bcl-2、Bax基因与程序化细胞死亡在颞下颌关节发育中的作用
作者：李松 金岩 王惠芸 赵书芳 李媛
单位：李松(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；金岩(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；李媛(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；王惠芸(710032 西安，第四军医大学口腔医学院生理解剖教研室)；赵书芳(710032 西安，第四军医大学口腔医学院腔内科教研室)
关键词：颞下颌关节；基因表达；细胞死亡
中华口腔医学杂志000409 【摘要】 目的 探讨程序化细胞死亡(programmed cell death，PCD)及bcl-2、Bax基因在颞下颌关节发育中的作用。方法 利用缺口末端转移酶标记法(tdt-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL法)、原位杂交检测mRNA技术及免疫组织化学染色分别对SD胎鼠及生后1周颞下颌关节发育不同时期PCD、bcl-2 mRNA及bcl-2、Bax蛋白的表达进行了观察。结果 各时期髁突软骨细胞中均有PCD出现，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域；髁突软骨增殖层及浅肥厚层大部分细胞bcl-2 mRNA表达阳性，深层肥厚层仅有极少数成熟软骨细胞bcl-2 mRNA表达阳性；bcl-2蛋白表达的分布与bcl-2 mRNA基因的表达部位基本一致，进入深层肥厚层减弱、消失；Bax则在髁突软骨全层均有明显表达。结论 髁突软骨细胞PCD主要是受内在bcl-2及Bax基因控制，PCD的部位及数量取决于bcl-2及Bax表达量的变化。bcl-2可能是维持软骨细胞生命，保证软骨细胞增殖、分化和成熟的重要基因之一。
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The role of bcl-2 and Bax genes and programmed cell death in the temporomandibular joint development
LI Song，JIN Yan，WANG Huiyun
(Department of Oral Histology and Pathology， College of Stomatology, The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)
【Abstract】 Objective To evaluate the roles of bcl-2, bax gene and programmed cell death(PCD) in the TMJ development. Methods PCD, expression of both mRNA and protein of bcl-2 and expression of bax protein were observed by Tdt-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL), mRNA in situ hybridization and immunohistochemical staining in TMJ of SD rats during series prenatal and postnatal developmental periods.Results PCD was involved in condylar cartilage in development of different periods. The cells of PCD were mainly located in proliferative zone and the area between prehypertrophic zone and late hypertrophic zone. bcl-2mRNA was expressed with high levels in proliferative and prehypertrophic zones and very few matured chondrocytes expressed bcl-2. The expression of bcl-2 protein showed the same distribution as bcl-2mRNA, but gradually decreased in late hypertrophic zone, compared with strong expression of Bax throughout condylar cartilage. Conclusions PCD of condylar cartilage is regulated by bcl-2 and bax gene, the number and site of PCD are attributed to the change of bcl-2 and bax gene, and bcl-2 is an important gene in maintaining survival of chondrocytes during the proliferation, differentiation and maturation.
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【Key words】 Temporomandibular joint； Gene expression； Cell death development
颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)发育的研究表明，髁突软骨是下颌骨的主要生长区，在TMJ发育的早期，髁突主要由软骨细胞组成，此期的髁突软骨层具有类似于长骨生长板独立生长的特性，其生长主要受内在基因的控制[1]。我们通过观察TMJ发育中髁突软骨的PCD及其与bcl-2、Bax基因表达的关系，探讨了PCD及bcl-2、Bax基因在TMJ发育中的内在调控作用。
材料和方法
1.动物模型及标本制备：选用纯系、3个月龄SD大鼠(上海BK公司提供)20只，雌雄4∶1同笼，每日8∶00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0 d，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠TMJ置于4%多聚甲醛中固定，另取出生后1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠各3只，均取其TMJ部置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中 固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水，石蜡包埋。作TMJ连续矢状切片，厚度约5 μm，切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶。
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2. TUNEL法标记PCD细胞：切片常规脱蜡放置水中，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min；3%H2O2 PBS溶液中处理5 min后，加50 μl的平衡液(TUNEL试剂盒原配，美国Oncor公司)1 min；再加含TDT酶反应液15 μl，37 ℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应；buffer1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；buffer 1 、buffer 3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT4.5 μl、BCIP3.5 μl、左旋咪唑0.24 g/L) 20 μl，暗处显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
3.原位杂交检测bcl-2基因的表达：
(1) 探针及标记：质粒pDOR-SB8.4(第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠)含1.9 kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒DNA，经EcoRI酶切后，将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒(boehringer mannheim公司)说明书，采用随机引物法标记。
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(2)bcl-2 mRNA原位杂交：①石蜡切片脱蜡后置于DEPC水中，分别用0.2 mol/L盐酸和20 mg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥；②用地高辛标记探针于42 ℃杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤；③2%正常羊血清封闭30 min，以下步骤与TUNEL染色相同。
4.免疫组织化学检测bcl-2及Bax的蛋白表达：石蜡切片脱蜡至水，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10 min后，羊血清封闭30 min；加bcl-2及Bax蛋白的单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)置于4℃24 h，室温下复温1 h后滴加生物素化羊抗鼠二抗 37 ℃反应30 min；再加ABC复合物37 ℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片。
结果
, http://www.100md.com 1.TUNEL染色：阳性细胞细胞核呈紫蓝色，胎鼠及出生后幼鼠阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图1，2)，深层的肥厚层的成熟软骨细胞多呈空泡样。
2.bcl-2mRNA原位杂交：bcl-2mRNA阳性反应可出现于细胞浆或细胞核，bcl-2mRNA表达阳性细胞呈紫蓝色，出生前后的关节髁突软骨增殖层、浅肥厚层软骨细胞均有明显的表达(图3)，而进入深层肥厚层仅有极少数bcl-2mRNA阳性表达的成熟软骨细胞散在分布，其余成熟软骨细胞未见表达。
3.bcl-2及Bax蛋白的免疫组织化学染色：bcl-2及Bax 阳性细胞核膜及细胞浆着棕黄色，胎鼠及出生后幼鼠各时间点 bcl-2蛋白的表达在增殖层及浅肥厚层软骨细胞中均较强(图4)，进入深层肥厚层减弱、消失，邻近骨钙化处可见阳性着色成骨细胞；Bax表达蛋白则在髁突软骨全层均有表达；并以浅肥厚层及深层肥厚层明显(图5，6)。出生前及出生后1周各时间点bcl-2mRNA及bcl-2、Bax蛋白的表达分布和强弱基本相同。
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讨论
程序化细胞死亡亦称细胞凋亡(apoptosis)是在基因控制下的一种细胞自我消亡形式。在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着重要的作用。Jacobson 等[2]报道在组织、器官发育形成过程中出现的PCD具有组织塑形、消除不必要结构、控制细胞数量、消除异常、异位、非功能的、有害的细胞等功能。骨和关节的发育是一个复杂的过程，其间伴随着PCD及其调控基因的表达，PCD的紊乱可导致骨和关节的畸形[3]。TMJ结构及功能均复杂，其发育过程中PCD的异常可导致先天性畸形、左右不对称等，可成为TMJ功能紊乱症及TMJ骨关节疾病的病因[4]。
本实验TUNEL法显示在TMJ发育中，下颌骨髁突软骨中有规律性分布的PCD，其阳性细胞主要位于髁突软骨的增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域。此结果与Matsuda等[4]报道不同。一般认为，增殖层是由未分化的间充质细胞构成的，具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力，机体通过PCD控制软骨细胞增殖的数量达到控制骨骼生长的目的。同时，也发挥PCD对关节各部位的塑形作用。Roach等[5]通过鸡股骨软骨生长板的研究发现，软骨生长板肥厚层软骨细胞向骨端移动的过程中逐渐凋亡，证实了软骨成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡形式。本实验PCD出现于浅层肥厚层与深层肥厚层交界区域，推测可能与软骨细胞的成熟相关。
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bcl-2基因是1984年由Tsujimoto 等[6]从14号与18 号染色体易位的滤泡性淋巴瘤中分离出的一种原癌基因。bcl-2基因可以编码2个结构相近的bcl-2α(26 000)和bcl-2β(21 000)蛋白，该蛋白属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜及内质网膜上。已知bcl-2蛋白可控制核内外物质的运输及抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而抑制细胞的凋亡。 Bax基因 与bcl-2基因在组织中广泛表达，可与bcl-2形成异源二聚体，拮抗bcl-2抑制细胞凋亡的作用[7]。Amling等[8]发现在整个长骨生长板都有bcl-2蛋白的表达，并以深层增殖层软骨细胞及浅层肥厚层软骨细胞表达水平高，深层肥厚层细胞表达水平低；Bax则与bcl-2相反。本实验的bcl-2蛋白表达与Amling等的结果基本相似，但Bax 在髁突增殖层也有表达，与bcl-2的表达特征形成了鲜明对比。表明Bax与bcl-2之间量的相对变化决定软骨细胞的生存与死亡。当Bax表达强而bcl-2的表达弱时细胞凋亡；相反，bcl-2表达强而Bax表达弱时细胞保持增殖、存活的能力 。bcl-2 mRNA的表达在进入深层肥厚层仅有极少数软骨细胞呈阳性，其余软骨细胞表达阴性；而bcl-2蛋白表达进入深层肥厚层逐渐减弱、消失。这可能因深层肥厚层bcl-2 mRNA表达水平低或其表达的消失早于蛋白表达。在Bax表达强、bcl-2几乎无表达的深层肥厚层中，TUNEL法显示该处成熟软骨细胞多呈空泡样，却未见明显的PCD阳性细胞。这可能是深层的肥厚层软骨细胞分化、成熟后，并未以PCD的形式很快消除，而处于低代谢的生命状态。
, 百拇医药
以上可见，出生前及生后1周SD大鼠的TMJ发育中髁突软骨细胞均有PCD，髁突软骨细胞的PCD是受内在bcl-2及Bax基因控制的主动过程，PCD部位及数量取决于bcl-2及Bax表达量的变化，bcl-2及Bax基因可通过调控PCD的数量调节髁突软骨细胞的增殖、分化、成熟，参与控制TMJ的发育。
图1 髁突软骨增殖层PCD阳性细胞(箭头)(TUNEL染色×40)
图2 髁突软骨浅层肥厚层与深层肥厚层交界区PCD阳性细胞(箭头)(TUNEL染色×40)
图3 原位杂交髁突软骨浅肥厚层软骨细胞bcl-2mRNA表达阳性细胞(箭头)(TUNEL×40)
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图4 胚胎19 d髁突软骨增殖层( P )及浅肥厚层( H )软骨细胞bcl-2蛋白明显表达(箭头)(P为增殖层阳性细胞，H为浅肥厚层阳性细胞)(免疫组织化学染色×40)
图5 胚胎19 d髁突软骨浅肥厚层Bax蛋白表达阳性细胞(箭头)(免疫组织化学染色×40)
图6 胚胎19 d髁突软骨深层肥厚层Bax蛋白表达阳性细胞(箭头)(免疫组织化学染色×40)
参考文献
1，Copray JC, Dibbets JM, Kantomaa T. The role of condylar cartilage in the development of the temporomandibular joint. Angle Orthod，1988，58:369-380.
, http://www.100md.com
2，Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997,88:347-354.
3，Macias D, Ganan Y, Sampath TK, et al. Role of BMP-2 and OP-1(BMP-7) in programmed cell death skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124:1 109-1 117.
4，Matsuda S, Mishima K, Yoshimura Y, et al. Apoptosis in the development of the temporomandibular joint. Anat Embryol,1997,196:383-391.
, 百拇医药
5，Roach HI, Erenpreisa J, Aigner T. Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis. J Cell Biol, 1995, 131:483-494.
6，Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the chromosome translocation. Science ,1984, 226:1 097-1 099.
7，Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609-619.
8，Amling M, Neff L, Tanaka S, et al. bcl-2 lies downstream of parathyroid hormone-related peptide in a signaling pathway that regulates chondrocyte maturation during skeletal development. J Cell Biol,1997, 136:205-213.
(收稿日期：1999-08-23), 百拇医药
单位：李松(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；金岩(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；李媛(710032 西安，第四军医大学口腔医学院组织病理教研室)；王惠芸(710032 西安，第四军医大学口腔医学院生理解剖教研室)；赵书芳(710032 西安，第四军医大学口腔医学院腔内科教研室)
关键词：颞下颌关节；基因表达；细胞死亡
中华口腔医学杂志000409 【摘要】 目的 探讨程序化细胞死亡(programmed cell death，PCD)及bcl-2、Bax基因在颞下颌关节发育中的作用。方法 利用缺口末端转移酶标记法(tdt-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL法)、原位杂交检测mRNA技术及免疫组织化学染色分别对SD胎鼠及生后1周颞下颌关节发育不同时期PCD、bcl-2 mRNA及bcl-2、Bax蛋白的表达进行了观察。结果 各时期髁突软骨细胞中均有PCD出现，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域；髁突软骨增殖层及浅肥厚层大部分细胞bcl-2 mRNA表达阳性，深层肥厚层仅有极少数成熟软骨细胞bcl-2 mRNA表达阳性；bcl-2蛋白表达的分布与bcl-2 mRNA基因的表达部位基本一致，进入深层肥厚层减弱、消失；Bax则在髁突软骨全层均有明显表达。结论 髁突软骨细胞PCD主要是受内在bcl-2及Bax基因控制，PCD的部位及数量取决于bcl-2及Bax表达量的变化。bcl-2可能是维持软骨细胞生命，保证软骨细胞增殖、分化和成熟的重要基因之一。
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The role of bcl-2 and Bax genes and programmed cell death in the temporomandibular joint development
LI Song，JIN Yan，WANG Huiyun
(Department of Oral Histology and Pathology， College of Stomatology, The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)
【Abstract】 Objective To evaluate the roles of bcl-2, bax gene and programmed cell death(PCD) in the TMJ development. Methods PCD, expression of both mRNA and protein of bcl-2 and expression of bax protein were observed by Tdt-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL), mRNA in situ hybridization and immunohistochemical staining in TMJ of SD rats during series prenatal and postnatal developmental periods.Results PCD was involved in condylar cartilage in development of different periods. The cells of PCD were mainly located in proliferative zone and the area between prehypertrophic zone and late hypertrophic zone. bcl-2mRNA was expressed with high levels in proliferative and prehypertrophic zones and very few matured chondrocytes expressed bcl-2. The expression of bcl-2 protein showed the same distribution as bcl-2mRNA, but gradually decreased in late hypertrophic zone, compared with strong expression of Bax throughout condylar cartilage. Conclusions PCD of condylar cartilage is regulated by bcl-2 and bax gene, the number and site of PCD are attributed to the change of bcl-2 and bax gene, and bcl-2 is an important gene in maintaining survival of chondrocytes during the proliferation, differentiation and maturation.
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【Key words】 Temporomandibular joint； Gene expression； Cell death development
颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)发育的研究表明，髁突软骨是下颌骨的主要生长区，在TMJ发育的早期，髁突主要由软骨细胞组成，此期的髁突软骨层具有类似于长骨生长板独立生长的特性，其生长主要受内在基因的控制[1]。我们通过观察TMJ发育中髁突软骨的PCD及其与bcl-2、Bax基因表达的关系，探讨了PCD及bcl-2、Bax基因在TMJ发育中的内在调控作用。
材料和方法
1.动物模型及标本制备：选用纯系、3个月龄SD大鼠(上海BK公司提供)20只，雌雄4∶1同笼，每日8∶00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0 d，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠TMJ置于4%多聚甲醛中固定，另取出生后1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠各3只，均取其TMJ部置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中 固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水，石蜡包埋。作TMJ连续矢状切片，厚度约5 μm，切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶。
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2. TUNEL法标记PCD细胞：切片常规脱蜡放置水中，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min；3%H2O2 PBS溶液中处理5 min后，加50 μl的平衡液(TUNEL试剂盒原配，美国Oncor公司)1 min；再加含TDT酶反应液15 μl，37 ℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应；buffer1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；buffer 1 、buffer 3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT4.5 μl、BCIP3.5 μl、左旋咪唑0.24 g/L) 20 μl，暗处显色；中止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
3.原位杂交检测bcl-2基因的表达：
(1) 探针及标记：质粒pDOR-SB8.4(第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠)含1.9 kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒DNA，经EcoRI酶切后，将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒(boehringer mannheim公司)说明书，采用随机引物法标记。
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(2)bcl-2 mRNA原位杂交：①石蜡切片脱蜡后置于DEPC水中，分别用0.2 mol/L盐酸和20 mg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥；②用地高辛标记探针于42 ℃杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤；③2%正常羊血清封闭30 min，以下步骤与TUNEL染色相同。
4.免疫组织化学检测bcl-2及Bax的蛋白表达：石蜡切片脱蜡至水，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10 min后，羊血清封闭30 min；加bcl-2及Bax蛋白的单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)置于4℃24 h，室温下复温1 h后滴加生物素化羊抗鼠二抗 37 ℃反应30 min；再加ABC复合物37 ℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片。
结果
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2.bcl-2mRNA原位杂交：bcl-2mRNA阳性反应可出现于细胞浆或细胞核，bcl-2mRNA表达阳性细胞呈紫蓝色，出生前后的关节髁突软骨增殖层、浅肥厚层软骨细胞均有明显的表达(图3)，而进入深层肥厚层仅有极少数bcl-2mRNA阳性表达的成熟软骨细胞散在分布，其余成熟软骨细胞未见表达。
3.bcl-2及Bax蛋白的免疫组织化学染色：bcl-2及Bax 阳性细胞核膜及细胞浆着棕黄色，胎鼠及出生后幼鼠各时间点 bcl-2蛋白的表达在增殖层及浅肥厚层软骨细胞中均较强(图4)，进入深层肥厚层减弱、消失，邻近骨钙化处可见阳性着色成骨细胞；Bax表达蛋白则在髁突软骨全层均有表达；并以浅肥厚层及深层肥厚层明显(图5，6)。出生前及出生后1周各时间点bcl-2mRNA及bcl-2、Bax蛋白的表达分布和强弱基本相同。
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讨论
程序化细胞死亡亦称细胞凋亡(apoptosis)是在基因控制下的一种细胞自我消亡形式。在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着重要的作用。Jacobson 等[2]报道在组织、器官发育形成过程中出现的PCD具有组织塑形、消除不必要结构、控制细胞数量、消除异常、异位、非功能的、有害的细胞等功能。骨和关节的发育是一个复杂的过程，其间伴随着PCD及其调控基因的表达，PCD的紊乱可导致骨和关节的畸形[3]。TMJ结构及功能均复杂，其发育过程中PCD的异常可导致先天性畸形、左右不对称等，可成为TMJ功能紊乱症及TMJ骨关节疾病的病因[4]。
本实验TUNEL法显示在TMJ发育中，下颌骨髁突软骨中有规律性分布的PCD，其阳性细胞主要位于髁突软骨的增殖层及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域。此结果与Matsuda等[4]报道不同。一般认为，增殖层是由未分化的间充质细胞构成的，具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力，机体通过PCD控制软骨细胞增殖的数量达到控制骨骼生长的目的。同时，也发挥PCD对关节各部位的塑形作用。Roach等[5]通过鸡股骨软骨生长板的研究发现，软骨生长板肥厚层软骨细胞向骨端移动的过程中逐渐凋亡，证实了软骨成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡形式。本实验PCD出现于浅层肥厚层与深层肥厚层交界区域，推测可能与软骨细胞的成熟相关。
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bcl-2基因是1984年由Tsujimoto 等[6]从14号与18 号染色体易位的滤泡性淋巴瘤中分离出的一种原癌基因。bcl-2基因可以编码2个结构相近的bcl-2α(26 000)和bcl-2β(21 000)蛋白，该蛋白属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜及内质网膜上。已知bcl-2蛋白可控制核内外物质的运输及抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而抑制细胞的凋亡。 Bax基因 与bcl-2基因在组织中广泛表达，可与bcl-2形成异源二聚体，拮抗bcl-2抑制细胞凋亡的作用[7]。Amling等[8]发现在整个长骨生长板都有bcl-2蛋白的表达，并以深层增殖层软骨细胞及浅层肥厚层软骨细胞表达水平高，深层肥厚层细胞表达水平低；Bax则与bcl-2相反。本实验的bcl-2蛋白表达与Amling等的结果基本相似，但Bax 在髁突增殖层也有表达，与bcl-2的表达特征形成了鲜明对比。表明Bax与bcl-2之间量的相对变化决定软骨细胞的生存与死亡。当Bax表达强而bcl-2的表达弱时细胞凋亡；相反，bcl-2表达强而Bax表达弱时细胞保持增殖、存活的能力 。bcl-2 mRNA的表达在进入深层肥厚层仅有极少数软骨细胞呈阳性，其余软骨细胞表达阴性；而bcl-2蛋白表达进入深层肥厚层逐渐减弱、消失。这可能因深层肥厚层bcl-2 mRNA表达水平低或其表达的消失早于蛋白表达。在Bax表达强、bcl-2几乎无表达的深层肥厚层中，TUNEL法显示该处成熟软骨细胞多呈空泡样，却未见明显的PCD阳性细胞。这可能是深层的肥厚层软骨细胞分化、成熟后，并未以PCD的形式很快消除，而处于低代谢的生命状态。
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以上可见，出生前及生后1周SD大鼠的TMJ发育中髁突软骨细胞均有PCD，髁突软骨细胞的PCD是受内在bcl-2及Bax基因控制的主动过程，PCD部位及数量取决于bcl-2及Bax表达量的变化，bcl-2及Bax基因可通过调控PCD的数量调节髁突软骨细胞的增殖、分化、成熟，参与控制TMJ的发育。
图1 髁突软骨增殖层PCD阳性细胞(箭头)(TUNEL染色×40)
图2 髁突软骨浅层肥厚层与深层肥厚层交界区PCD阳性细胞(箭头)(TUNEL染色×40)
图3 原位杂交髁突软骨浅肥厚层软骨细胞bcl-2mRNA表达阳性细胞(箭头)(TUNEL×40)
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图4 胚胎19 d髁突软骨增殖层( P )及浅肥厚层( H )软骨细胞bcl-2蛋白明显表达(箭头)(P为增殖层阳性细胞，H为浅肥厚层阳性细胞)(免疫组织化学染色×40)
图5 胚胎19 d髁突软骨浅肥厚层Bax蛋白表达阳性细胞(箭头)(免疫组织化学染色×40)
图6 胚胎19 d髁突软骨深层肥厚层Bax蛋白表达阳性细胞(箭头)(免疫组织化学染色×40)
参考文献
1，Copray JC, Dibbets JM, Kantomaa T. The role of condylar cartilage in the development of the temporomandibular joint. Angle Orthod，1988，58:369-380.
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2，Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997,88:347-354.
3，Macias D, Ganan Y, Sampath TK, et al. Role of BMP-2 and OP-1(BMP-7) in programmed cell death skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124:1 109-1 117.
4，Matsuda S, Mishima K, Yoshimura Y, et al. Apoptosis in the development of the temporomandibular joint. Anat Embryol,1997,196:383-391.
, 百拇医药
5，Roach HI, Erenpreisa J, Aigner T. Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis. J Cell Biol, 1995, 131:483-494.
6，Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the chromosome translocation. Science ,1984, 226:1 097-1 099.
7，Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609-619.
8，Amling M, Neff L, Tanaka S, et al. bcl-2 lies downstream of parathyroid hormone-related peptide in a signaling pathway that regulates chondrocyte maturation during skeletal development. J Cell Biol,1997, 136:205-213.
(收稿日期：1999-08-23), 百拇医药