层粘连蛋白反义RNA对TGFβ1调节五种细胞内信号分子表达的影响
作者：刘宝瑞 刘文超 宁国礼
单位：刘宝瑞(710032西安，第四军医大学西京医院肿瘤中心)；刘文超(710032西安，第四军医大学西京医院肿瘤中心)；宁国礼(第四军医大学吉林医学院)
关键词：层粘连蛋白；反义RNA；转化生长因子β1；大肠肿瘤
New Page 1 【摘要】 目的 明确转化生长因子(transforming growth factor β1，TGF β1)对大肠癌细胞E-钙粘着蛋白、α-、β-、γ-连环蛋白及粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的影响，明确层粘连蛋白(laminin,LM)反义RNA对上述表达的调节作用。方法 采用免疫印迹技术检测各蛋白的表达水平，采用增强的化学发光技术显示结果。结果 TGF β1可促进α-和γ-连环蛋白表达。该表达不受LM反义RNA的影响；TGF β1可促进E-钙粘着蛋白表达，但LM反义RNA既可抑制E-钙粘着蛋白表达，又能抑制TGF β1对该蛋白的调节作用；TGF β1只有在LM反义RNA存在下才具有抑制FAK表达的作用。结论 TGF β1对肿瘤恶性表型的抑制作用可能与E-钙粘着蛋白、α-、γ-连环蛋白表达增加有关，E-钙粘着蛋白和FAK表达的改变可能是TGF β1通过影响LM的表达间接作用所致。TGF β1对肿瘤细胞表型的影响是多种蛋白综合作用的结果。
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Effect of laminin antisense RNA on the expression of five intracellular proteins stimulated by transforming growth factor β1*
LIU Baorui LIU Wenchao
(Department of Oncology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shanxi,710032 P.R. China. E-mail:brliu@fmmu.edu.cn)
NING Guoli
(Jilin Medical College of the Fourth Military Medical University)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effect of laminin antisense RNA on the expression of E-cadherin, α-, β-,γ-catenins and focal adhesion kinase(FAK) stimulated by transforming growth factor β1 (TGFβ1). Methods Western blot technique was used to study their expression at protein level with ECL reagent. Results The expression of α- and γ-catenins was up regulated by TGFβ1 without the interference of laminin antisense RNA. The up regulation of E-cadherin stimulated by TGFβ1 was inhibited in the presence of laminin antisense RNA. No change was found in the expression of FAK when stimulated by TGFβ1, alone, but its expression was down regulated with the help of laminin antisense RNA.ConclusionThe inhibition of TGF β1 on the malignancy of colon cancer cell may partially be mediated by the up regulation of E-cadherin and catenins.The effect of TGF β1 on the expression of E-cadherin and FAK may be the secondary results of the change in laminin expression.
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【Key words】 laminin; antisense RNA; transforming growth factor β1; colon neoplasms
转化生长因子(transforming growth factor β1,TGF β1)是一种多功能多肽生长因子，在上皮来源的肿瘤细胞中，可抑制或逆转肿瘤细胞的生长、浸润等恶性表型。TGF β1通过细胞表面的TGF β受体发挥作用。现已明确，TGF β1可诱导多种细胞外粘附分子如纤维连接蛋白、癌胚抗原及层粘连蛋白(laminin,LM)的表达，这些蛋白的表达受蛋白激酶C磷酸转移酶活性的调节[1]。然而TGF β1对细胞内信号分子及诸多蛋白表达的作用尚不清楚。近年来的研究表明[2，3]，E-钙粘着蛋白(E-cadherin)、α-、β-、γ-连环蛋白(catenin)和粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)，在调节肿瘤生长、浸润及转移中发挥着重要作用。为明确TGFβ1对上述分子的调节作用，以及LM及TGFβ1调节这些分子可能的影响，我们采用免疫印迹技术对上述5种分子的表达进行了检测，以进一步探讨TGFβ1对肿瘤细胞恶性表型逆转的机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞培养及TGFβ1刺激 Moser细胞是大肠中分化腺癌细胞系、细胞表面表达TGFβ1受体，与TGFβ1亲合力强。该细胞于改良McCoy's细胞培养液(含5%胎牛血清)中培养传代。将细胞置于含TGFβ1(10 μg/L)的培养液中刺激48 h，其间更换TGFβ1培养液1次。收集细胞、洗涤，用O'Farel裂解液(含尿素NP-40和多种蛋白酶抑制剂)裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量。
层连粘蛋白反义RNA的构建及转染Moser细胞参见文献[4]。将两株已转入LM反义RNA的Moser细胞(称为ASA1，ASA2)在选择性培养液中，加入TGFβ1(10 μg/L)刺激48 h，其间更换培养液1次。收集细胞、裂解，提取蛋白并定量。
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1.2 免疫印迹 鼠抗人E-钙粘着蛋白、α-、β-、γ-连环蛋白、FAK及β-actin单克隆抗体购自Transduction Laboratories Inc,HRP-羊抗鼠免疫球蛋白及增效化学发光试剂购自Amsham公司。待测蛋白(40 μg/孔)经变性后在8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转移至硝酸纤维素膜，用含5%去脂奶粉的0.1% TBS-Tween 20封闭1 h，加入一抗，室温反应1 h，洗涤后加入酶标二抗，1 h后洗涤，最后加入发光试剂，暗室内曝光、显色。
2 结果
5种蛋白分子的免疫印迹结果见图1。每种印迹均同时检测β-actin含量，以确保各蛋白加入量相同。从图中可以看出α-、γ-连环蛋白经TGFβ1刺激后表达量明显增加，且其表达不受LM反义RNA的影响。β-连环蛋白的表达没有变化。E-钙粘着蛋白受TGF β1刺激后表达量也增加，但LM反义RNA可明显抑制该蛋白的表达，同时也抑制了TGFβ1对其表达的调节作用，TGFβ1刺激FAK蛋白表达的效果不明显，但在LM反义RNA的作用下，FAK的表达在TGFβ1刺激下明显减少。
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图1 5种蛋白分子免疫印迹结果 1：Moser细胞；2：Moser细胞，TGFβ1刺激；3：ASA1；4：ASA1细胞，TGFβ1刺激；5：ASA2细胞；6：ASA2细胞，TGFβ1刺激
Fig 1 Western blot analysis of five proteins stimulated by TGFβ1 Lane 1:Moser cell; lane 2:Moser cell stimulated by TGFβ1; lane 3:ASA1 cell; lane 4:ASA1 cell stimulated by TGFβ1; lane 5:ASA2 cell; lane 6:ASA2 cell stimulated by TGFβ1
, 百拇医药
3 讨论
E-钙粘着蛋白是一种分子量为120×103的糖蛋白，在上皮起源的细胞中，可与胞浆内连环蛋白α、β、γ形成复合体，作用于细胞骨架蛋白，影响细胞形态、粘附及运动功能。近年来有研究发现E-钙粘着蛋白、α-、γ-、连环蛋白表达减少常见于侵袭性高、分化程度低的肿瘤细胞中，当转入E-钙粘着蛋白基因使其表达增加后，细胞的恶性表型也随之逆转，因此表达上述蛋白的基因被认为属于肿瘤抑制基因，发挥抑制肿瘤的作用[2，5，6]。β-连环蛋白在肿瘤侵袭中的作用目前难以明确[5，6]。
TGFβ1抑制肿瘤细胞生长、浸润及转移的作用已十分肯定。TGFβ1可引起细胞外粘附分子表达的改变，但对细胞内各信号转导分子及多种蛋白的影响却缺乏进一步的研究。我们以大肠癌细胞为研究对象，证实TGFβ1对E-钙粘着蛋白、α-、γ-连环蛋白的表达有明显的促进作用，提示TGFβ1对肿瘤细胞恶性表型的逆转过程可能有上述分子的参与。进一步研究发现，E-钙粘着蛋白的表达水平受细胞内LM含量的调节，LM表达下降不仅使E-钙粘着蛋白表达也下降，还可阻止TGFβ1对该分子表达的调节作用。这一现象提示TGFβ1对E-钙粘着蛋白的影响是其调节LM表达后续作用结果。
, 百拇医药
FAK是一种细胞内信号传导分子。当正常上皮细胞脱离与细胞外基质粘附时，细胞将启动程度化死亡过程，但是FAK可使细胞永生化并使细胞恶性变[7]。在大肠癌等细胞中，FAK表达增加，因而有人将FAK基因归类为癌基因[8]。我们的研究结果提示TGFβ1对FAK表达的调节比较特殊，通常情况下TGFβ1并不能引起FAK表达发生变化，只有在LM表达下降时TGFβ1才能引起FAK表达下降。
总之，通过研究TGFβ1对E-钙粘着蛋白等5种蛋白分子表达的影响，发现TGFβ1对α-、γ-连环蛋白、E-钙粘着蛋白和FAK的表达均有一定调节作用，其中对后两种蛋白的调节受到LM的影响，在调节方式上存在一定差异。这一发现无疑会增加对肿瘤生长及浸润、转移的认识，同时也提示TGFβ1对细胞的刺激可引起多种分子表达的改变，其过程十分复杂。TGFβ1对细胞恶性表型的影响是诸多分子表达改变后共同作用的结果。
, 百拇医药
参考文献
[1]Chakrabarty S, Reynolds S, Wang H, et al.Action of polypeptide growth factors in colon cancer:development of new therapeutic approaches. Frontiers in Bioscience, 1997,2(3)∶460-470.
[2]Zschiesche W, Schonborn I, Behrens J, et al.Expression of E-cadherin and catenins in invasive mammary carcinomas. Anticancer Res, 1997,17(1B)∶561-567.
[3]Chakrabarty S, Wang H. Emerging therapeutic targets for human colon cancinoma. Emerging Therapeutic Targets, 1998,2(2)∶195-211.
, 百拇医药
[4]Chakrabarty S, Rajagopal S. PKC α controls the TGFβ1-mediated adhesion response of human colon carcinoma cells:two distinct branches of post PKC α signal pathway leads to induction of laminin, fibronectin and CEA by TGFβ1. Lab Invest, 1998,78(4)∶413-421.
[5]Hiscox S, Jiang WG. Expression of E-cadherin, alpha, beta and gamma-catenin in human colorectal cancer cells. Anticancer Res, 1997,17(2B)∶1349-1454.
, 百拇医药 [6]Lipschutz JH, Kissil JL. Expression of β-catenin and γ-catenin in epithelial tumor cell lines and characterization of a unique cell line. Cancer Lett, 1998,126(1)∶33-41.
[7]Frisch SM, Vuori K, Rouslahti E, et al.Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol, 1996,134(4)∶793-799.
[8]Owenslv XUL, Craven RJ. Overexpression of focal adhesion kinase (P125FAX) in invasive human tumours. Cancer Res, 1995,55(12)∶2752-2755.
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药
单位：刘宝瑞(710032西安，第四军医大学西京医院肿瘤中心)；刘文超(710032西安，第四军医大学西京医院肿瘤中心)；宁国礼(第四军医大学吉林医学院)
关键词：层粘连蛋白；反义RNA；转化生长因子β1；大肠肿瘤
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Effect of laminin antisense RNA on the expression of five intracellular proteins stimulated by transforming growth factor β1*
LIU Baorui LIU Wenchao
(Department of Oncology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shanxi,710032 P.R. China. E-mail:brliu@fmmu.edu.cn)
NING Guoli
(Jilin Medical College of the Fourth Military Medical University)
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【Abstract】 Objective To investigate the effect of laminin antisense RNA on the expression of E-cadherin, α-, β-,γ-catenins and focal adhesion kinase(FAK) stimulated by transforming growth factor β1 (TGFβ1). Methods Western blot technique was used to study their expression at protein level with ECL reagent. Results The expression of α- and γ-catenins was up regulated by TGFβ1 without the interference of laminin antisense RNA. The up regulation of E-cadherin stimulated by TGFβ1 was inhibited in the presence of laminin antisense RNA. No change was found in the expression of FAK when stimulated by TGFβ1, alone, but its expression was down regulated with the help of laminin antisense RNA.ConclusionThe inhibition of TGF β1 on the malignancy of colon cancer cell may partially be mediated by the up regulation of E-cadherin and catenins.The effect of TGF β1 on the expression of E-cadherin and FAK may be the secondary results of the change in laminin expression.
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【Key words】 laminin; antisense RNA; transforming growth factor β1; colon neoplasms
转化生长因子(transforming growth factor β1,TGF β1)是一种多功能多肽生长因子，在上皮来源的肿瘤细胞中，可抑制或逆转肿瘤细胞的生长、浸润等恶性表型。TGF β1通过细胞表面的TGF β受体发挥作用。现已明确，TGF β1可诱导多种细胞外粘附分子如纤维连接蛋白、癌胚抗原及层粘连蛋白(laminin,LM)的表达，这些蛋白的表达受蛋白激酶C磷酸转移酶活性的调节[1]。然而TGF β1对细胞内信号分子及诸多蛋白表达的作用尚不清楚。近年来的研究表明[2，3]，E-钙粘着蛋白(E-cadherin)、α-、β-、γ-连环蛋白(catenin)和粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)，在调节肿瘤生长、浸润及转移中发挥着重要作用。为明确TGFβ1对上述分子的调节作用，以及LM及TGFβ1调节这些分子可能的影响，我们采用免疫印迹技术对上述5种分子的表达进行了检测，以进一步探讨TGFβ1对肿瘤细胞恶性表型逆转的机理。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养及TGFβ1刺激 Moser细胞是大肠中分化腺癌细胞系、细胞表面表达TGFβ1受体，与TGFβ1亲合力强。该细胞于改良McCoy's细胞培养液(含5%胎牛血清)中培养传代。将细胞置于含TGFβ1(10 μg/L)的培养液中刺激48 h，其间更换TGFβ1培养液1次。收集细胞、洗涤，用O'Farel裂解液(含尿素NP-40和多种蛋白酶抑制剂)裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量。
层连粘蛋白反义RNA的构建及转染Moser细胞参见文献[4]。将两株已转入LM反义RNA的Moser细胞(称为ASA1，ASA2)在选择性培养液中，加入TGFβ1(10 μg/L)刺激48 h，其间更换培养液1次。收集细胞、裂解，提取蛋白并定量。
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1.2 免疫印迹 鼠抗人E-钙粘着蛋白、α-、β-、γ-连环蛋白、FAK及β-actin单克隆抗体购自Transduction Laboratories Inc,HRP-羊抗鼠免疫球蛋白及增效化学发光试剂购自Amsham公司。待测蛋白(40 μg/孔)经变性后在8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转移至硝酸纤维素膜，用含5%去脂奶粉的0.1% TBS-Tween 20封闭1 h，加入一抗，室温反应1 h，洗涤后加入酶标二抗，1 h后洗涤，最后加入发光试剂，暗室内曝光、显色。
2 结果
5种蛋白分子的免疫印迹结果见图1。每种印迹均同时检测β-actin含量，以确保各蛋白加入量相同。从图中可以看出α-、γ-连环蛋白经TGFβ1刺激后表达量明显增加，且其表达不受LM反义RNA的影响。β-连环蛋白的表达没有变化。E-钙粘着蛋白受TGF β1刺激后表达量也增加，但LM反义RNA可明显抑制该蛋白的表达，同时也抑制了TGFβ1对其表达的调节作用，TGFβ1刺激FAK蛋白表达的效果不明显，但在LM反义RNA的作用下，FAK的表达在TGFβ1刺激下明显减少。
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图1 5种蛋白分子免疫印迹结果 1：Moser细胞；2：Moser细胞，TGFβ1刺激；3：ASA1；4：ASA1细胞，TGFβ1刺激；5：ASA2细胞；6：ASA2细胞，TGFβ1刺激
Fig 1 Western blot analysis of five proteins stimulated by TGFβ1 Lane 1:Moser cell; lane 2:Moser cell stimulated by TGFβ1; lane 3:ASA1 cell; lane 4:ASA1 cell stimulated by TGFβ1; lane 5:ASA2 cell; lane 6:ASA2 cell stimulated by TGFβ1
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3 讨论
E-钙粘着蛋白是一种分子量为120×103的糖蛋白，在上皮起源的细胞中，可与胞浆内连环蛋白α、β、γ形成复合体，作用于细胞骨架蛋白，影响细胞形态、粘附及运动功能。近年来有研究发现E-钙粘着蛋白、α-、γ-、连环蛋白表达减少常见于侵袭性高、分化程度低的肿瘤细胞中，当转入E-钙粘着蛋白基因使其表达增加后，细胞的恶性表型也随之逆转，因此表达上述蛋白的基因被认为属于肿瘤抑制基因，发挥抑制肿瘤的作用[2，5，6]。β-连环蛋白在肿瘤侵袭中的作用目前难以明确[5，6]。
TGFβ1抑制肿瘤细胞生长、浸润及转移的作用已十分肯定。TGFβ1可引起细胞外粘附分子表达的改变，但对细胞内各信号转导分子及多种蛋白的影响却缺乏进一步的研究。我们以大肠癌细胞为研究对象，证实TGFβ1对E-钙粘着蛋白、α-、γ-连环蛋白的表达有明显的促进作用，提示TGFβ1对肿瘤细胞恶性表型的逆转过程可能有上述分子的参与。进一步研究发现，E-钙粘着蛋白的表达水平受细胞内LM含量的调节，LM表达下降不仅使E-钙粘着蛋白表达也下降，还可阻止TGFβ1对该分子表达的调节作用。这一现象提示TGFβ1对E-钙粘着蛋白的影响是其调节LM表达后续作用结果。
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FAK是一种细胞内信号传导分子。当正常上皮细胞脱离与细胞外基质粘附时，细胞将启动程度化死亡过程，但是FAK可使细胞永生化并使细胞恶性变[7]。在大肠癌等细胞中，FAK表达增加，因而有人将FAK基因归类为癌基因[8]。我们的研究结果提示TGFβ1对FAK表达的调节比较特殊，通常情况下TGFβ1并不能引起FAK表达发生变化，只有在LM表达下降时TGFβ1才能引起FAK表达下降。
总之，通过研究TGFβ1对E-钙粘着蛋白等5种蛋白分子表达的影响，发现TGFβ1对α-、γ-连环蛋白、E-钙粘着蛋白和FAK的表达均有一定调节作用，其中对后两种蛋白的调节受到LM的影响，在调节方式上存在一定差异。这一发现无疑会增加对肿瘤生长及浸润、转移的认识，同时也提示TGFβ1对细胞的刺激可引起多种分子表达的改变，其过程十分复杂。TGFβ1对细胞恶性表型的影响是诸多分子表达改变后共同作用的结果。
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参考文献
[1]Chakrabarty S, Reynolds S, Wang H, et al.Action of polypeptide growth factors in colon cancer:development of new therapeutic approaches. Frontiers in Bioscience, 1997,2(3)∶460-470.
[2]Zschiesche W, Schonborn I, Behrens J, et al.Expression of E-cadherin and catenins in invasive mammary carcinomas. Anticancer Res, 1997,17(1B)∶561-567.
[3]Chakrabarty S, Wang H. Emerging therapeutic targets for human colon cancinoma. Emerging Therapeutic Targets, 1998,2(2)∶195-211.
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[4]Chakrabarty S, Rajagopal S. PKC α controls the TGFβ1-mediated adhesion response of human colon carcinoma cells:two distinct branches of post PKC α signal pathway leads to induction of laminin, fibronectin and CEA by TGFβ1. Lab Invest, 1998,78(4)∶413-421.
[5]Hiscox S, Jiang WG. Expression of E-cadherin, alpha, beta and gamma-catenin in human colorectal cancer cells. Anticancer Res, 1997,17(2B)∶1349-1454.
, 百拇医药 [6]Lipschutz JH, Kissil JL. Expression of β-catenin and γ-catenin in epithelial tumor cell lines and characterization of a unique cell line. Cancer Lett, 1998,126(1)∶33-41.
[7]Frisch SM, Vuori K, Rouslahti E, et al.Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol, 1996,134(4)∶793-799.
[8]Owenslv XUL, Craven RJ. Overexpression of focal adhesion kinase (P125FAX) in invasive human tumours. Cancer Res, 1995,55(12)∶2752-2755.
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药