差异显示法研究氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞基因差异表达
作者：张可满 陈保生 张文成 曾武威 吴纲 薛红
单位：100005 北京市,中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医 学研究所 生化脂组
关键词：差异显示-多聚酶链式反应；人脐静脉内皮细胞；氧化低密度脂蛋白；基因差异表达
中国循环杂志000228 摘要
目的:研究血管内皮细胞在致动脉粥样硬化因子作用下,差异表达基因的结构与功能。
方法:氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导培养的人脐静脉内皮细胞,用差异显示-多聚酶链式反应(DDRT-PCR)技术,克隆表达水平有明显差异的基因片段，并用Northen印迹法证实阳性结果。
结果:发现OX-LDL诱导培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)出现一些上、下调节的基因片段。已知的上调基因包括人的胸腺素(Thymosin)β4、细胞间粘附因子(ICAM)-1、FK506结合蛋白、ERp72;下调的基因有细胞色素B561、Restin。用Northern印迹证实了DDRT-PCR的结果,不同的上、下调节基因表达水平变化在30%～200%之间不等。
, 百拇医药
结论:本研究首次用DDRT-PCR的方法证实在体外OX-LDL可诱导HUVEC许多基因表达水平的变化。细胞中细胞间粘附因子的高表达,进一步说明细胞间粘附因子是参与动脉粥样硬化过程重要的粘附分子。胸腺素β4基因的上调表达与OX-LDL诱导细胞肌动蛋白张力纤维的生成增加有关,可能影响内皮细胞的增殖。
中图分类号:K318.19 文献标识码:A
文章编号:1000-614(2000)02-119-3
Study of Differential Expressed Genes in Human Umbilical Vein Endothelial Cell Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein
Zhang Keman,Chen Baosheng,Zhang Wencheng,et al.
, 百拇医药
Department of Biochemistry and Molecular Biochemistry,Chinese Academy of
Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing(100005)
Abstract
Objective:To study the differences of expressed genes in vascular endothelial cells with the action of atherogenic factors and to explore the structure and function of these genes.
Methods:Differential display reverse transcription (DDRT)-polymerase chain reaction (PCR)method was used to clone the differential expressed complementary deoxyribonucleic acid (cDNA)of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)induced by oxidized low density lipoprotein (OX-LDL).The differential expressed cDNA was confirmed by northern blot.
, http://www.100md.com
Results:Up-regulated and down-regulated cDNAs were isolated in HUVEC induced by OX-LDL.The known up-regulated genes include human thymosin β4,intercellular adhesion molecule (ICAM)-1,FK506 binding protein and ERp72 genes.The known down-regulated genes include human cytochrome B451,Restin.The results of DDRT-PCR were confirmed by Northern Blot and the expression level of different genes varied by 30%—200%.
Conclusion:By DDRT-PCR method,our results first showed that OX-LDL could change the expression of many genes in endothelial cells.The high level expression of ICAM-1 in endothelial cells stimulated by OX-LDL extensively suggest that ICAM-1 was an important adhesion molecule in the development of atherosclerosis.The up-regulated expression of thymosin β4 gene may be related to the OX-LDL induced increase of stress fiber formation and likely be involved in the change of cell proliferation.
, http://www.100md.com
Key words Differential display reverse transcription-Polymerase chain reaction;Human umbilical vein endothelial cell;Oxidized low density lipoprotein;Differential expressed genes
(Chinese Circulation Journal,2000,15:119.)
动脉粥样硬化是一种多基因、多环境因素相互作用导致的渐进性疾病。氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)是动脉粥样硬化发生的危险性因子之一[1],在循环中直接作用于血管内皮细胞,引起内皮细胞发生各种病理反应如慢性炎症、凋亡等进而诱导已知的和未知的基因表达水平发生变化。差异显示(DDRT)-多聚酶链式反应(PCR)技术可研究细胞在不同因素作用下基因表达水平的差异,这种技术的原理是用不同的随机引物和锚定引物组合PCR,理论上可使来自于细胞的各种信使核糖核酸(mRNA)生成不同3’端的互补脱氧核糖核酸(cDNA)片段[2]。本实验首次用DDRT-PCR方法研究在OX-LDL诱导下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基因表达水平的差异。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
细胞培养与诱导物处理:本实验从1998年1月开始至1999年10月完成。HUVEC:培养基为M199,其中含20%的胎牛血清(Gibco),25 μ g/ml的表皮细胞生长因子,2 μ mol的谷氨酰胺,50 μ g/ml的肝素钠:在37℃、5%的CO2条件下培养。第二代细胞用于诱导物处理。1 mg/ml的低密度脂蛋白(LDL)加Cu2+至终浓度为10 μ mol，于37℃孵育7小时进行氧化修饰。第二代细胞生长至亚融合状态加入OX-LDL,终浓度为45 μ g/ml处理32小时。
图1 氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞信使核糖核酸的差异显示结果 图中1、2：平行泳道为对照组 3、4：平行泳道为诱导组 键头所指为一上调节的互补脱氧核糖核酸
, 百拇医药
DDRT-PCR:用Trizol试剂提取诱导、非诱导细胞总核糖核酸(RNA),甲醛变 性凝胶电泳检测RNA的完整性。以寡聚(dT)引物,用2 μg总RNA在MMLV逆转录酶催化下合成一链cDNA。聚合酶链式反应体系中含 cDNA一链产物,30寡聚核苷酸锚定引物,25寡聚核苷酸随机引物,脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶,α-32P三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。在热循环仪中先进行退火温度为40℃的3轮低严谨反应合成二链cDNA模板,随后进行24轮退火温度为60℃的高严谨性扩增。产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行恒功率电泳,干胶后放射自显影。
差异显示区带的克隆、测序:用洁净的消毒刀片从胶中切下诱导物处理后出现的上、下调节的cDNA片段,沉淀、回收用于第2次扩增。扩增产物纯化、回收并克隆到T载体中。对阳性克隆的质粒做测序反应。序列进行同源性比较分析。
Northern印迹分析:用Trizol试剂提取诱导、非诱导HUVEC总RNA。用标准毛细管印迹技术转移RNA至带正电荷的尼龙膜上[3]。用随机引物法标记cDNA探针。快速杂交液于68℃预杂交30分,68℃杂交1小时,洗膜5次,X线光片放射自显影。
, 百拇医药
2 结果
本文应用7种锚定引物(T引物),8种随机引物(P引物)的组合,共进行了56种不同引物的DDRT-PCR。对诱导、非诱导HUVEC的mRNA差异表达水平进行了比较分析。如图1,诱导、非诱导细胞中绝大部分扩增的cDNA区带是一致的,但诱导中出现一些上、下调节的基因片段。共获得差异表达cDNA片段65条。
选择HUVEC诱导前后表达明显变化的40条差异片段克隆到载体T上。对阳性克隆进行DNA测序及同源性比较。结果表明,所测定序列的两端均含引物序列及特征性的mRNA 3’末端序列。40个阳性克隆中有25个克隆与已知基因序列高度同源,另外15个阳性克隆为未知基因的序列。其中一个阳性克隆与人胸腺素(Thymosin)β4具100%同源性,其序列中含胸腺素β4基因70 bp的5’非编码区、135 bp的完整开放阅读框架及33 bp的3’端非编码区。
, http://www.100md.com
选择10个已知基因及15个未知基因片段,分别与诱导、非诱导HUVEC的RNA进行Northern杂交。其中6个已知基因、8个未知基因片段探针Northern杂交结果为阳性,且与差异显示谱基本一致,总阳性率达60%,见代表性图2。已知基因片段的同源性比较结果及Northern杂交结果均列于附表。
图2 Northern杂交检测非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞胸腺素β4(Tβ4)及细胞间粘附因子(ICAM)-1信使核糖核酸(mRNA)的表达。GAPDH：甘油醛磷酸脱氢酶
附表 克隆的已知互补脱氧核糖核酸基因片段与它们在
非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞中的表达 克隆的已知互补脱氧核糖核酸基因片段与它们在
非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞中的表达 cDNA
, 百拇医药
基因片段
PCR引物
(5’-3’)
片段大小
(bp)
Northern
印迹结果
mRNA
(kb)
人同源性基因
1
P3
, 百拇医药
258
+200%
0.8
胸腺素β4
T4
2
P1
270
+30%
0.5
FK506结合蛋白
T9
3
, 百拇医药
P1
174
-100%
3.2
细胞色素B561
T9
4
P3
299
+50%
2.9
细胞间粘附因子-1
T10
, http://www.100md.com
5
P6
210
-70%
5.9
Restin
T4
6
P2
411
+80%
2.8
ERp72
, http://www.100md.com
T1
注:Northern印迹结果 +：为诱导上调 -：为诱导下调 P:不同的随机引物 T:各种锚定引物 cDNA:互补脱氧核糖核酸 PCR:多聚酶链式反应 mRNA:信使核糖核酸
已知的上调基因包括人的胸腺素β4、细胞间粘附因子-1、FK506结合蛋白、ERp72;下调的基因有细胞色素B561、Restin。用Northern印迹证实了DDRT-PCR的结果,不同的上、下调节基因表达水平变化在30%～200%之间不等。对未知基因的全序列克隆及功能研究正在进行之中。
3 讨论
作为血管壁衬里的内皮细胞在体内直接接受来自循环中的各种信号,生理状态时具有调节血管张力、维持凝血和纤溶系统的平衡,调节细胞聚集于血管壁内,抑制血小板的聚集和活性等多功能。现在研究认为,内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化始发事件[4]。OX-LDL可调节内皮细胞多种与动脉粥样硬化相关的功能变化[4],但OX-LDL作用于血管内皮细胞,引起细胞发生病理变化,最终导致动脉粥样硬化斑块的形成分子机制至今仍未明确。随着近年来分子生物学技术的发展,人们建立了各种分离新基因的方法如消减杂交,DDRT-PCR等,促进了新基因的发现。
, http://www.100md.com
本研究首次用DDRT-PCR的方法证实在体外OX-LDL可诱导HUVEC中许多基因表达的变化细胞间粘附因子的高表达,进一步证实OX-LDL作用于内皮细胞引起细胞炎性反应,是参与动脉粥样硬化过程的重要粘附分子。实验中克隆了含完整胸腺素β4编码区基因的cDNA片段,经Northern印迹OX-LDL诱导HUVEC胸腺素β4表达上调了2倍。胸腺素β4与细胞内G-肌动蛋白相结合,是细胞内一种主要的肌动蛋白-隔绝蛋白,使肌动蛋白处于单体状态;如果胸腺素β4与低水平的profilin并存,肌动蛋白则发生聚合反应, 并对细胞的一些进程如增殖、迁移、分化发生影响[5],Kume等[6]研究证实OX-LDL能促进培养的血管内皮细胞肌动蛋白张力纤维(stress fiber)的形成。看来OX-LDL刺激HUVEC引起细胞肌动蛋白张力纤维的增加与细胞内胸腺素β4的高表达有关,可能影响内皮细胞增殖。对其它基因的全序列的克隆及功能研究过程也正在进行当中。
本课题为国家攀登计划基金
, http://www.100md.com
作者简介:张可满(1965-)男 博士研究生 主要从事心血 管病分子生物学研究
参考文献
1，Vitztum JL,Steinberg D.Role of oxidized low-density lipoprotein in atherogenesis.J Clin Invest,1991,88:1785—1792.
2，Liang P,Averboukh L,Pardee AB.Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display:refinements and optimization.Nucleic Acid Research，1993,21:3269—3275.
3，Sambook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2ed,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.p7.43—7.52.
, http://www.100md.com
4，Anderrson TJ,Gerhand MD,Meredith IJ,et al.Systemic nature of endothelial dysfunction in atherosclerosis.Am J Cardiol,1995,75:71B—74B.
5，Pantaloni D,Carlier MF.How profilin promoters actin filament assembly in the presence of thymosin beta 4.Cell,1993,75:1007—1014.
6，Kume N,Toru K.Endothelial activation in atherosclerosis—roles of oxidize LDL and lysophophatidylcholine.Atherosclerosis XI.In:Jacotot B,Mathe D.Fruchart JC.eds.Paris:Elsevier,1997.465—468.
收稿:1999-11-27
修回:2000-01-21, http://www.100md.com
单位：100005 北京市,中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医 学研究所 生化脂组
关键词：差异显示-多聚酶链式反应；人脐静脉内皮细胞；氧化低密度脂蛋白；基因差异表达
中国循环杂志000228 摘要
目的:研究血管内皮细胞在致动脉粥样硬化因子作用下,差异表达基因的结构与功能。
方法:氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导培养的人脐静脉内皮细胞,用差异显示-多聚酶链式反应(DDRT-PCR)技术,克隆表达水平有明显差异的基因片段，并用Northen印迹法证实阳性结果。
结果:发现OX-LDL诱导培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)出现一些上、下调节的基因片段。已知的上调基因包括人的胸腺素(Thymosin)β4、细胞间粘附因子(ICAM)-1、FK506结合蛋白、ERp72;下调的基因有细胞色素B561、Restin。用Northern印迹证实了DDRT-PCR的结果,不同的上、下调节基因表达水平变化在30%～200%之间不等。
, 百拇医药
结论:本研究首次用DDRT-PCR的方法证实在体外OX-LDL可诱导HUVEC许多基因表达水平的变化。细胞中细胞间粘附因子的高表达,进一步说明细胞间粘附因子是参与动脉粥样硬化过程重要的粘附分子。胸腺素β4基因的上调表达与OX-LDL诱导细胞肌动蛋白张力纤维的生成增加有关,可能影响内皮细胞的增殖。
中图分类号:K318.19 文献标识码:A
文章编号:1000-614(2000)02-119-3
Study of Differential Expressed Genes in Human Umbilical Vein Endothelial Cell Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein
Zhang Keman,Chen Baosheng,Zhang Wencheng,et al.
, 百拇医药
Department of Biochemistry and Molecular Biochemistry,Chinese Academy of
Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing(100005)
Abstract
Objective:To study the differences of expressed genes in vascular endothelial cells with the action of atherogenic factors and to explore the structure and function of these genes.
Methods:Differential display reverse transcription (DDRT)-polymerase chain reaction (PCR)method was used to clone the differential expressed complementary deoxyribonucleic acid (cDNA)of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)induced by oxidized low density lipoprotein (OX-LDL).The differential expressed cDNA was confirmed by northern blot.
, http://www.100md.com
Results:Up-regulated and down-regulated cDNAs were isolated in HUVEC induced by OX-LDL.The known up-regulated genes include human thymosin β4,intercellular adhesion molecule (ICAM)-1,FK506 binding protein and ERp72 genes.The known down-regulated genes include human cytochrome B451,Restin.The results of DDRT-PCR were confirmed by Northern Blot and the expression level of different genes varied by 30%—200%.
Conclusion:By DDRT-PCR method,our results first showed that OX-LDL could change the expression of many genes in endothelial cells.The high level expression of ICAM-1 in endothelial cells stimulated by OX-LDL extensively suggest that ICAM-1 was an important adhesion molecule in the development of atherosclerosis.The up-regulated expression of thymosin β4 gene may be related to the OX-LDL induced increase of stress fiber formation and likely be involved in the change of cell proliferation.
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Key words Differential display reverse transcription-Polymerase chain reaction;Human umbilical vein endothelial cell;Oxidized low density lipoprotein;Differential expressed genes
(Chinese Circulation Journal,2000,15:119.)
动脉粥样硬化是一种多基因、多环境因素相互作用导致的渐进性疾病。氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)是动脉粥样硬化发生的危险性因子之一[1],在循环中直接作用于血管内皮细胞,引起内皮细胞发生各种病理反应如慢性炎症、凋亡等进而诱导已知的和未知的基因表达水平发生变化。差异显示(DDRT)-多聚酶链式反应(PCR)技术可研究细胞在不同因素作用下基因表达水平的差异,这种技术的原理是用不同的随机引物和锚定引物组合PCR,理论上可使来自于细胞的各种信使核糖核酸(mRNA)生成不同3’端的互补脱氧核糖核酸(cDNA)片段[2]。本实验首次用DDRT-PCR方法研究在OX-LDL诱导下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基因表达水平的差异。
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1 材料和方法
细胞培养与诱导物处理:本实验从1998年1月开始至1999年10月完成。HUVEC:培养基为M199,其中含20%的胎牛血清(Gibco),25 μ g/ml的表皮细胞生长因子,2 μ mol的谷氨酰胺,50 μ g/ml的肝素钠:在37℃、5%的CO2条件下培养。第二代细胞用于诱导物处理。1 mg/ml的低密度脂蛋白(LDL)加Cu2+至终浓度为10 μ mol，于37℃孵育7小时进行氧化修饰。第二代细胞生长至亚融合状态加入OX-LDL,终浓度为45 μ g/ml处理32小时。
图1 氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞信使核糖核酸的差异显示结果 图中1、2：平行泳道为对照组 3、4：平行泳道为诱导组 键头所指为一上调节的互补脱氧核糖核酸
, 百拇医药
DDRT-PCR:用Trizol试剂提取诱导、非诱导细胞总核糖核酸(RNA),甲醛变 性凝胶电泳检测RNA的完整性。以寡聚(dT)引物,用2 μg总RNA在MMLV逆转录酶催化下合成一链cDNA。聚合酶链式反应体系中含 cDNA一链产物,30寡聚核苷酸锚定引物,25寡聚核苷酸随机引物,脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶,α-32P三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。在热循环仪中先进行退火温度为40℃的3轮低严谨反应合成二链cDNA模板,随后进行24轮退火温度为60℃的高严谨性扩增。产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行恒功率电泳,干胶后放射自显影。
差异显示区带的克隆、测序:用洁净的消毒刀片从胶中切下诱导物处理后出现的上、下调节的cDNA片段,沉淀、回收用于第2次扩增。扩增产物纯化、回收并克隆到T载体中。对阳性克隆的质粒做测序反应。序列进行同源性比较分析。
Northern印迹分析:用Trizol试剂提取诱导、非诱导HUVEC总RNA。用标准毛细管印迹技术转移RNA至带正电荷的尼龙膜上[3]。用随机引物法标记cDNA探针。快速杂交液于68℃预杂交30分,68℃杂交1小时,洗膜5次,X线光片放射自显影。
, 百拇医药
2 结果
本文应用7种锚定引物(T引物),8种随机引物(P引物)的组合,共进行了56种不同引物的DDRT-PCR。对诱导、非诱导HUVEC的mRNA差异表达水平进行了比较分析。如图1,诱导、非诱导细胞中绝大部分扩增的cDNA区带是一致的,但诱导中出现一些上、下调节的基因片段。共获得差异表达cDNA片段65条。
选择HUVEC诱导前后表达明显变化的40条差异片段克隆到载体T上。对阳性克隆进行DNA测序及同源性比较。结果表明,所测定序列的两端均含引物序列及特征性的mRNA 3’末端序列。40个阳性克隆中有25个克隆与已知基因序列高度同源,另外15个阳性克隆为未知基因的序列。其中一个阳性克隆与人胸腺素(Thymosin)β4具100%同源性,其序列中含胸腺素β4基因70 bp的5’非编码区、135 bp的完整开放阅读框架及33 bp的3’端非编码区。
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选择10个已知基因及15个未知基因片段,分别与诱导、非诱导HUVEC的RNA进行Northern杂交。其中6个已知基因、8个未知基因片段探针Northern杂交结果为阳性,且与差异显示谱基本一致,总阳性率达60%,见代表性图2。已知基因片段的同源性比较结果及Northern杂交结果均列于附表。
图2 Northern杂交检测非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞胸腺素β4(Tβ4)及细胞间粘附因子(ICAM)-1信使核糖核酸(mRNA)的表达。GAPDH：甘油醛磷酸脱氢酶
附表 克隆的已知互补脱氧核糖核酸基因片段与它们在
非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞中的表达 克隆的已知互补脱氧核糖核酸基因片段与它们在
非诱导、诱导人脐静脉内皮细胞中的表达 cDNA
, 百拇医药
基因片段
PCR引物
(5’-3’)
片段大小
(bp)
Northern
印迹结果
mRNA
(kb)
人同源性基因
1
P3
, 百拇医药
258
+200%
0.8
胸腺素β4
T4
2
P1
270
+30%
0.5
FK506结合蛋白
T9
3
, 百拇医药
P1
174
-100%
3.2
细胞色素B561
T9
4
P3
299
+50%
2.9
细胞间粘附因子-1
T10
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5
P6
210
-70%
5.9
Restin
T4
6
P2
411
+80%
2.8
ERp72
, http://www.100md.com
T1
注:Northern印迹结果 +：为诱导上调 -：为诱导下调 P:不同的随机引物 T:各种锚定引物 cDNA:互补脱氧核糖核酸 PCR:多聚酶链式反应 mRNA:信使核糖核酸
已知的上调基因包括人的胸腺素β4、细胞间粘附因子-1、FK506结合蛋白、ERp72;下调的基因有细胞色素B561、Restin。用Northern印迹证实了DDRT-PCR的结果,不同的上、下调节基因表达水平变化在30%～200%之间不等。对未知基因的全序列克隆及功能研究正在进行之中。
3 讨论
作为血管壁衬里的内皮细胞在体内直接接受来自循环中的各种信号,生理状态时具有调节血管张力、维持凝血和纤溶系统的平衡,调节细胞聚集于血管壁内,抑制血小板的聚集和活性等多功能。现在研究认为,内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化始发事件[4]。OX-LDL可调节内皮细胞多种与动脉粥样硬化相关的功能变化[4],但OX-LDL作用于血管内皮细胞,引起细胞发生病理变化,最终导致动脉粥样硬化斑块的形成分子机制至今仍未明确。随着近年来分子生物学技术的发展,人们建立了各种分离新基因的方法如消减杂交,DDRT-PCR等,促进了新基因的发现。
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本研究首次用DDRT-PCR的方法证实在体外OX-LDL可诱导HUVEC中许多基因表达的变化细胞间粘附因子的高表达,进一步证实OX-LDL作用于内皮细胞引起细胞炎性反应,是参与动脉粥样硬化过程的重要粘附分子。实验中克隆了含完整胸腺素β4编码区基因的cDNA片段,经Northern印迹OX-LDL诱导HUVEC胸腺素β4表达上调了2倍。胸腺素β4与细胞内G-肌动蛋白相结合,是细胞内一种主要的肌动蛋白-隔绝蛋白,使肌动蛋白处于单体状态;如果胸腺素β4与低水平的profilin并存,肌动蛋白则发生聚合反应, 并对细胞的一些进程如增殖、迁移、分化发生影响[5],Kume等[6]研究证实OX-LDL能促进培养的血管内皮细胞肌动蛋白张力纤维(stress fiber)的形成。看来OX-LDL刺激HUVEC引起细胞肌动蛋白张力纤维的增加与细胞内胸腺素β4的高表达有关,可能影响内皮细胞增殖。对其它基因的全序列的克隆及功能研究过程也正在进行当中。
本课题为国家攀登计划基金
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作者简介:张可满(1965-)男 博士研究生 主要从事心血 管病分子生物学研究
参考文献
1，Vitztum JL,Steinberg D.Role of oxidized low-density lipoprotein in atherogenesis.J Clin Invest,1991,88:1785—1792.
2，Liang P,Averboukh L,Pardee AB.Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display:refinements and optimization.Nucleic Acid Research，1993,21:3269—3275.
3，Sambook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2ed,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.p7.43—7.52.
, http://www.100md.com
4，Anderrson TJ,Gerhand MD,Meredith IJ,et al.Systemic nature of endothelial dysfunction in atherosclerosis.Am J Cardiol,1995,75:71B—74B.
5，Pantaloni D,Carlier MF.How profilin promoters actin filament assembly in the presence of thymosin beta 4.Cell,1993,75:1007—1014.
6，Kume N,Toru K.Endothelial activation in atherosclerosis—roles of oxidize LDL and lysophophatidylcholine.Atherosclerosis XI.In:Jacotot B,Mathe D.Fruchart JC.eds.Paris:Elsevier,1997.465—468.
收稿:1999-11-27
修回:2000-01-21, http://www.100md.com