SUN Xiu-hong

    (Department of physiology Hunan medical university, ChangSha 410078)

    LUO Zi-qiang

    (Department of physiology Hunan medical university, ChangSha 410078)

    ABSTRACT Aim: To study the effect of EGF at physiological level on PS synthes is o n cultured lung explants without serum. Methods: The total phosp holipids and major phospholipid components in lung tissues were determined. The amount of ³ H-choline incorporation into PC was measured.R esults:①10^-9 mol/L EGF enhanced ³ H-choline incorpo ration into PC at 8 h and reached the maxiumum at 16 h.②The synthesis of total phospholipids, PC and PG increased from lung tissues exposed to 10^-9 mol /L EGF, but membrane characteristic phospholipid showed no change.③TP 47,a PTK inhibitor and H₇, a PKC inhibitor could block EGF- induced PS synthesis.The release of LDH from lung explants could not be changed by EGF, TP 47 and H₇. [ WTHZ]Conclusion: EGF at physiological level could enhance the adult rat PS synthesis, and its modulated mechanisms involved PTK and PKC pathways.

    KEY WORDS: epidermal growth factor; pulmonary surfacta nt; protein tyrosine kinase; protein kinase C

    表皮生长因子(EGF)是1962年由Cohen等人首次从小鼠颌下腺中分离纯化出来的，存在于绝大 部分组织及几乎所有的体液中，肺脏是EGF含量较为丰富的器官之一。对EGF肺内生物学效应 的研究过去一直集中在促丝裂作用，发现EGF可促进肺成纤维细胞、气道上皮细胞和平滑肌 细胞、肺泡Ⅱ型细胞等肺内多种细胞的DNA合成^[1，2]。我室报道^[3，4] EGF可抑制肺泡巨噬细胞迁移，对臭氧所致的气道上皮细胞损伤具有保护作用，这启迪我们 从非 促丝裂作用方面去研究EGF及其受体在肺内广泛分布的生物学意义。成年大鼠肺泡Ⅱ细胞能 够合成EGF、表达EGF受体，外源性EGF促进磷脂酰胆碱(PC)分泌，提示EGF以自分泌方式调控 肺泡Ⅱ型细胞生理功能^[5]。已有研究显示，促分泌的物质大都具有促合成作用， 而生理浓度EGF对成年大鼠肺表面活性物质(PS)合成有何影响尚未见报道。本研究在无血清 培养的肺组织块上观察生理浓度EGF对PS合成的作用，旨在进一步证实EGF作为生理性调节因 子参与肺泡Ⅱ型细胞生理功能的调控。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    EGF(Wakunage pharmaceutical(Co),H₇、Tyrphostin 47(TP 47)、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘 油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰丝氨酸(PSe)、磷脂酰乙醇胺(PE)(Sigma), ³H-氯化胆碱(英国杜邦公司)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(北京中生公司)，薄层层析板(20 ×20cm青岛海洋化工)，其它试剂均为国产分析纯级。

    1.2 实验方法

    1.2.1 无血清成年大鼠肺组织培养^[6] 氨基甲酸乙脂(g/L)麻醉大 鼠，开胸暴露心肺，肺动脉插管，用生理盐水冲洗肺血。分离双肺，剪成1 mm³小块，预 冷DMEM洗3次，取20～30小块肺组织置于直径为30 mm培养皿中，加入不含血清的DMEM 1 ml( 含青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml)，置95%O₂、5%CO₂、37℃条件下培养8 h后， 分成对照组与各处理组继续培养。

    1.2.2 ³H-胆碱掺入PC量检测 对照组与各处理组加入³H-氯化胆碱 (0.2 μCi/ml)，培养 4 h、8 h、16 h、24 h后，收集肺组织，洗涤3次制成10%的匀浆。L owry法测定蛋白质含量，用氯仿：甲醇(2∶1 vol/vol)萃取总脂质2遍，氮气吹干，200 μl 氯仿重新溶解，液体闪烁计数测³H-胆碱掺入PC量。用cpm/mg pro表示。

    1.2.3 总磷脂及磷脂组分含量的检测 对照组与EGF组均不加入³H-氯 化胆碱培养16 h，收集肺组织，制成肺匀浆，按上法萃取总脂质，分成两等份。一份用高氯 酸：浓硫酸消化后，抗坏血酸-钼酸胺显色，于700 nm比色定磷，按磷脂中平均4%有机磷换 算成总磷脂含量。另一等份按Korte^[7]法进行薄层层析。展层剂为氯仿：乙醇：水 ：三乙氨(30∶34∶8∶5)，单向展开90 min。用3%醋酸酮：8%磷酸显色后，CS-910双波长 扫描仪扫描定量(波长分别为550 nm、700 nm)，计算各磷脂组分含量。 用 μg/mg pro表示 。

    1.2.4 LDH检测 各组处理结束后，离心取上清，按LDH测定药盒规定步骤 在340 nm处测定光密度变化率，计算LDH释放量。用 u/mg pro表示。

    1.3 统计学分析

    测定结果以均数±标准差(±s)表示，在计算机上采用Instat统计软件进行统计 处理。

    2 结果

    2.1 EGF对肺组织PS合成的影响

    2.1.1 EGF对³H-胆碱掺入量影响的时效关系 10^-9mol/L EGF作 用4～24 h,8 h时EGF组肺组织³H-胆碱掺入量显著增加，16 h时达高峰，但作用时间少于 8 h，两组³H-胆碱掺入量无显著差异(P>0.05，表1)。

    Tab.1 Effect of EGF on ³ H -choline incorporation

    into PC in different time(±s cpm/mg pro, n=7) Gronp

    Culture time(h)

    4

    8

    16

    24

    Control

    35.4±11.3

    60.7±6.0

    91.8±10.8

    115.5±14.1

    EGF

    37.1±7.2

    69.4±7.2^*

    115.6±10.2^**

    138.3±5 .6^*

    EGF/Control

    1.05

    1.14

    1.26

    1.20

    ^* P<0.05, ^** P<0.01,vs co ntrol

    2.1.2 EGF对总磷脂及各磷脂组分的影响 10^-9mol/L EGF作用16 h ，使肺组织总磷脂合成增加1.27倍，PC增加1.41倍，PG增加1.90倍(P<0.01)， 而不影响其它磷脂组分如SM、PI、PSe、PE的含量(P>0.05,表2)

    Tab.2 Effect of EGF on PS phospholipids synthesized

    by rat lung explants (±s μg/mg pro,n=7) Gronp

    Phospholipids

    PC

    PG

    SM

    PI+PSe

    PE

    Total phospholipid

    Control

    110.9±18.0

    5.8±0.6

    66.1±10.2

    37.9±9.8

    78.6±17.8

    3 14.4±50.0

    EGF

    156.3±18.3^**

    10.0±2.2^**

    67.6±5.5

    41.6±10.2

    85.6±18.3

    400.1±51.3^**

    EGF/Control

    1.41

    1.90

    1.09

    1.10

    1.02

    1.2 7

    Incubated time 16 h. ^** P<0.01,vs control

    2.2 酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂的影响

    EGF受体PTK特异性抑制剂TP 47(10^-5mol/L)可阻断EGF的促³H-胆碱掺入效应。( P<0.01，图1)。

    Fig.1 Effect of TP 47 on EGF induced ³H-chol ine

    incorporation into PC.Incubated time 16 h.

    ^**P< 0.01,vs control; ^## P<0.01, vs EGF

    2.3 PKC在EGF促PS合成中的作用

    PKC抑制剂H₇(10^-5mol/L)可使肺组织³H-胆碱掺入量降至对照水平(P<0.05, 图2)。

    Fig.2 Effect of H₇ on EGF induced ³H -choline incorporation into PC.

    Incubated time 16 h.^** P<0.01,vs control; ^# P<0.01, vs EGF

    2.4 对肺组织LDH释放量的影响

    对照组、EGF组、EGF+TP 47组及EGF+H₇组各组间LDH释放量无显著差异(P>0.05)，说 明本实验采用的培养体系及培养条件不会造成肺组织损伤(表3)。

    Tab.3 Effect of EGF,TP 47 and H₇ on L DH

    release(±s,u/mg pro,n=7) Group

    LDH release

    Control

    0.47±0.08

    EGF

    0.45±0.05

    EGF+TP 47

    0.47±0.10

    EGF+H₇

    0.44±0.07

    Incubation time 16 h

    3 讨论

    肺内EGF主要以自分泌、旁分泌方式发挥作用，提示肺组织局部EGF浓度应高于血浆水平。正 常人血浆EGF浓度为0.33～0.67×10^-9mol/L，本实验选用的EGF浓度为10^-9 mol/L,模拟了肺组织局部生理浓度。肺表面活性物质是肺内特有的生物活性物质，由肺泡Ⅱ 型细胞合成与分泌，磷脂是其主要成分。研究显示，PS磷脂中最具特征性成分是PC、PG，而 PSe、PI、SM、PE是细胞膜结构的特征性成分。我们采用消化定磷法和薄层层析分离肺组织 各磷脂组分，发现肺组织培养16 h后，10^-9mol/L EGF使总磷脂及PC、PG分别增加1. 27、1.41、1.90倍，而不影响其它磷脂组分的合成。首次证实EGF作为生理性调节因子促 成年大鼠PS合成。

    胚胎肺研究显示，EGF促PS合成时间早于促丝裂作用。对成年动物肺细胞的研究表明，EGF持 续存在22～24 h以上才能发挥其促丝裂作用^[1，2]。我们观察到EGF作用8 h即可显 著促PS合成，16 h达高峰，表明EGF促PS合成并非由细胞增殖引起，而是一种非促丝裂效应 。

    EGF与细胞膜上受体结合发挥其生物学效应。EGF与受体结合后，诱导受体膜外区构象改变， 形成活化的受体二聚体，并使细胞内区的PTK激活。TP是一类特异性EGF受体PTK抑制剂，与 底物竞争PTK活化区的结合位点，从而抑制EGF受体酪氨酸残基磷酸化。Chess等^[8] 报道，TP 47可取消转化生长因子-α的促Ⅱ型细胞增殖作用。Borok等^[9]观察到 ，EGF能增强Ⅱ型细胞膜上Na⁺-K⁺ATP酶活性，促进肺泡液中Na⁺主动转运，TP 47 能 抑制该反应。提示PTK激活是EGF调控Ⅱ型细胞生理功能的重要环节。本实验观察到TP 47可 有效阻断EGF促PS合成，表明PTK参与介导EGF促PS合成。

    EGF受体PTK介导的细胞内信号转导通路之一是激活PKC。PKC是一类依赖于Ca²⁺、甘油 二酯或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的、催化蛋白质内丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化反应的蛋白激 酶 Ⅱ型细胞内存在PKC，PS分泌与PKC有关。我们采用PKC抑制剂H₇可阻断EGF促PS合成，证实 PKC在EGF调控PS合成过程中起重要作用。

    通过探讨生理浓度EGF对PS合成的调控及其作用机制，有助于更好地揭示EGF及受体肺内广泛 分布的生物学意义，为进一步阐明肺内微环境自稳态的调控机制提供理论依据。

    基金项目：湖南省中青年科技基金资助项目(99JZY2076)

    作者简介：李建华(19-)，女，湖南省人，讲师，医学硕士，主要从事肺 的非呼吸功能方面的研究。

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    收稿日期：1998-12-30

    修回日期：2000-01-10

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