IFN-γ、Epo与类风湿性关节炎贫血相关性研究
作者：朱月永 叶德富 陈君敏
单位：福建医科大学附属第一医院 福建 福州 350005
关键词：贫血；类风湿性关节炎；干扰素γ；促红细胞生成素
中国医师杂志001108 【摘要】 为探讨类风湿性关节炎(RA)伴慢性疾病性贫血(ACD)血清中IFN-γ和Epo变化，及 其发病中作用的可能机制。采用ELISA法检测RA患者血清中IFN-γ及RA伴ACD患者的Epo 变化。并以人肝癌细胞株HepG2为模型，观察IFN-γ对钴盐(CoCl2)诱导的Epo产生的影 响。与正常对照组比较，RA及伴ACD者血清中IFN-γ显著增高，与血红蛋白浓度呈负相关。R A伴ACD者的Epo水平高于正常对照组，但低于同等贫血程度的单纯IDA组。IFN-γ能抑制钴盐 (CoCl2)诱导HepG2的Epo生成。说明RA伴ACD者体内Epo相对不足，IFN-γ可能通过 抑制Epo的生成导致红细胞生成减少而介导RA的ACD发病。
, 百拇医药
[中图分类号] R593.22；R446.62 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372( 2000)11-0658-03
Study on the Correlation between IFN-r,Epo and RA Patients with ACD Complication
ZHU Yue-yong,YE De-fu,CHEN Jun-min.The First Affiliated Hospital,Fu jian Medical University,Fuzhou 350005,China.
【Abstract】 To explore the alteration of interferon gamma(IFN-r) and erythropo ietin(Epo) in sera from rheumatoid arthritis(RA) patients with anemia of chronic disease (ACD) and their role in pathogenesis of ACD complication , we used ELISA method to assay the levels of sera IFN-r and Epo in 77 RA patients co mplicated with ACD.A model of human hepatic cancer cells line Hep G2 was used to study the influence of IFN-r on the Epo production,then compared with control group.The results indicated that the sera IFN-r level of the RA patients with AC D complication was dramatically elevated,and showed negative correlation with h emoglobin concentration.The serum Epo level of the patients group was higher tha n those of control group,but lower than that of patients with simple IDA(iron -deficiency anemia),usually the iron deficiency degree was no difference between the two groups selected,the IFN-r inhibited the Epo production of the Hep G2 cell line induced by cobaltic salt(CoCl2).These findings suggest that the Epo of the RA patients complicated with ACD was relatively dificient,the IFN-r cou ld inhibit the Epo production,so that it leads to decline the serum Epo level.We c o nsider that these changes may be involved to occur ADC complication in RA patien ts.
, 百拇医药
Key Words Anemia,Rheumatiod arthritis;Interforon gamma;Erythropoietin
贫血是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)常见的关节外表现 之一，而最常见的贫血类型是慢性疾病性贫血(anemia of chronic disease,ACD)。其发病 机制未完全明确。我们通过观察RA及RA伴贫血患者血清中干扰素γ(interferon gamma,IFN- γ )和促红细胞生成素(erythropoietin,Epo)的变化；体外培养观察IFN-γ对钴盐诱导HepG2 的Epo生成影响，探讨IFN-γ在RA贫血发病中作用的可能机制。
1 对象和方法
1.1 病例的选择 按美国风湿病协会(ARA)1987年修订的诊断标准选择RA患者；按 血红蛋白(Hb)男≤120g/L、女≤110g/L的标准诊断为贫血。按血清铁降低，总铁结合力降低 或正常，血清铁蛋白(SF)>60μg/L，诊断为RA伴ACD[1]；血清 铁降低，总铁结合 力增高，血清铁蛋白(SF)<60μg/L，诊断为RA伴单纯缺铁性贫血(IDA)。并以经血、骨髓象 及铁代谢指标检查确诊IDA和健康体检者为对照组。
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1.2 一般资料 RA患者77例，男21例，女56例；年龄(16～75)岁，平均( 44.3±14.0)岁；病程1月～40年。其中RA无贫血组28例，贫血组49例；RA伴ACD38例， RA伴缺铁性贫血(IDA)11例。单纯缺铁性贫血组20例，男10例，女10例，年龄(11～65)岁， 平均(29. 9±15.8)岁。所有患者肝肾功能正常，无出血表现。正常对照组30例，男11例，女19例， 年龄21～45岁，平均(25.3±9.6)岁。
1.3 检测方法 取外周静脉血4ml，于6h内分离血清，-20℃冻存；采用EL ISA法检测IFN-γ和Epo。人肝癌细胞株(HepG2)生长的培养基为DMEM(Gibco)，含青霉素10 0u/ml、链霉素100μg/ml，及15%胎牛血清(杭州四季青公司产品，37℃30min灭活处理)；加 入不同浓度的IFN-γ(0、50、100、200、400u/ml)，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培 养24h后，收集上清液，-20℃冻存，待测Epo。
, 百拇医药
1.4 试剂、仪器 IFN-γ和Epo试剂盒均为美国Genyzme产品(购自深圳晶美 生物工程公司)，采用酶标仪(DG3022A型，国营华东电子管厂)在450nm处测定。
1.5 统计学处理 TNFα、IFN-γ和Epo的测定结果以±s表示 。各病例组与正常对照组间比较，先经方差分析后采用Newman-keuls q检验；两者间关系采 用相关分析。
2 结果
2.1 IFN-γ结果 RA患者血中IFN-γ(235.19±171.58)pg/ml高于正常 对 照组(55.16±30.75)pg/ml，差异有显著性(P<0.001)。RA伴ACD组IFN-γ均高于RA 无贫血组及RA伴IDA组；而RA伴IDA组与RA无贫血组的IFN-γ比较差异无显著性(P>0.0 5)，见表1。
表1 各组IFN-γ测定结果(
±s) 组别
, 百拇医药
n
IFN-γ(pg/ml)
正常对照组
30
55.16±30.75
无贫血组
28
160.55±83.20
伴ACD组
38
308.81±206.72..
伴IDA组
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11
170.84±78.65..与正常对照组、RA无贫血组、伴IDA组比较P<0.01(F＝8.17)
2.2 Epo结果 RA伴ACD组的Epo高于正常对照组(P<0.01)，但小于 类似贫血程度的单纯IDA组(P<0.01)。说明RA伴ACD患者体内存在Epo相对不足(见表2) 。 表2 各组Epo的检测值(±s) 组别
n
Epo(mu/ml)
正常对照组
30
14.18±9.90
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RA伴ACD组
38
38.12±17.35..
单纯IDA组
20
60.67±24.56..与正常对照组、单纯IDA组比较P<0.01(F＝4.88)
2.3 IFN-γ与ESR、CRP、Hb相关性 IFN-γ与ESR、CRP呈正相关(r＝0.8 1， P<0.05和r＝0.72，P<0.05)；与RA贫血组的Hb呈负相关(r＝-0.54，P <0.05)。
2.4 不同IFN-γ浓度的Epo生成 随着IFN-γ浓度的增大，对钴盐诱导的人 HepG2的Epo生成呈明显的抑制作用(见表3)。当IFN-γ浓度>200u/ml时，其上清液Epo亦 测不出(<2mu/ml)。表3IFN-γ对钴盐诱导HepG2的Epo生成影响(±s) IFN-r浓度
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n
Epo(mu/ml)
0(u/ml)
5
40.08±3.04
50(u/ml)
5
16.81±2.42
100(u/ml)
5
10.19±1.63**
**与0、50u/ml浓度组比较P<0.01(F＝208.24)
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3 讨论
炎症相关性的ACD，常伴随有巨噬细胞的激活。激活的巨噬细胞产 生许多细胞因子，对红细胞的生成产生影响。本组结果显示，RA患者血清中IFN-γ水平增高 ，且RA伴ACD组的IFN-γ水平增高更为明显，提示IFN-γ可能参与了RA患者ACD的发病过程， 并与疾病的活动性相关。
IFN-γ主要由T淋巴细胞产生，体外试验表明[2，3]，IFN-γ能直接抑制人CFU-E和 BFU-E集落生成。本实验结果显示IFN-γ与RA贫血组的Hb呈负相关，说明IFN-γ值越高，Hb 水平越低。故推测IFN-γ与RA贫血的发病密切相关。
本资料表明，IFN-γ加入HepG2细胞培养24h，随着浓度增大，呈剂量依赖性抑制CoCl2 诱导的Epo生成。同一浓度下的IFN-γ对HepG2细胞生长的抑制远小于它们对Epo的抑制程 度。不同浓度(50u/ml、100u/ml)的IFN-γ对细胞生长的抑制作用差异无统计学意义(P >0.05)。显示IFN-γ对Epo生成的抑制作用，是特异性的而非毒性所致。这种特异性可能 在人体内Epo生成调节中起着重要作用[4]。Faquin等[5]通过Northern bl ot分析，发现细胞因子致Epo生成减少时，常先伴随有Epo mRNA水平的减少，并推测细胞因 子是通过改变Epo mRNA水平而改变Epo的生成。而其介导途径可能是通过蛋白激酶C(PKC)系 统[6]。IFN-γ能抑制体内Epo的生成，通过抑制人红细胞集落形成单位(CFU-E和BF U-E)的生成而介导贫血的发生和发展。
, 百拇医药
RA伴ACD的特征是免疫激活，产生大量的炎症因子。所以，RA伴ACD的发病机制之一，可能是 由于IFN-γ使体内Epo的生成减少所致。
福建省教委资 助(JA97103)
参考文献
1.Hansen TM,Hansen NE,Birgens HS,et al.Serum ferritin and the assessment of iron deficiency in rheumatoid arthritis.Scan J Rheumatol 1983；12：353
2.Means RT,Dessypris EN,Krantz SB.Inhibition of human erythroid colony-f orming units by interleukin-l is mediated by gamma interferon.J Cell Physiol 1992；150：59
, http://www.100md.com
3.Wang CQ,Udupa KB,Lipschitz DA.Interferon-gamma exerts its negative reg ulatory effect primarily on the earliest stages of murine erythroid progenitor c ell development.J Cell Physiol 1995；162：134
4.Jelkmann W,Pagel H,Wolff M,et al.Monkines inhibiting erythropoietin p roduction in human hepatoma cultures and in isolated perfused rat kidneys.Life Science 1992；50：301
5.Faquin WC,Schneider TJ,Goldberg MA.Effect of inflammatory cytokines on hypoxia induced erythropoietin production.Blood 1992；179：1987
6.Faquin WC,Schneider TJ,Goldberg MA.Modulators of protein kinase C inhi bit erythropoietin production in Hep 3B cells.Am Fed Clin Res 1991；39：378
[收稿日期：2000-01-03], 百拇医药
单位：福建医科大学附属第一医院 福建 福州 350005
关键词：贫血；类风湿性关节炎；干扰素γ；促红细胞生成素
中国医师杂志001108 【摘要】 为探讨类风湿性关节炎(RA)伴慢性疾病性贫血(ACD)血清中IFN-γ和Epo变化，及 其发病中作用的可能机制。采用ELISA法检测RA患者血清中IFN-γ及RA伴ACD患者的Epo 变化。并以人肝癌细胞株HepG2为模型，观察IFN-γ对钴盐(CoCl2)诱导的Epo产生的影 响。与正常对照组比较，RA及伴ACD者血清中IFN-γ显著增高，与血红蛋白浓度呈负相关。R A伴ACD者的Epo水平高于正常对照组，但低于同等贫血程度的单纯IDA组。IFN-γ能抑制钴盐 (CoCl2)诱导HepG2的Epo生成。说明RA伴ACD者体内Epo相对不足，IFN-γ可能通过 抑制Epo的生成导致红细胞生成减少而介导RA的ACD发病。
, 百拇医药
[中图分类号] R593.22；R446.62 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372( 2000)11-0658-03
Study on the Correlation between IFN-r,Epo and RA Patients with ACD Complication
ZHU Yue-yong,YE De-fu,CHEN Jun-min.The First Affiliated Hospital,Fu jian Medical University,Fuzhou 350005,China.
【Abstract】 To explore the alteration of interferon gamma(IFN-r) and erythropo ietin(Epo) in sera from rheumatoid arthritis(RA) patients with anemia of chronic disease (ACD) and their role in pathogenesis of ACD complication , we used ELISA method to assay the levels of sera IFN-r and Epo in 77 RA patients co mplicated with ACD.A model of human hepatic cancer cells line Hep G2 was used to study the influence of IFN-r on the Epo production,then compared with control group.The results indicated that the sera IFN-r level of the RA patients with AC D complication was dramatically elevated,and showed negative correlation with h emoglobin concentration.The serum Epo level of the patients group was higher tha n those of control group,but lower than that of patients with simple IDA(iron -deficiency anemia),usually the iron deficiency degree was no difference between the two groups selected,the IFN-r inhibited the Epo production of the Hep G2 cell line induced by cobaltic salt(CoCl2).These findings suggest that the Epo of the RA patients complicated with ACD was relatively dificient,the IFN-r cou ld inhibit the Epo production,so that it leads to decline the serum Epo level.We c o nsider that these changes may be involved to occur ADC complication in RA patien ts.
, 百拇医药
Key Words Anemia,Rheumatiod arthritis;Interforon gamma;Erythropoietin
贫血是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)常见的关节外表现 之一，而最常见的贫血类型是慢性疾病性贫血(anemia of chronic disease,ACD)。其发病 机制未完全明确。我们通过观察RA及RA伴贫血患者血清中干扰素γ(interferon gamma,IFN- γ )和促红细胞生成素(erythropoietin,Epo)的变化；体外培养观察IFN-γ对钴盐诱导HepG2 的Epo生成影响，探讨IFN-γ在RA贫血发病中作用的可能机制。
1 对象和方法
1.1 病例的选择 按美国风湿病协会(ARA)1987年修订的诊断标准选择RA患者；按 血红蛋白(Hb)男≤120g/L、女≤110g/L的标准诊断为贫血。按血清铁降低，总铁结合力降低 或正常，血清铁蛋白(SF)>60μg/L，诊断为RA伴ACD[1]；血清 铁降低，总铁结合 力增高，血清铁蛋白(SF)<60μg/L，诊断为RA伴单纯缺铁性贫血(IDA)。并以经血、骨髓象 及铁代谢指标检查确诊IDA和健康体检者为对照组。
, http://www.100md.com
1.2 一般资料 RA患者77例，男21例，女56例；年龄(16～75)岁，平均( 44.3±14.0)岁；病程1月～40年。其中RA无贫血组28例，贫血组49例；RA伴ACD38例， RA伴缺铁性贫血(IDA)11例。单纯缺铁性贫血组20例，男10例，女10例，年龄(11～65)岁， 平均(29. 9±15.8)岁。所有患者肝肾功能正常，无出血表现。正常对照组30例，男11例，女19例， 年龄21～45岁，平均(25.3±9.6)岁。
1.3 检测方法 取外周静脉血4ml，于6h内分离血清，-20℃冻存；采用EL ISA法检测IFN-γ和Epo。人肝癌细胞株(HepG2)生长的培养基为DMEM(Gibco)，含青霉素10 0u/ml、链霉素100μg/ml，及15%胎牛血清(杭州四季青公司产品，37℃30min灭活处理)；加 入不同浓度的IFN-γ(0、50、100、200、400u/ml)，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培 养24h后，收集上清液，-20℃冻存，待测Epo。
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1.4 试剂、仪器 IFN-γ和Epo试剂盒均为美国Genyzme产品(购自深圳晶美 生物工程公司)，采用酶标仪(DG3022A型，国营华东电子管厂)在450nm处测定。
1.5 统计学处理 TNFα、IFN-γ和Epo的测定结果以±s表示 。各病例组与正常对照组间比较，先经方差分析后采用Newman-keuls q检验；两者间关系采 用相关分析。
2 结果
2.1 IFN-γ结果 RA患者血中IFN-γ(235.19±171.58)pg/ml高于正常 对 照组(55.16±30.75)pg/ml，差异有显著性(P<0.001)。RA伴ACD组IFN-γ均高于RA 无贫血组及RA伴IDA组；而RA伴IDA组与RA无贫血组的IFN-γ比较差异无显著性(P>0.0 5)，见表1。
表1 各组IFN-γ测定结果(
±s) 组别, 百拇医药
n
IFN-γ(pg/ml)
正常对照组
30
55.16±30.75
无贫血组
28
160.55±83.20
伴ACD组
38
308.81±206.72..
伴IDA组
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11
170.84±78.65..与正常对照组、RA无贫血组、伴IDA组比较P<0.01(F＝8.17)
2.2 Epo结果 RA伴ACD组的Epo高于正常对照组(P<0.01)，但小于 类似贫血程度的单纯IDA组(P<0.01)。说明RA伴ACD患者体内存在Epo相对不足(见表2) 。 表2 各组Epo的检测值(
±s) 组别n
Epo(mu/ml)
正常对照组
30
14.18±9.90
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RA伴ACD组
38
38.12±17.35..
单纯IDA组
20
60.67±24.56..与正常对照组、单纯IDA组比较P<0.01(F＝4.88)
2.3 IFN-γ与ESR、CRP、Hb相关性 IFN-γ与ESR、CRP呈正相关(r＝0.8 1， P<0.05和r＝0.72，P<0.05)；与RA贫血组的Hb呈负相关(r＝-0.54，P <0.05)。
2.4 不同IFN-γ浓度的Epo生成 随着IFN-γ浓度的增大，对钴盐诱导的人 HepG2的Epo生成呈明显的抑制作用(见表3)。当IFN-γ浓度>200u/ml时，其上清液Epo亦 测不出(<2mu/ml)。表3IFN-γ对钴盐诱导HepG2的Epo生成影响(
±s) IFN-r浓度, http://www.100md.com
n
Epo(mu/ml)
0(u/ml)
5
40.08±3.04
50(u/ml)
5
16.81±2.42
100(u/ml)
5
10.19±1.63**
**与0、50u/ml浓度组比较P<0.01(F＝208.24)
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3 讨论
炎症相关性的ACD，常伴随有巨噬细胞的激活。激活的巨噬细胞产 生许多细胞因子，对红细胞的生成产生影响。本组结果显示，RA患者血清中IFN-γ水平增高 ，且RA伴ACD组的IFN-γ水平增高更为明显，提示IFN-γ可能参与了RA患者ACD的发病过程， 并与疾病的活动性相关。
IFN-γ主要由T淋巴细胞产生，体外试验表明[2，3]，IFN-γ能直接抑制人CFU-E和 BFU-E集落生成。本实验结果显示IFN-γ与RA贫血组的Hb呈负相关，说明IFN-γ值越高，Hb 水平越低。故推测IFN-γ与RA贫血的发病密切相关。
本资料表明，IFN-γ加入HepG2细胞培养24h，随着浓度增大，呈剂量依赖性抑制CoCl2 诱导的Epo生成。同一浓度下的IFN-γ对HepG2细胞生长的抑制远小于它们对Epo的抑制程 度。不同浓度(50u/ml、100u/ml)的IFN-γ对细胞生长的抑制作用差异无统计学意义(P >0.05)。显示IFN-γ对Epo生成的抑制作用，是特异性的而非毒性所致。这种特异性可能 在人体内Epo生成调节中起着重要作用[4]。Faquin等[5]通过Northern bl ot分析，发现细胞因子致Epo生成减少时，常先伴随有Epo mRNA水平的减少，并推测细胞因 子是通过改变Epo mRNA水平而改变Epo的生成。而其介导途径可能是通过蛋白激酶C(PKC)系 统[6]。IFN-γ能抑制体内Epo的生成，通过抑制人红细胞集落形成单位(CFU-E和BF U-E)的生成而介导贫血的发生和发展。
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RA伴ACD的特征是免疫激活，产生大量的炎症因子。所以，RA伴ACD的发病机制之一，可能是 由于IFN-γ使体内Epo的生成减少所致。
福建省教委资 助(JA97103)
参考文献
1.Hansen TM,Hansen NE,Birgens HS,et al.Serum ferritin and the assessment of iron deficiency in rheumatoid arthritis.Scan J Rheumatol 1983；12：353
2.Means RT,Dessypris EN,Krantz SB.Inhibition of human erythroid colony-f orming units by interleukin-l is mediated by gamma interferon.J Cell Physiol 1992；150：59
, http://www.100md.com
3.Wang CQ,Udupa KB,Lipschitz DA.Interferon-gamma exerts its negative reg ulatory effect primarily on the earliest stages of murine erythroid progenitor c ell development.J Cell Physiol 1995；162：134
4.Jelkmann W,Pagel H,Wolff M,et al.Monkines inhibiting erythropoietin p roduction in human hepatoma cultures and in isolated perfused rat kidneys.Life Science 1992；50：301
5.Faquin WC,Schneider TJ,Goldberg MA.Effect of inflammatory cytokines on hypoxia induced erythropoietin production.Blood 1992；179：1987
6.Faquin WC,Schneider TJ,Goldberg MA.Modulators of protein kinase C inhi bit erythropoietin production in Hep 3B cells.Am Fed Clin Res 1991；39：378
[收稿日期：2000-01-03], 百拇医药