白血病细胞B7-1分子表达的研究
作者：秦雪梅 徐从高 张茂宏 刘春生 马道新
单位：250012 济南，山东医科大学附属医院肿瘤防治中心
关键词：
中华血液学杂志000713 B7-1分子是目前研究较多，较重要的共刺激分子，它的缺乏或封闭可抑制T细胞的活化、增殖，诱导克隆无能。许多动物实验转染外源B7-1分子基因给肿瘤细胞后，成功地诱导了抗肿瘤免疫反应。大多数肿瘤细胞无B7-1分子的表达。但是一些B细胞起源的造血干细胞肿瘤有B7分子的表达。我们分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术两种方法检测B7-1 mRNA和CD80抗原在白血病细胞中的表达，并初步探讨其意义。
对象和方法
1 研究对象 本院门诊和住院患者58例，其中急性髓系白血病(AML)19例，混合性白血病1例，慢性髓系白血病(CML) 11例，急性淋巴细胞白血病(ALL) 21例，慢性淋巴细胞白血病(CLL) 3例，淋巴瘤细胞白血病3例。其中男40例，女18例。AML患者中M1 1例，M2a 3例，M3a 5例，M4a 1例，M5a 8例，M6 1例；ALL患者中L1 8例，L2 13例。骨髓或外周血标本中白血病细胞均大于0.700。
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2 方法
2.1 细胞内总RNA的提取： 取骨髓或外周血标本，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，生理盐水洗2次，放入液氮冻存备用。RNA的提取方法参照分子克隆的方法进行。提取的RNA作甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2 RT-PCR：取RNA 10μg，B7-1特异性下游引物(5′-ATGGATCCTTATACAGGGCG-3′)100pmol，依次加入RNasin 20U、4×dNTP 0.01μmol、AMV酶20U以及逆转录缓冲液，总体积20μl。42℃水浴90min，90℃ 5min灭活AMV酶。
取RT产物20μl，加入B7-1上游引物(5′-ATGAATTCATGGGCCACACA-3′)100pmol，Taq酶3U，4×dNTP 0.01μmol, 1×PCR缓冲液，总体积100μl。PCR反应参数：93℃5min；93℃ 1min，60℃ 2min，72℃ 3min，30个循环；72℃ 7min。以Raji细胞RT-PCR结果为阳性对照，空白为阴性对照。10g/L琼脂糖凝胶，75V稳压稳流电泳，紫外透射仪下观察鉴定PCR扩增产物。
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2.3 随机引物法地高辛探针标记：按照Boehringer Mannheim公司的Dig-DNA标记及检测试剂盒提供的随机引物法标记探针。取B7-1双链DNA(长度为867bp)15μl，沸水中变性10min，迅速置于冰上。在冰上加入2μl随机引物，2μl dNTP混合物，2U Klenow酶。37℃水浴过夜。0.2mol/L EDTA 2μl (pH 8.0)终止反应。LiCl和冷乙醇沉淀标记好的DNA探针，TE溶解。反应体系中一半dTTP被Dig-dUTP取代,标记好的探针质量及特异性按试剂盒提供的方法进行检测均符合要求。
2.4 Southern blot： 将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜，按200μl/cm2加入预杂交液，68℃振动预杂交2～4h。再按50μl/cm2膜面积加入杂交液(内含DNA探针浓度为5～25ng/ml)，68℃杂交过夜。杂交结束后，将膜转移到2×SSC和1g/L的SDS溶液中振荡洗膜。进行NBT/BCIP显色反应。
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2.5 流式细胞仪检测：肝素抗凝血100μl，加入相应的荧光抗体(CD80-FITC，CD28-PE)15μl，置于避光处30min，加入溶血素2ml，混匀，10min后离心，PBS洗涤2次，2500r/min离心10min，弃上清，加入0.5ml PBS，将细胞悬浮。流式细胞仪测量白血病细胞CD80、CD28阳性率。
结果
1 RT-PCR检测 阳性标本在867bp位置上可见清晰的特异性扩增条带，部分阳性样本(约占65%)在约450bp位置上还可见到一条清晰的电泳条带，不同于预计扩增的867bp的片段。1例ALL患者电泳的条带为3条，除867bp，450bp的外，另出现一条300bp的条带，经Southern杂交证实该450bp和300bp条带与B7-1 cDNA同源。27例淋系白血病中，21例B7-1分子表达阳性，6例阴性(L2 3例、L1 2例、CLL 1例)，阳性率为77.0%；31例髓系白血病中，6例阳性(M3a1例、M61例、混合性白血病1例、CML 3例)，25例阴性，阳性率为19.3%。淋系白血病和髓系白血病B7-1 mRNA阳性率比较，差异有显著性(P<0.01)。
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2 流式细胞术检测淋系白血病细胞CD80和CD28的表达 流式细胞术检测的27例淋系白血病(T系4例，B系17例，双表型3例，裸型3例)患者中，4例患者的CD80表达高于正常，阳性率为14.9%，阳性患者中双表型ALL 1例，淋巴瘤细胞白血病2例，CLL 1例。CD80和CD28、CD80和CD19、CD80和CD3之间在表达率上均无相关性，CD28和CD3的表达率有明显的相关性(r=0.834,P<0.01)。
3 淋系白血病CD80阳性率与B7-1 mRNA阳性率比较 27例淋系白血病患者中B7-1 mRNA表达阳性21例，CD80表达阳性4例，两者差异有显著性(P<0.01)。
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讨论
近年B7-1分子在肿瘤细胞中的表达情况已越来越受到关注。孙毅等[1]用RT-PCR和原位杂交的方法检测淋巴瘤细胞B7-1 mRNA的表达情况，发现大部分淋巴瘤组织B7-1表达阳性。Delabie等[2]用免疫组化方法观察了47例霍奇金病(HD)患者瘤组织中的R-S细胞，发现全部强表达B7-1抗原分子，并且R-S细胞被CD28阳性的T细胞包围形成典型的玫瑰花形；46例非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织中，大多数恶性细胞无B7-1抗原分子表达。Hirano等[3]用流式细胞仪检测了94例患者白血病细胞CD80的表达，CD80阳性率5%，其中54例AML患者只有1例CD80表达阳性，22例ALL中2例CD80阳性。
我们用RT-PCR测定了58例白血病患者的白血病细胞B7-1 mRNA表达，同时用流式细胞术检测了27例淋系白血病患者细胞CD80、CD28的表达。淋系患者B7-1 mRNA表达阳性率为77.0%，髓系患者的白血病细胞阳性率为19.3%，两者差异显著。部分阳性细胞中，用B7-1 cDNA特异性引物不仅扩增到了867bp的特异性片段，而且还出现了一条450bp左右的片段，用Southern杂交证实它与B7-1 cDNA有同源性，可能是B7-1基因拚接形式不同所致。另外，淋系白血病细胞B7-1 mRNA阳性率显著高于CD80阳性率，其原因可能为RT-PCR检测方法较流式细胞术敏感；也可能由于白血病细胞在将B7-1 mRNA翻译成CD80蛋白质过程中存在障碍。另外，淋系白血病B7-1 mRNA阳性率很高，患者何以仍预后不良？除了以上提到的两个原因外，我们认为即使肿瘤细胞上有B7-1分子表达，其量不足以有效地刺激机体的免疫反应。Tatsumi等[4]用RT-PCR方法测定肝癌细胞株B7-1 mRNA表达均为阳性，但在混合淋巴细胞反应中它们不能刺激T细胞活化，用B7-1基因转染这些细胞株后，转染后的细胞能有效地诱导T细胞的细胞毒活性。究竟肿瘤细胞B7-1分子表达水平多高方能有效地刺激机体发生免疫反应，尚需深入研究。
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参 考 文 献
1，孙毅,陈蕴颖,司履生.共刺激分子B7-1在淋巴瘤组织中的表达.中华病理学杂志, 1997，26:23-26.
2，Delabie J, Ceuppens JL,Vandenberghe P,et al.The B7/BB1 antigen is expresses by Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease and contributes to the stimulating capacity of Hodgkin's disease-derived cell lines.Blood,1993， 82:2845-2852.
3，Hirano N, Takahashi T, Ohtuke S, et al.Expression of costimulatory molecules in human leukemias. Leukemia, 1996，10:1168-1176.
4，Tatsumi T, Takehara T, Katayama K,et al. Expression of costimulatory molecules B7-1(CD80) and B7-2(CD86) on human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1997，25:1108-1114.
(收稿日期：1999-04-02), 百拇医药
单位：250012 济南，山东医科大学附属医院肿瘤防治中心
关键词：
中华血液学杂志000713 B7-1分子是目前研究较多，较重要的共刺激分子，它的缺乏或封闭可抑制T细胞的活化、增殖，诱导克隆无能。许多动物实验转染外源B7-1分子基因给肿瘤细胞后，成功地诱导了抗肿瘤免疫反应。大多数肿瘤细胞无B7-1分子的表达。但是一些B细胞起源的造血干细胞肿瘤有B7分子的表达。我们分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术两种方法检测B7-1 mRNA和CD80抗原在白血病细胞中的表达，并初步探讨其意义。
对象和方法
1 研究对象 本院门诊和住院患者58例，其中急性髓系白血病(AML)19例，混合性白血病1例，慢性髓系白血病(CML) 11例，急性淋巴细胞白血病(ALL) 21例，慢性淋巴细胞白血病(CLL) 3例，淋巴瘤细胞白血病3例。其中男40例，女18例。AML患者中M1 1例，M2a 3例，M3a 5例，M4a 1例，M5a 8例，M6 1例；ALL患者中L1 8例，L2 13例。骨髓或外周血标本中白血病细胞均大于0.700。
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2 方法
2.1 细胞内总RNA的提取： 取骨髓或外周血标本，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，生理盐水洗2次，放入液氮冻存备用。RNA的提取方法参照分子克隆的方法进行。提取的RNA作甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2 RT-PCR：取RNA 10μg，B7-1特异性下游引物(5′-ATGGATCCTTATACAGGGCG-3′)100pmol，依次加入RNasin 20U、4×dNTP 0.01μmol、AMV酶20U以及逆转录缓冲液，总体积20μl。42℃水浴90min，90℃ 5min灭活AMV酶。
取RT产物20μl，加入B7-1上游引物(5′-ATGAATTCATGGGCCACACA-3′)100pmol，Taq酶3U，4×dNTP 0.01μmol, 1×PCR缓冲液，总体积100μl。PCR反应参数：93℃5min；93℃ 1min，60℃ 2min，72℃ 3min，30个循环；72℃ 7min。以Raji细胞RT-PCR结果为阳性对照，空白为阴性对照。10g/L琼脂糖凝胶，75V稳压稳流电泳，紫外透射仪下观察鉴定PCR扩增产物。
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2.3 随机引物法地高辛探针标记：按照Boehringer Mannheim公司的Dig-DNA标记及检测试剂盒提供的随机引物法标记探针。取B7-1双链DNA(长度为867bp)15μl，沸水中变性10min，迅速置于冰上。在冰上加入2μl随机引物，2μl dNTP混合物，2U Klenow酶。37℃水浴过夜。0.2mol/L EDTA 2μl (pH 8.0)终止反应。LiCl和冷乙醇沉淀标记好的DNA探针，TE溶解。反应体系中一半dTTP被Dig-dUTP取代,标记好的探针质量及特异性按试剂盒提供的方法进行检测均符合要求。
2.4 Southern blot： 将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜，按200μl/cm2加入预杂交液，68℃振动预杂交2～4h。再按50μl/cm2膜面积加入杂交液(内含DNA探针浓度为5～25ng/ml)，68℃杂交过夜。杂交结束后，将膜转移到2×SSC和1g/L的SDS溶液中振荡洗膜。进行NBT/BCIP显色反应。
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2.5 流式细胞仪检测：肝素抗凝血100μl，加入相应的荧光抗体(CD80-FITC，CD28-PE)15μl，置于避光处30min，加入溶血素2ml，混匀，10min后离心，PBS洗涤2次，2500r/min离心10min，弃上清，加入0.5ml PBS，将细胞悬浮。流式细胞仪测量白血病细胞CD80、CD28阳性率。
结果
1 RT-PCR检测 阳性标本在867bp位置上可见清晰的特异性扩增条带，部分阳性样本(约占65%)在约450bp位置上还可见到一条清晰的电泳条带，不同于预计扩增的867bp的片段。1例ALL患者电泳的条带为3条，除867bp，450bp的外，另出现一条300bp的条带，经Southern杂交证实该450bp和300bp条带与B7-1 cDNA同源。27例淋系白血病中，21例B7-1分子表达阳性，6例阴性(L2 3例、L1 2例、CLL 1例)，阳性率为77.0%；31例髓系白血病中，6例阳性(M3a1例、M61例、混合性白血病1例、CML 3例)，25例阴性，阳性率为19.3%。淋系白血病和髓系白血病B7-1 mRNA阳性率比较，差异有显著性(P<0.01)。
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2 流式细胞术检测淋系白血病细胞CD80和CD28的表达 流式细胞术检测的27例淋系白血病(T系4例，B系17例，双表型3例，裸型3例)患者中，4例患者的CD80表达高于正常，阳性率为14.9%，阳性患者中双表型ALL 1例，淋巴瘤细胞白血病2例，CLL 1例。CD80和CD28、CD80和CD19、CD80和CD3之间在表达率上均无相关性，CD28和CD3的表达率有明显的相关性(r=0.834,P<0.01)。
3 淋系白血病CD80阳性率与B7-1 mRNA阳性率比较 27例淋系白血病患者中B7-1 mRNA表达阳性21例，CD80表达阳性4例，两者差异有显著性(P<0.01)。
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讨论
近年B7-1分子在肿瘤细胞中的表达情况已越来越受到关注。孙毅等[1]用RT-PCR和原位杂交的方法检测淋巴瘤细胞B7-1 mRNA的表达情况，发现大部分淋巴瘤组织B7-1表达阳性。Delabie等[2]用免疫组化方法观察了47例霍奇金病(HD)患者瘤组织中的R-S细胞，发现全部强表达B7-1抗原分子，并且R-S细胞被CD28阳性的T细胞包围形成典型的玫瑰花形；46例非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织中，大多数恶性细胞无B7-1抗原分子表达。Hirano等[3]用流式细胞仪检测了94例患者白血病细胞CD80的表达，CD80阳性率5%，其中54例AML患者只有1例CD80表达阳性，22例ALL中2例CD80阳性。
我们用RT-PCR测定了58例白血病患者的白血病细胞B7-1 mRNA表达，同时用流式细胞术检测了27例淋系白血病患者细胞CD80、CD28的表达。淋系患者B7-1 mRNA表达阳性率为77.0%，髓系患者的白血病细胞阳性率为19.3%，两者差异显著。部分阳性细胞中，用B7-1 cDNA特异性引物不仅扩增到了867bp的特异性片段，而且还出现了一条450bp左右的片段，用Southern杂交证实它与B7-1 cDNA有同源性，可能是B7-1基因拚接形式不同所致。另外，淋系白血病细胞B7-1 mRNA阳性率显著高于CD80阳性率，其原因可能为RT-PCR检测方法较流式细胞术敏感；也可能由于白血病细胞在将B7-1 mRNA翻译成CD80蛋白质过程中存在障碍。另外，淋系白血病B7-1 mRNA阳性率很高，患者何以仍预后不良？除了以上提到的两个原因外，我们认为即使肿瘤细胞上有B7-1分子表达，其量不足以有效地刺激机体的免疫反应。Tatsumi等[4]用RT-PCR方法测定肝癌细胞株B7-1 mRNA表达均为阳性，但在混合淋巴细胞反应中它们不能刺激T细胞活化，用B7-1基因转染这些细胞株后，转染后的细胞能有效地诱导T细胞的细胞毒活性。究竟肿瘤细胞B7-1分子表达水平多高方能有效地刺激机体发生免疫反应，尚需深入研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，孙毅,陈蕴颖,司履生.共刺激分子B7-1在淋巴瘤组织中的表达.中华病理学杂志, 1997，26:23-26.
2，Delabie J, Ceuppens JL,Vandenberghe P,et al.The B7/BB1 antigen is expresses by Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease and contributes to the stimulating capacity of Hodgkin's disease-derived cell lines.Blood,1993， 82:2845-2852.
3，Hirano N, Takahashi T, Ohtuke S, et al.Expression of costimulatory molecules in human leukemias. Leukemia, 1996，10:1168-1176.
4，Tatsumi T, Takehara T, Katayama K,et al. Expression of costimulatory molecules B7-1(CD80) and B7-2(CD86) on human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1997，25:1108-1114.
(收稿日期：1999-04-02), 百拇医药