表达反义hREV3 基因片段的真核细胞表达质粒的构建*
作者：徐方 余应年 胡文蔚
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室 (杭州 310031)
关键词：遗传学；基因；REV；RNA；反义
表达反义hREV3 基因片段的真核细胞表达质粒的构建 摘 要 目的:构建真核细胞表达重组体，为今后利用反义核酸阻断技术研究hREV3基因功能及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法:用内切酶BamH I及BamH I+Hind Ⅲ分别对pBS-hREV3进行单酶切和双酶切,从而得到含hREV3 cDNA特异性保守序列的两种长度(742bp 和357bp)片段,分别将两者插入真核细胞表达载体:pBK-RSV(持续表达载体)和pMAMneo amp-(表达需经地塞米松诱导)。结果:经酶切图谱分析,筛选出含正向和反向插入片段真核细胞表达重组体5种。结论:为深入研究hREV3基因功能奠定基础。
, 百拇医药
Construction of eukaryotic expression plasmid expressing antisense fregment of hREV3
XU Fang， YU Ying-Nian， HU Wen-Wei
Dept. of Pathophysiology,Zhejiang University,Hangzhou(310031)
Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression plasmid to study the role of hREV3 gene in genesis of genetic instability by means of antisense technology. METHODS: Two fragments with different length (742bp and 357bp) that constain the specific conserved region of hREV3 cDNA were obtained by digesting plasmid pBS-hREV3 with restriction enzymes BamH I and BamH I plus Hind III respectively .Two kinds of fragments were inserted into two kinds of eukaryotic expression vector : pBS-RSV(used for constant expression and pMAMneo amp-(used for inducible expression).The inserting orientation of recombinants were identified by digesting with restriction enzymes and electrophoresis analysis. RESULTS: Obtained five kinds of recombinant containing the insertions in sense and antisense orientation. CONCLUSION: These results provide an important basis to further study in genetic instability.
, 百拇医药
MeSH Genetics; Genes, REV; RNA, antisense
REV3基因是近年来在酵母研究中发现的,它与REV7共同编码合成DNA聚合酶ζ (Polζ),参与DNA损伤诱导的突变形成。REV3基因突变不仅能降低由于紫外线、离子辐射或烷化剂处理造成的DNA损伤诱导的突变形成,而且能使真菌自发突变率降低20%[1,2]。人Polζ的编码基因cDNA已从人的cDNA文库中克隆出,命名为hREV3(2.1kb),定位于染色体1p32～33,其mRNA>10kb,并证实它在一些肿瘤中表达增高[3]，提示其表达增高与肿瘤发生有关,可能对遗传不稳定的诱发起着重要作用。我们将利用反义RNA技术来特异性阻断真核细胞hREV3基因的表达,由于真核细胞基因表达调控复杂,在研究hREV3基因功能时,我们构建了诱导表达的和持续表达的反义重组质粒，构建中获得的正向插入的重组体将作对照用。
材料与方法
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一、质粒与有关酶：
pBS-hREV3 [加拿大Saskatchewan大学W.Xiao博士提供,pBS-hREV3为含有hREV3基因全编码序列(2.1kb[3])的pBluescript SK、重组质粒]; pMAMneo amp-[本室提供[4],从pMAMneo (Clontech公司)改建而得,在细菌中扩增具有卡那抗性,外源基因的表达需地塞米松诱导];pBK-RSV(Stratagene公司)。限制性内切酶购自ToKaRa公司和Promega公司。
二、两种长度hREV3 cDNA目的片段的制备：
对pBS-hREV3进行双酶切和单酶切得到含有hREV3cDNA特异性保守序列的两种片段：357 bp短片段(hREV3 short fragment ,RS表示)和742 bp长片段(hREV3 long fragment,RL表示，另带有pBS载体上极小的一段序列)。电泳分离,透析袋法回收目的片段。
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三、重组子构建：
1.持续表达载体pBK-RSV与两种长度目的片段(RS、RL)重组体构建：酶切pBK-RSV和pBS-hREV3，4 ℃，T4 DNA 连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α，提取质粒。单酶切的片段有正、反方向插入, 酶切筛选出正向和反向重组质粒, 以:pB-RL(+)、pB-RL(-)表示(此处pB表示载体pBK-RSV ；+、-分别表示正、反方向) 。双酶切的片段只以一种方向插入,筛选得到一种反向重组质粒，以pB-RS(-)表示(图1)。
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Fig 1 Construction of recombinan
B:BamHI； H:HindⅢ；S:Sall； pB:pBK-RSV；pM:pMAMneo amp-；+：ordinary orientation; -：reverse orientation;
RL:long fragment of hRev 3(742 bp); RS:short fragment of hRev 3(357 bp)
图1 构建重组体技术路线
2.诱导表达载体pMAMneo amp-与357bp hREV3 cDNA片段(RS)的重组体构建：酶切重组体pB-RS(-)和载体pMAMneo amp-(以pM表示)，4 ℃, T4 DNA连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α,在含卡那霉素的LB培养基上选取单菌落,酶切筛选出正向和反向重组体，分别以：pM-RS(+)、pM-RS(-)表示 (图1)。
, 百拇医药
结 果
一、重组体构建及其正反取向的鉴定：
1.持续表达载体pBK-RSV与hREV3短片段(RS)构建的重组体pB-RS(-)(图2)：对选出的质粒(Lane 4)，用BamH I+Hind III双酶切进行进一步确认，该质粒被切出2条片段：357bp、4434bp(Lane 7)，分别与同样双酶切自质粒pBS-hREV3及表达载体所得到的片段357bp(Lane 5)和4434bp(Lane 6)长度同，故确认该质粒为重组体，并为反向重组体,定名为:pB-RS(-)。
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Fig 2 Electrophoretic analysis of recombinant pB-RS(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarkers; 2. pBS-hREV3 digested with EcoRⅠ；3～4. pBK-RSV and pB-RS(-) digested with BamH I; 5～7. pBS-hREV 3、 pBK-RSV and pB-RS(-) digested with (Bam H Ⅰ+HindⅢ); 8. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图2 pB-RS(-)重组体鉴定
2.持续表达载体pBK-RSV与hREV3长片段(RL)构建的重组体pB-RL(+)、pB-RL(-) (图3)：选出的两个质粒, 经BamHI酶切均得到2条片段742bp和4452bp(Lane4～5),分别与pBS-hREV3和pBK-RSV自BamHI酶切所得片段742bp (Lane2)和4452bp(Lane3)相同,故可确定此两个质粒为重组体,暂定名为pB-RL-1和pB-RL-2。 用Hind III酶切鉴定方向，正向插入应有：375bp和4819bp 2条片段，而反向插入应有：403bp和4791bp 2条片段。经分析确认pB-RL-1(Lane7)为正向插入重组体pB-RL(+); pB-RL-2( Lane8)为反向插入的重组体pB-RL(-) 。
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Fig 3 Electrophoretic analysis of recombinants pB-RL(+) and pB-RL(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarers; 2～5. pBS-REV 3、 pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 digested with Bam H Ⅰ; 6～8. pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 digested with HindⅢ; 9. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图3 重组体pB-RL(+)和pB-RL(-)鉴定
3.诱导表达载体pMAMneo amp-与hREV3短片段(RS)构建的重组体pM-RS(+)、pM-RS(-)(图4)：对选出的质粒作进一步酶切鉴定，用Hind III + Sal I双酶切该质粒和表达载体，由于表达载体上有2个Hind III位点和1个Sal I位点，插入片段上有1个Hind III位点，故载体可被切出3条片段：5722bp、1214bp、1464bp(Lane 3);而重组体则被酶切出：5722bp、1214bp、1464bp、369bp 4条片段(lane 4～5),其中前3条与表达载体同，后1条为带有hREV3短片段(357bp)的一条,由此可确认Lane 4～5的两个质粒均为重组体，暂定名为pM-RS-1和pM-RS-2。鉴定重组体正、反向可用BamH I酶切，pMAMneo amp-上有3个BamH I位点，插入片段上有1个BamH I位点，因此pMAMneo amp-可被酶切出3条带4563bp、2688bp、1149bp(Lane 6), 而正向重组体可被切出：4071bp、2688bp、1149bp、867bp 4条片段；反向重组体可被酶切出：3696bp、2688bp、1149bp、1242bp 4条片段(后2条在电泳时分辨不开，合为1条)，由此确认pM-RS-1(Lane7)为正向重组体pM-RS(+); pM-RS-2(Lane8)为反向重组体pM-RS(-)。
, 百拇医药
Fig 4 Electrophoretic analysis of recombinant pM-RS(+) and pM-RS(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarkers; 2. pBS-hREV 3 digested with (BamH I+ Hind Ⅲ); 3～5. pMAMneo amp-、 pM-RS-1、 pM-RS-2 digested with (Hind Ⅲ+Sa1 1)；6～8.pMAMneo amp-、 pM-RS-1、 pM-RS-2 digested with BamH I； 9. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图4 重组体pM-RS(+)和pM-RS(-)鉴定
讨 论
本实验室发现在小剂量烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)处理引起的哺乳类细胞不稳定现象中，存在DNA复制保真度下降[5],而DNA复制保真度直接影响并维持着生物遗传的稳定性，现已知在细胞中DNA复制保真度主要由参与DNA聚合酶的校读作用及错配修复机制维持的。在MNNG 处理细胞中未发现有错配修复功能的改变[6] ,但证明烷化剂处理后可以诱导一些基因表达的改变[7]，其中包括DNA聚合酶谱的改变。本实验室已用逆转录-PCR技术证明在MNNG处理后DNA聚合酶α、γ、δ与拓扑异构酶Ⅱα的表达并无变化，但无3’校读功能的DNA聚合酶β表达明显升高[8，9]，由于它缺乏校读功能，因此它的表达升高有可能与DNA复制保真度的降低和细胞遗传不稳定有关。DNA聚合酶ζ(Polζ)是近年来发现的又一种DNA聚合酶,它无3’→5’外切酶活性，而具有跨损伤修复活性(效率达10% ，Polα只有1%),REV3基因是编码该酶的重要基因,在真菌中跨损伤修复及甲基损伤的碱基切除修复,均需要REV3蛋白的参与,该基因的突变可降低细胞自发突变率[10],可能对遗传不稳定的诱发起着重要作用。编码人的Polζ的基因(hREV3基因)是在1998年才被克隆和鉴定的[3]，以往的研究中未对MNNG处理后它的表达改变进行观察，目前已知人类的该基因在肿瘤中具有高表达,可能与肿瘤发生有关。因此研究hREV3基因的功能以及其与细胞遗传不稳定产生的关系，对于研究肿瘤和遗传性疾病有重要的作用。我们将用本文构建的反义表达质粒转染哺乳细胞，通过反义核酸阻断技术来特异阻断hREV3基因在真核细胞中的表达,并对细胞自发突变率及诱发突变率进行检测,以期做出对hREV3基因在细胞遗传不稳定中作用的评价。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金重点项目(No.39830210)和宁夏教育厅科研基金资助
徐方 宁夏医学院生物教研室(银川 750004)
参考文献
1 Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxcytidyl transferase activity of yeast Rev1 protein.Nature,1996,382:729.
2 Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase ζ.Science,1996,272:1646.
3 Xiao W, Lawchler T,Chow BL, et al. Identification ,chromosome mapping and tissue-specific expression of hREV3 encoding a putative human DNA polymerase ζ.Carcinogenesis,1998,19(5):101.
, 百拇医药
4 胡文蔚,余应年,陈星若，等.反义技术分离筛选抑制Vero细胞非定标突变cDNA片断.科学通报， 1999，44(4):393.
5 冯朝晖,余应年,陈星若. 甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定Vero细胞DNA体外复制的保真度.中国药理学与毒理学杂志，1998,12(2):144.
6 冯朝晖,余应年,陈星若. MNNG诱发的遗传不稳定Vero细胞中错配修复功能研究. 实验生物学报， 1998，31(3):217.
7 胡文蔚,余应年,张小山，等. N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定.中国药理学与毒理学杂志， 1998，12(1)：62.
8 冯朝晖,余应年,陈星若. 小剂量MNNG对Hela细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶II α mRNA水平的影响.中国药理学与毒理学杂志， 1999,(印刷中).
, http://www.100md.com
9 冯朝晖,余应年,陈星若.甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶β mRNA表达水平研究.中国病理杂志， 1999， 15(8)：699.
10 Baynton K,Bresson Roy A,Fuchs RP. Analysis of damage tolerance pathways in Saccharomyces cerevisiae: a requirement for Rev3 DNA polymerase in translesion synthesis. Mol Cell Biol，1998，18(2):960.
(1999年3月2日收稿，1999年4月20日修回), 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室 (杭州 310031)
关键词：遗传学；基因；REV；RNA；反义
表达反义hREV3 基因片段的真核细胞表达质粒的构建 摘 要 目的:构建真核细胞表达重组体，为今后利用反义核酸阻断技术研究hREV3基因功能及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法:用内切酶BamH I及BamH I+Hind Ⅲ分别对pBS-hREV3进行单酶切和双酶切,从而得到含hREV3 cDNA特异性保守序列的两种长度(742bp 和357bp)片段,分别将两者插入真核细胞表达载体:pBK-RSV(持续表达载体)和pMAMneo amp-(表达需经地塞米松诱导)。结果:经酶切图谱分析,筛选出含正向和反向插入片段真核细胞表达重组体5种。结论:为深入研究hREV3基因功能奠定基础。
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Construction of eukaryotic expression plasmid expressing antisense fregment of hREV3
XU Fang， YU Ying-Nian， HU Wen-Wei
Dept. of Pathophysiology,Zhejiang University,Hangzhou(310031)
Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression plasmid to study the role of hREV3 gene in genesis of genetic instability by means of antisense technology. METHODS: Two fragments with different length (742bp and 357bp) that constain the specific conserved region of hREV3 cDNA were obtained by digesting plasmid pBS-hREV3 with restriction enzymes BamH I and BamH I plus Hind III respectively .Two kinds of fragments were inserted into two kinds of eukaryotic expression vector : pBS-RSV(used for constant expression and pMAMneo amp-(used for inducible expression).The inserting orientation of recombinants were identified by digesting with restriction enzymes and electrophoresis analysis. RESULTS: Obtained five kinds of recombinant containing the insertions in sense and antisense orientation. CONCLUSION: These results provide an important basis to further study in genetic instability.
, 百拇医药
MeSH Genetics; Genes, REV; RNA, antisense
REV3基因是近年来在酵母研究中发现的,它与REV7共同编码合成DNA聚合酶ζ (Polζ),参与DNA损伤诱导的突变形成。REV3基因突变不仅能降低由于紫外线、离子辐射或烷化剂处理造成的DNA损伤诱导的突变形成,而且能使真菌自发突变率降低20%[1,2]。人Polζ的编码基因cDNA已从人的cDNA文库中克隆出,命名为hREV3(2.1kb),定位于染色体1p32～33,其mRNA>10kb,并证实它在一些肿瘤中表达增高[3]，提示其表达增高与肿瘤发生有关,可能对遗传不稳定的诱发起着重要作用。我们将利用反义RNA技术来特异性阻断真核细胞hREV3基因的表达,由于真核细胞基因表达调控复杂,在研究hREV3基因功能时,我们构建了诱导表达的和持续表达的反义重组质粒，构建中获得的正向插入的重组体将作对照用。
材料与方法
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一、质粒与有关酶：
pBS-hREV3 [加拿大Saskatchewan大学W.Xiao博士提供,pBS-hREV3为含有hREV3基因全编码序列(2.1kb[3])的pBluescript SK、重组质粒]; pMAMneo amp-[本室提供[4],从pMAMneo (Clontech公司)改建而得,在细菌中扩增具有卡那抗性,外源基因的表达需地塞米松诱导];pBK-RSV(Stratagene公司)。限制性内切酶购自ToKaRa公司和Promega公司。
二、两种长度hREV3 cDNA目的片段的制备：
对pBS-hREV3进行双酶切和单酶切得到含有hREV3cDNA特异性保守序列的两种片段：357 bp短片段(hREV3 short fragment ,RS表示)和742 bp长片段(hREV3 long fragment,RL表示，另带有pBS载体上极小的一段序列)。电泳分离,透析袋法回收目的片段。
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三、重组子构建：
1.持续表达载体pBK-RSV与两种长度目的片段(RS、RL)重组体构建：酶切pBK-RSV和pBS-hREV3，4 ℃，T4 DNA 连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α，提取质粒。单酶切的片段有正、反方向插入, 酶切筛选出正向和反向重组质粒, 以:pB-RL(+)、pB-RL(-)表示(此处pB表示载体pBK-RSV ；+、-分别表示正、反方向) 。双酶切的片段只以一种方向插入,筛选得到一种反向重组质粒，以pB-RS(-)表示(图1)。
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Fig 1 Construction of recombinan
B:BamHI； H:HindⅢ；S:Sall； pB:pBK-RSV；pM:pMAMneo amp-；+：ordinary orientation; -：reverse orientation;
RL:long fragment of hRev 3(742 bp); RS:short fragment of hRev 3(357 bp)
图1 构建重组体技术路线
2.诱导表达载体pMAMneo amp-与357bp hREV3 cDNA片段(RS)的重组体构建：酶切重组体pB-RS(-)和载体pMAMneo amp-(以pM表示)，4 ℃, T4 DNA连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α,在含卡那霉素的LB培养基上选取单菌落,酶切筛选出正向和反向重组体，分别以：pM-RS(+)、pM-RS(-)表示 (图1)。
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结 果
一、重组体构建及其正反取向的鉴定：
1.持续表达载体pBK-RSV与hREV3短片段(RS)构建的重组体pB-RS(-)(图2)：对选出的质粒(Lane 4)，用BamH I+Hind III双酶切进行进一步确认，该质粒被切出2条片段：357bp、4434bp(Lane 7)，分别与同样双酶切自质粒pBS-hREV3及表达载体所得到的片段357bp(Lane 5)和4434bp(Lane 6)长度同，故确认该质粒为重组体，并为反向重组体,定名为:pB-RS(-)。
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Fig 2 Electrophoretic analysis of recombinant pB-RS(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarkers; 2. pBS-hREV3 digested with EcoRⅠ；3～4. pBK-RSV and pB-RS(-) digested with BamH I; 5～7. pBS-hREV 3、 pBK-RSV and pB-RS(-) digested with (Bam H Ⅰ+HindⅢ); 8. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图2 pB-RS(-)重组体鉴定
2.持续表达载体pBK-RSV与hREV3长片段(RL)构建的重组体pB-RL(+)、pB-RL(-) (图3)：选出的两个质粒, 经BamHI酶切均得到2条片段742bp和4452bp(Lane4～5),分别与pBS-hREV3和pBK-RSV自BamHI酶切所得片段742bp (Lane2)和4452bp(Lane3)相同,故可确定此两个质粒为重组体,暂定名为pB-RL-1和pB-RL-2。 用Hind III酶切鉴定方向，正向插入应有：375bp和4819bp 2条片段，而反向插入应有：403bp和4791bp 2条片段。经分析确认pB-RL-1(Lane7)为正向插入重组体pB-RL(+); pB-RL-2( Lane8)为反向插入的重组体pB-RL(-) 。
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Fig 3 Electrophoretic analysis of recombinants pB-RL(+) and pB-RL(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarers; 2～5. pBS-REV 3、 pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 digested with Bam H Ⅰ; 6～8. pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 digested with HindⅢ; 9. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图3 重组体pB-RL(+)和pB-RL(-)鉴定
3.诱导表达载体pMAMneo amp-与hREV3短片段(RS)构建的重组体pM-RS(+)、pM-RS(-)(图4)：对选出的质粒作进一步酶切鉴定，用Hind III + Sal I双酶切该质粒和表达载体，由于表达载体上有2个Hind III位点和1个Sal I位点，插入片段上有1个Hind III位点，故载体可被切出3条片段：5722bp、1214bp、1464bp(Lane 3);而重组体则被酶切出：5722bp、1214bp、1464bp、369bp 4条片段(lane 4～5),其中前3条与表达载体同，后1条为带有hREV3短片段(357bp)的一条,由此可确认Lane 4～5的两个质粒均为重组体，暂定名为pM-RS-1和pM-RS-2。鉴定重组体正、反向可用BamH I酶切，pMAMneo amp-上有3个BamH I位点，插入片段上有1个BamH I位点，因此pMAMneo amp-可被酶切出3条带4563bp、2688bp、1149bp(Lane 6), 而正向重组体可被切出：4071bp、2688bp、1149bp、867bp 4条片段；反向重组体可被酶切出：3696bp、2688bp、1149bp、1242bp 4条片段(后2条在电泳时分辨不开，合为1条)，由此确认pM-RS-1(Lane7)为正向重组体pM-RS(+); pM-RS-2(Lane8)为反向重组体pM-RS(-)。
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Fig 4 Electrophoretic analysis of recombinant pM-RS(+) and pM-RS(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarkers; 2. pBS-hREV 3 digested with (BamH I+ Hind Ⅲ); 3～5. pMAMneo amp-、 pM-RS-1、 pM-RS-2 digested with (Hind Ⅲ+Sa1 1)；6～8.pMAMneo amp-、 pM-RS-1、 pM-RS-2 digested with BamH I； 9. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图4 重组体pM-RS(+)和pM-RS(-)鉴定
讨 论
本实验室发现在小剂量烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)处理引起的哺乳类细胞不稳定现象中，存在DNA复制保真度下降[5],而DNA复制保真度直接影响并维持着生物遗传的稳定性，现已知在细胞中DNA复制保真度主要由参与DNA聚合酶的校读作用及错配修复机制维持的。在MNNG 处理细胞中未发现有错配修复功能的改变[6] ,但证明烷化剂处理后可以诱导一些基因表达的改变[7]，其中包括DNA聚合酶谱的改变。本实验室已用逆转录-PCR技术证明在MNNG处理后DNA聚合酶α、γ、δ与拓扑异构酶Ⅱα的表达并无变化，但无3’校读功能的DNA聚合酶β表达明显升高[8，9]，由于它缺乏校读功能，因此它的表达升高有可能与DNA复制保真度的降低和细胞遗传不稳定有关。DNA聚合酶ζ(Polζ)是近年来发现的又一种DNA聚合酶,它无3’→5’外切酶活性，而具有跨损伤修复活性(效率达10% ，Polα只有1%),REV3基因是编码该酶的重要基因,在真菌中跨损伤修复及甲基损伤的碱基切除修复,均需要REV3蛋白的参与,该基因的突变可降低细胞自发突变率[10],可能对遗传不稳定的诱发起着重要作用。编码人的Polζ的基因(hREV3基因)是在1998年才被克隆和鉴定的[3]，以往的研究中未对MNNG处理后它的表达改变进行观察，目前已知人类的该基因在肿瘤中具有高表达,可能与肿瘤发生有关。因此研究hREV3基因的功能以及其与细胞遗传不稳定产生的关系，对于研究肿瘤和遗传性疾病有重要的作用。我们将用本文构建的反义表达质粒转染哺乳细胞，通过反义核酸阻断技术来特异阻断hREV3基因在真核细胞中的表达,并对细胞自发突变率及诱发突变率进行检测,以期做出对hREV3基因在细胞遗传不稳定中作用的评价。
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* 国家自然科学基金重点项目(No.39830210)和宁夏教育厅科研基金资助
徐方 宁夏医学院生物教研室(银川 750004)
参考文献
1 Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxcytidyl transferase activity of yeast Rev1 protein.Nature,1996,382:729.
2 Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase ζ.Science,1996,272:1646.
3 Xiao W, Lawchler T,Chow BL, et al. Identification ,chromosome mapping and tissue-specific expression of hREV3 encoding a putative human DNA polymerase ζ.Carcinogenesis,1998,19(5):101.
, 百拇医药
4 胡文蔚,余应年,陈星若，等.反义技术分离筛选抑制Vero细胞非定标突变cDNA片断.科学通报， 1999，44(4):393.
5 冯朝晖,余应年,陈星若. 甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定Vero细胞DNA体外复制的保真度.中国药理学与毒理学杂志，1998,12(2):144.
6 冯朝晖,余应年,陈星若. MNNG诱发的遗传不稳定Vero细胞中错配修复功能研究. 实验生物学报， 1998，31(3):217.
7 胡文蔚,余应年,张小山，等. N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定.中国药理学与毒理学杂志， 1998，12(1)：62.
8 冯朝晖,余应年,陈星若. 小剂量MNNG对Hela细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶II α mRNA水平的影响.中国药理学与毒理学杂志， 1999,(印刷中).
, http://www.100md.com
9 冯朝晖,余应年,陈星若.甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶β mRNA表达水平研究.中国病理杂志， 1999， 15(8)：699.
10 Baynton K,Bresson Roy A,Fuchs RP. Analysis of damage tolerance pathways in Saccharomyces cerevisiae: a requirement for Rev3 DNA polymerase in translesion synthesis. Mol Cell Biol，1998，18(2):960.
(1999年3月2日收稿，1999年4月20日修回), 百拇医药