瘢痕疙瘩组织中ICAM－1、VEGF、c－fos表达的免疫组化检测
作者：阎国富 何威 刘荣卿
单位：阎国富 何威(第三军医大学附属新桥医院皮肤科，重庆，400037)；刘荣卿(第三军医大学附属西南医院皮肤科)
关键词：瘢痕疙瘩；ICAM-1；VEGF；c-fos；免疫组织化学
临床皮肤科杂志000304
摘要：采取免疫组化SP方法检测了细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、以及原癌基因(c-fos)在瘢痕疙瘩、普通瘢痕、正常皮肤组织中的表达。结果表明ICAM-1、VEGF、c-fos在瘢痕疙瘩中表达皆增强。ICAM-1主要表达在真皮浅层血管、浸润的炎细胞、成纤维细胞；VEGF、c-fos主要表达在表皮、真皮血管、皮肤附属器；部分瘢痕疙瘩标本成纤维细胞c-fos染色阳性，提示瘢痕疙瘩组织中血管内皮细胞处于一种激活状态，瘢痕疙瘩组织血管内皮细胞和成纤维细胞增殖异常。
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Expression of ICAM- 1, VEGF and c- fos proteins in keloid tissues
Yan Guofu He Wei Liu Rongqing
(Department of Dermatology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing,400037)
Abstract An immunohistochemical streptavidin peroxidase technique was performed for detecting the expression in situ of ICAM- 1, VEGF, c- fos proteins in keloids, normal scars and normal skin tissues for controls. The results showed that the expressions of ICAM- 1, VEGF and c- fos were up regulated in keloids. Increased staining was predominantly associated with the superficial vessels. In partial fibroblasts of keloid tissues the c- fos staining was positive. This suggested that the microvascular endothelial cells in keloids were activated. The endothelial cells had a higher proliferating activity.
, 百拇医药
Key words Keloid ICAM- 1 VEGF c- fos Immunohistochemistry
瘢痕疙瘩(keloid)是皮肤损伤后组织过度修复的结果，发病机理尚不太清楚，以胶原为主的细胞外基质过度积聚及成纤维细胞的过度增生是瘢痕疙瘩的组织病理学基础。真皮组织内浸润炎细胞、血管内皮细胞与成纤维细胞间的相互作用可能在瘢痕疙瘩组织过度增生中发挥一定的作用。本课题采用免疫组化的方法，对细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、原癌基因(c-fos)在瘢痕疙瘩组织中的表达进行了研究。
1 材料与方法
1.1 临床标本的来源与分组 瘢痕标本来源于本科瘢痕专病门诊和我院美容整形科，均在局麻下手术切取。正常皮肤来源于我院胸外科，均为胸前正中皮肤。分为3组，瘢痕疙瘩组(A)：正常瘢痕组(B)；正常皮肤组(C)。标本分成2份，一份立即置于液氮中保存，一份用10%的中性福尔马林固定，用于石蜡包埋切片。
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1.2 试剂与器材 免疫细胞化学SP试剂盒购于福州迈新生物工程公司。试验中所用一抗：ICAM-1鼠抗人单抗，VEGF鼠抗人单抗，c-fos羊抗人多抗皆购于中山生物工程公司。冰冻切片机为英国SANDONAS-620型。
1.3 操作程序 取新鲜皮肤组织作4μm厚的冰冻切片，风干后-20℃贮存，用时丙酮4℃固定10min，培养的细胞用4%多聚甲醛4℃固定过夜，采用SP免疫组化试剂盒染色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。免疫组化对照试验：用正常兔血清或0.01mol/LPBS代替一抗进行免疫组化染色，结果均为阴性。结果观察：阳性反应表现为胞浆或细胞核内呈现棕黄色颗粒。
2 结果
ICAM-1在瘢痕疙瘩组织真皮浅层有较多阳性细胞，从细胞形态分析可能主要是浸润的炎性细胞和微血管内皮细胞，以及部分成纤维细胞(图1)。正常瘢痕和正常皮肤内未见表达。VEGF在瘢痕疙瘩组织表皮、真皮微血管、部分皮肤附属器中有较强的阳性着色(图2、3)。正常瘢痕和正常皮肤的表皮有轻度着色。c-fos在瘢痕疙瘩组织表皮、真皮微血管、部分瘢痕疙瘩标本成纤维细胞c-fos染色阳性(图4)。正常皮肤皮脂腺、汗腺有弱阳性着色。
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图1 抗人ICAM-1McAb的SP免疫组化染色，表皮、真皮浅
层及增生的纤维结节周围有阳性染色(×100)
图2 抗人VEGFMcAB的SP免疫组化染色，表皮、真皮浅
层微血管阳性染色(×100)；
图3 图②高倍(×400)
图4 抗人c-fosMcAb的SP免疫组化染色，表皮、角质形成
细胞、真皮浅层微血管内皮细胞阳性染色(×400)
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3 讨论
粘附分子在炎症、伤口修复等多种生理病理过程中具有重要作用。ICAM-1为免疫球蛋白家族细胞粘附分子，分布广泛，除内皮细胞外，在巨噬/单核细胞、激活T淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、多种肿瘤细胞等均可表达。外伤、炎症刺激可促进内皮细胞表达ICAM-1。表达于血管内皮细胞上的ICAM-1参与淋巴细胞与血管内皮细胞间的相互作用，增强白细胞与血管内皮细胞间的粘附，从而促进炎症的发生与发展[1]。ICAM-1已经在其它真皮纤维化疾病，如系统性硬皮病皮损血管内皮细胞和成纤维细胞异常表达[2]。ICAM-1在瘢痕疙瘩组织中的过度表达，提示血管内皮细胞处于激活状态，瘢痕疙瘩组织中有持续的炎症反应存在，这种持续的炎症反应可能和组织的过度修复、瘢痕增生有关；VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，既能促使微血管内皮细胞增殖、迁移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物质进入细胞外基质中，形成纤维蛋白凝胶等，有利于新生血管和基质细胞生长。VEGF在很多正常成人组织的许多部位，常有低水平的表达，在多种恶性肿瘤组织及一些具有病理性新生血管的非恶性肿瘤组织有VEGF高表达，如在愈合过程的皮肤伤口、银屑病等疾病血管内皮细胞、角质形成细胞，真皮巨噬细胞[3]。瘢痕疙瘩在组织学上含有丰富的微血管，VEGF在瘢痕疙瘩组织表皮和真皮微血管、部分皮肤附属器中表达增强，说明瘢痕疙瘩组织中有新生血管形成。新生血管的形成为瘢痕疙瘩的增生提供了营养基础，在瘢痕疙瘩的形成、发展中可能起着相当重要的作用；瘢痕疙瘩表现为明显的瘤样增生，在瘢痕疙瘩形成的早期，可同时见到大量的成纤维细胞和微血管。后期表现为纤维化团块组织，细胞含量明显少[4]。问题是什么机制在调节瘢痕疙瘩细胞成分的发生和消亡?c-fos是一种原癌基因，在胚胎组织中表达较强，而正常成人组织中表达很弱。c-fos尚参与程序化细胞死亡的调控。c-fos的表达也与细胞分化有关，当静止细胞受到刺激进入细胞周期后，它的表达显著增强[5,6]。c-fos在瘢痕疙瘩组织表皮和真皮微血管、皮肤附属器中表达增强，成纤维细胞中表达增强，正说明了瘢痕组织中一些细胞成分的高增殖、高凋亡。
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国家自然科学基金资助课题(No39600154)
参 考 文 献
1，Dressler J, Bachmann L, Muller E. Enhanced expression of ICAM 1(CD54) in human skin wounds: diagnostic value in legal medicine. Inflamm Res, 1997,46(10):434～ 435
2，Gruschwitz MS, Vieth G. Up regulation of class Ⅱ major histocompatibility complex and intercellular adhesion molecule l ex
pression on scleroderma fibroblasts and endothelial cells by interferon gamma and tumor necrosis factor alpha in the early disease stage. Arthritis Rheum, 1997,40(3):540～ 550
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3，Weninger W, Uthman A, Pammer J, et al. Vascular endothelial growth factor production in normal epidermis and in benign and malignant epithelial skin tumors. Lab Invest, 1996, 75(5):647～ 657
4，Appleton I, Brown NJ, Willoughby DA. Apoptosis, necrosis and proliferation: possible implications in the etiology of keloids. Am J Pathol, 1996,149(5):1441～ 1447
5，Miosge N, Schneider W, Gotz W, et al. The oncoproteins c erb B2, c fos and the tumour suppressor protein p53 in human embryos and fetuses. Anat Embryol Berl. 1997, 195(4):345～ 352
6，Mils V, Piette J, Barette C, et al. The proto oncogene c fos increases the sensitivity of keratinocytes to apoptosis. Oncogene, 1997,14(13):1555～ 1561
(收 稿 1999- 08- 17 修 回 1999- 11- 22), 百拇医药
单位：阎国富 何威(第三军医大学附属新桥医院皮肤科，重庆，400037)；刘荣卿(第三军医大学附属西南医院皮肤科)
关键词：瘢痕疙瘩；ICAM-1；VEGF；c-fos；免疫组织化学
临床皮肤科杂志000304
摘要：采取免疫组化SP方法检测了细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、以及原癌基因(c-fos)在瘢痕疙瘩、普通瘢痕、正常皮肤组织中的表达。结果表明ICAM-1、VEGF、c-fos在瘢痕疙瘩中表达皆增强。ICAM-1主要表达在真皮浅层血管、浸润的炎细胞、成纤维细胞；VEGF、c-fos主要表达在表皮、真皮血管、皮肤附属器；部分瘢痕疙瘩标本成纤维细胞c-fos染色阳性，提示瘢痕疙瘩组织中血管内皮细胞处于一种激活状态，瘢痕疙瘩组织血管内皮细胞和成纤维细胞增殖异常。
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Expression of ICAM- 1, VEGF and c- fos proteins in keloid tissues
Yan Guofu He Wei Liu Rongqing
(Department of Dermatology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing,400037)
Abstract An immunohistochemical streptavidin peroxidase technique was performed for detecting the expression in situ of ICAM- 1, VEGF, c- fos proteins in keloids, normal scars and normal skin tissues for controls. The results showed that the expressions of ICAM- 1, VEGF and c- fos were up regulated in keloids. Increased staining was predominantly associated with the superficial vessels. In partial fibroblasts of keloid tissues the c- fos staining was positive. This suggested that the microvascular endothelial cells in keloids were activated. The endothelial cells had a higher proliferating activity.
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Key words Keloid ICAM- 1 VEGF c- fos Immunohistochemistry
瘢痕疙瘩(keloid)是皮肤损伤后组织过度修复的结果，发病机理尚不太清楚，以胶原为主的细胞外基质过度积聚及成纤维细胞的过度增生是瘢痕疙瘩的组织病理学基础。真皮组织内浸润炎细胞、血管内皮细胞与成纤维细胞间的相互作用可能在瘢痕疙瘩组织过度增生中发挥一定的作用。本课题采用免疫组化的方法，对细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、原癌基因(c-fos)在瘢痕疙瘩组织中的表达进行了研究。
1 材料与方法
1.1 临床标本的来源与分组 瘢痕标本来源于本科瘢痕专病门诊和我院美容整形科，均在局麻下手术切取。正常皮肤来源于我院胸外科，均为胸前正中皮肤。分为3组，瘢痕疙瘩组(A)：正常瘢痕组(B)；正常皮肤组(C)。标本分成2份，一份立即置于液氮中保存，一份用10%的中性福尔马林固定，用于石蜡包埋切片。
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1.2 试剂与器材 免疫细胞化学SP试剂盒购于福州迈新生物工程公司。试验中所用一抗：ICAM-1鼠抗人单抗，VEGF鼠抗人单抗，c-fos羊抗人多抗皆购于中山生物工程公司。冰冻切片机为英国SANDONAS-620型。
1.3 操作程序 取新鲜皮肤组织作4μm厚的冰冻切片，风干后-20℃贮存，用时丙酮4℃固定10min，培养的细胞用4%多聚甲醛4℃固定过夜，采用SP免疫组化试剂盒染色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。免疫组化对照试验：用正常兔血清或0.01mol/LPBS代替一抗进行免疫组化染色，结果均为阴性。结果观察：阳性反应表现为胞浆或细胞核内呈现棕黄色颗粒。
2 结果
ICAM-1在瘢痕疙瘩组织真皮浅层有较多阳性细胞，从细胞形态分析可能主要是浸润的炎性细胞和微血管内皮细胞，以及部分成纤维细胞(图1)。正常瘢痕和正常皮肤内未见表达。VEGF在瘢痕疙瘩组织表皮、真皮微血管、部分皮肤附属器中有较强的阳性着色(图2、3)。正常瘢痕和正常皮肤的表皮有轻度着色。c-fos在瘢痕疙瘩组织表皮、真皮微血管、部分瘢痕疙瘩标本成纤维细胞c-fos染色阳性(图4)。正常皮肤皮脂腺、汗腺有弱阳性着色。
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图1 抗人ICAM-1McAb的SP免疫组化染色，表皮、真皮浅
层及增生的纤维结节周围有阳性染色(×100)
图2 抗人VEGFMcAB的SP免疫组化染色，表皮、真皮浅
层微血管阳性染色(×100)；
图3 图②高倍(×400)
图4 抗人c-fosMcAb的SP免疫组化染色，表皮、角质形成
细胞、真皮浅层微血管内皮细胞阳性染色(×400)
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3 讨论
粘附分子在炎症、伤口修复等多种生理病理过程中具有重要作用。ICAM-1为免疫球蛋白家族细胞粘附分子，分布广泛，除内皮细胞外，在巨噬/单核细胞、激活T淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、多种肿瘤细胞等均可表达。外伤、炎症刺激可促进内皮细胞表达ICAM-1。表达于血管内皮细胞上的ICAM-1参与淋巴细胞与血管内皮细胞间的相互作用，增强白细胞与血管内皮细胞间的粘附，从而促进炎症的发生与发展[1]。ICAM-1已经在其它真皮纤维化疾病，如系统性硬皮病皮损血管内皮细胞和成纤维细胞异常表达[2]。ICAM-1在瘢痕疙瘩组织中的过度表达，提示血管内皮细胞处于激活状态，瘢痕疙瘩组织中有持续的炎症反应存在，这种持续的炎症反应可能和组织的过度修复、瘢痕增生有关；VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，既能促使微血管内皮细胞增殖、迁移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物质进入细胞外基质中，形成纤维蛋白凝胶等，有利于新生血管和基质细胞生长。VEGF在很多正常成人组织的许多部位，常有低水平的表达，在多种恶性肿瘤组织及一些具有病理性新生血管的非恶性肿瘤组织有VEGF高表达，如在愈合过程的皮肤伤口、银屑病等疾病血管内皮细胞、角质形成细胞，真皮巨噬细胞[3]。瘢痕疙瘩在组织学上含有丰富的微血管，VEGF在瘢痕疙瘩组织表皮和真皮微血管、部分皮肤附属器中表达增强，说明瘢痕疙瘩组织中有新生血管形成。新生血管的形成为瘢痕疙瘩的增生提供了营养基础，在瘢痕疙瘩的形成、发展中可能起着相当重要的作用；瘢痕疙瘩表现为明显的瘤样增生，在瘢痕疙瘩形成的早期，可同时见到大量的成纤维细胞和微血管。后期表现为纤维化团块组织，细胞含量明显少[4]。问题是什么机制在调节瘢痕疙瘩细胞成分的发生和消亡?c-fos是一种原癌基因，在胚胎组织中表达较强，而正常成人组织中表达很弱。c-fos尚参与程序化细胞死亡的调控。c-fos的表达也与细胞分化有关，当静止细胞受到刺激进入细胞周期后，它的表达显著增强[5,6]。c-fos在瘢痕疙瘩组织表皮和真皮微血管、皮肤附属器中表达增强，成纤维细胞中表达增强，正说明了瘢痕组织中一些细胞成分的高增殖、高凋亡。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助课题(No39600154)
参 考 文 献
1，Dressler J, Bachmann L, Muller E. Enhanced expression of ICAM 1(CD54) in human skin wounds: diagnostic value in legal medicine. Inflamm Res, 1997,46(10):434～ 435
2，Gruschwitz MS, Vieth G. Up regulation of class Ⅱ major histocompatibility complex and intercellular adhesion molecule l ex
pression on scleroderma fibroblasts and endothelial cells by interferon gamma and tumor necrosis factor alpha in the early disease stage. Arthritis Rheum, 1997,40(3):540～ 550
, http://www.100md.com
3，Weninger W, Uthman A, Pammer J, et al. Vascular endothelial growth factor production in normal epidermis and in benign and malignant epithelial skin tumors. Lab Invest, 1996, 75(5):647～ 657
4，Appleton I, Brown NJ, Willoughby DA. Apoptosis, necrosis and proliferation: possible implications in the etiology of keloids. Am J Pathol, 1996,149(5):1441～ 1447
5，Miosge N, Schneider W, Gotz W, et al. The oncoproteins c erb B2, c fos and the tumour suppressor protein p53 in human embryos and fetuses. Anat Embryol Berl. 1997, 195(4):345～ 352
6，Mils V, Piette J, Barette C, et al. The proto oncogene c fos increases the sensitivity of keratinocytes to apoptosis. Oncogene, 1997,14(13):1555～ 1561
(收 稿 1999- 08- 17 修 回 1999- 11- 22), 百拇医药