北方汉族HLA-DRB1、DQB1基因多态性的研究
作者：李伟 孙岩梅 单小燕 志宏 袁庆珍 葛静兰 张志欣
单位：李伟 孙岩梅 单小燕 志宏 袁庆珍 葛静兰 张志欣(100088北京红十字血液中心HLA实验室)
关键词：聚合酶链反应-序列特异性引物；HLA-DRB1、DQB1；基因频率
北方汉族HLA 【摘要】 目的 从基因水平了解北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性分布，获得更完整、更准确的遗传学数据。方法 应用PCR-SSP方法对107名北方汉族健康人进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因分型。结果 鉴定了14个DRB1等位基因，9个DQB1等位基因，包括了DR、DQ位点的全部血清学特异性。结论 提供了一套比较完整准确的DRB1、DQB1等位基因的基因频率和连锁不平衡参数。对群体遗传和疾病关联的研究具有重要的意义。
Polymorphism of HLA-DRB1, DQB1 in the Hans of north China
, http://www.100md.com
LI Wei*, SUN Yanmei, SHAN Xiaoyan,ZHI Hong, YUAN Qingzhen, GE Jinglian, ZHANG Zhixing
* HLA Laboratory, Beijing Red Cross Blood Center, Beijing,100088 P.R.China E-mail:lwhla @ 163.net
【Abstract】 Objective To understand polymorphism of HLA-DRB1,DQB1 in the Hans of North China and obtain more comprehensive and accurate data on genetics at DNA level.Methods Polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) were used to determine HLA-DRB1,DQB1 alleles in 107 unrelated healthy Han individuals of North China.Results The authors determined 14 DRB1，9 DQB1 alleles, which included not only the allele frequencies that corresponded to the gene frequencies of DR, DQ loci determined by other 9 cooperating labs but also the allele frequencies of DRB1*15, DRB1*16,DQB1*0301,DQB1*0302,DQB1*0303,DQB1*05,DQB1*0601,DQB1*0602 and DQB1*0604 that other serology labs did not report.Conclusion This study has obtained a more comprehensive and accurate data set of the normal allele frequencies and linkage disequilibria parameters of HLA-DRB1,DQB1 in the Hans of North China, which may be of significance in the studies on population genetics and disease association.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction-sequence specific primer HLA-DRB1,DQB1 Allele frequency
HLA是人类最复杂的遗传标记，具有显著的群体和地区间差异。由于血清学分型受血清质量和实验条件的限制，即使同一地区同一民族，几个实验室所做HLA-DR，DQ分型结果都具有显著性差异[1]。随着分子生物学的发展，DNA分型技术可以提供准确可靠的结果。我们应用PCR-SSP方法随机对北方107名汉族人进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因分型，以了解北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性的分布情况。
1 材料和方法
1.1 检测对象 北方地区107名健康无血缘关系个体。
1.2 主要试剂和仪器 DNA扩增仪(480型PE公司)，Taq DNA聚合酶dNTP，10×Buffer (Promerga产品)，电泳仪(北京六一仪器厂)。
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1.3 序列特异性引物 参照第12届国际HLA会议提供的DNA序列和参考文献[2，3]设计DRB1 14对引物，内参照1对；DQB1 9对，内参照1对。
1.4 基因组DNA的制备 5ml EDTA抗凝外周血离心，弃上层血浆后加入10ml红细胞液(RCLB 0，288mol/L NH4Cl，20mmol/L NH4HCO，10mmol/LEDTA)裂解红细胞3次，再加入3ml白细胞裂解液(WCLB 10mmol/L Tris-HCl,pH7.6,10mmol/L EDTA，pH8.0，50mmol/L NaCl)裂解白细胞，用200μl 10%SDS和1 500μg蛋白酶K消化蛋白质(42℃过夜)，用6mol/L NaCl沉淀杂蛋白(4℃静置20分钟)3 000r/min，30分钟离心，上清转入1支干净试管中，加入等体积冷异丙醇沉淀DNA，DNA用70%乙醇洗3次后溶于400μl TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)中。测OD值，调整DNA浓度至50～100ng。
, 百拇医药
1.5 特异性PCR扩增 50ngDNA，2.5μl 10×Buffer，2.5μl dNTP，1.5μlMgCl2，5μl引物，0.125μl(5U/μl)TaqDNA聚合酶，加蒸馏水到每管终体积25μl，加入液体石蜡覆盖液面，防止蒸发，扩增条件：94℃ 4分钟预变性，按94℃ 1分钟，65℃ 1分钟，72℃ 1分钟为一个循环进行扩增，共35个循环，再72℃延伸2分钟。
1.6 电泳检测 用20μl扩增产物加电泳载样液在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外检测仪看结果，鉴定其特异性。
2 结果
107个样品均可见内参照带和特异性扩增带，根据所见特异性扩增带是由哪对特异性引物所扩增，即可进行HLA-DRB1、DQB1的DNA分型(图1)。结果经过计算机进行生物学统计计算，HLA-DRB1、DQB1基因频率见表1、2，连锁不平衡参数见表3。
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表1 107名汉族个体的HLA-DRB1等位基因的基因频率与血清学结果比较
Tab 1 Allele frequencies of HLA-DRB1 locus in 107 North Chinese and compared with serological results
Genotyping
(基因分型)
Serological typing[4]
(血清学分型)
DRB1 allele
(等位基因)
Allele frequency
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(基因频率)
Antigen
(抗原)
Gene frequency
(基因频率)
DRB1*01
0.0442
DR1
0.0406
DRB1*03
0.0442
DR2
, 百拇医药
0.1859
DRB1*04
0.1508
DR3
0.0699
DRB1*07
0.1066
DR4
0.1569
DRB1*08
0.0595
DR5
0.1830
, 百拇医药
DRB1*09
0.1120
DR11
0.0434
DRB1*10
0.0194
DR12
0.0267
DRB1*11
0.0595
DR6
0.0368
, 百拇医药 DRB1*12
0.1120
DR13
0.0024
DRB1*13
0.0392
DR14
0.0134
DRB1*14a
0.0194
DR7
0.0699
DRB1*14b
, 百拇医药
0.0097
DR8
0.0686
DRB1*15
0.1796
DR9
0.1357
DRB1*16
0.0097
DR10
0.0121
表2 107名汉族个体的HLA-DQB1等位基因的基因频率
, 百拇医药
Tab 2 Allele frequencies of HLA-DQB1 locus in 107 North Chinese
DQB1 allele
(等位基因)
Allele frequency
(基因频率)
DQB1*0201
0.1284
DQB1*0301
0.4117
DQB1*0302
, 百拇医药 0.0646
DQB1*0303
0.1284
DQB1*04
0.0801
DQB1*05
0.1299
DQB1*0601
0.2404
DQB1*0602
0.1175
DQB1*0604
, http://www.100md.com
0.0392
表3 107名汉族个体DRB1-DQB1连锁不平衡参数和T值
Tab 3 Linkage disequilibria parameter and T of DRB1-DQB1 in 107 North Chinese
Haplotype
(单倍型)
Linkage disequilibria
parameter(×10-4)
(连锁不平衡参数)(×10-4)
T
, 百拇医药
(T值)
DRB1*01-DQB1*05
388
3.21
DRB1*03-DQB1*0201
386
3.21
DRB1*04-DQB1*0301
375
2.07
DRB1*04-DQB1*0302
492
, 百拇医药
3.69
DRB1*04-DQB1*04
509
3.67
DRB1*07-DQB1*0201
706
4.53
DRB1*09-DQB1*0303
977
5.68
DRB1*10-DQB1*05
170
, 百拇医药
2.06
DRB1*12-DQB1*0301
659
5.36
DRB1*13-DQB1*0601
234
2.41
DRB1*13-DQB1*0604
377
3.01
DRB1*14a-DQB1*05
170
, http://www.100md.com
2.06
DRB1*15-DQB1*0601
1107
6.51
DRB1*15-DQB1*0602
964
5.83
图1 HLA-DRB1、DQB1的分型结果 特异性是DRB1*15(205bp)，DRB1*12(110bp),DQB1*0301(225bp)，DQB1*0601(240bp)
, 百拇医药
Fig 1 Typing of HLA-DRB1, DQB1,specificities were DRB1*15(205bp),DRB1*12(110bp),DQB1*0301(225bp),DQB1*0601(240bp)
3 讨论
血清学分型鉴定其表型，PCR-SSP直接在DNA水平上进行DRB1、DQB1等位基因分型，是一种简便、快速、准确的方法。DR1-DR18血清学特异性主要是DRB1决定的，DQ血清学特异性主要由DQB1决定的。我们根据DRB1和DQB1第2外显子的核苷酸序列，设计DRB1 14对引物，DQB1 9对引物，可以鉴定出DR、DQ位点全部血清学特异性。北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性的研究，以往都用血清学方法，由于分型血清来源各异，单特异性抗血清很难获得，以及B淋巴细胞的纯度等都影响分型结果的准确性，数据也不完整。有文章报道Ⅱ类血清学误差率达22%[5]。我们采用PCR-SSP方法对107名北方汉族个体做了DRB1、DQB1等位基因分型，提供了一套比较完整、准确的DRB1、DQB1等位基因的基因频率和连锁不平衡参数。与北方9个实验室所做北方汉族人群DR基因频率(表1)比较[4]，血清学的DR12、DR13对应DRB1*12、DRB1*13差异显著，血清学频率报道的偏低。DR15、DR16血清学也没报道，只给了DR2的基因频率，我们还报道了DRB1*14的两个亚型DRB1*14a和DRB1*14b的基因频率。DQ位点，在我国血清学一般只鉴定DQ1-DQ4，我们提供了血清学DQ2、DQ4、DQ5、DQ6、DQ7、DQ8、DQ9对应DQB1*02、DQB1*04、DQB1*05、DQB1*06、DQB1*0301、DQB1*0302和DQB1*0303的基因频率，同时首次报道DQB1*06的3个亚型的频率。研究DQB1链时，在北方汉族人群中检测到DQB1*0604，而在湖南汉族人群中未检测到[6]。DRB1和DQB1等位基因单倍型研究中发现：DRB1*15-DQB1*0601、DRB1*15-DQB1*0602、DRB1*09-DQB1*0303、DRB1*12-DQB1*0301是较强连锁不平衡的单倍型，这为群体的迁移提供了有价值的资料，对人类遗传和疾病关联的研究有着重要的意义。
, 百拇医药
参考文献
[1] 李哲先，贾宝祥，耳秀江.关于我国HLA-DR，DQ位点抗原多态性血清学研究的分析.中国免疫学杂志，1994，10(5)∶317-319.
[2] Bodmer JG, Marsh SGE, Parham P,et al.HLA class Ⅱ region nucleotide sequences. Tissue Antigenes, 1995,46(1)∶1-18.
[3] Olerup O, Aldemer A, Fogdell A. HLA-DQB1 and DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hour. Tissue Antigenes, 1993, 41(1)∶119-134.
, http://www.100md.com
[4] 叶根耀，孔繁华，安家滨，等.我国北方地区430名汉族人群的HLA联合调查.中国免疫学杂志，1988，9(6)∶420-421.
[5] Scherer S, Mytilineos J, Dunckley H, et al.Analysis of rare HLA-DRB1-DQB1-BQA1 haplotypes in kidney donors and recipients. Hum Immunol, 1995,44 Suppl Ⅰ∶89.
[6] 张修武，郭实士.应用PCR-SSO方法分析湖南籍汉族人HLA-DQ位点DNA多态性.中国免疫学杂志，1993，9(1)∶18-21.
(收稿：1998-04-18 修回：1998-12-23), http://www.100md.com
单位：李伟 孙岩梅 单小燕 志宏 袁庆珍 葛静兰 张志欣(100088北京红十字血液中心HLA实验室)
关键词：聚合酶链反应-序列特异性引物；HLA-DRB1、DQB1；基因频率
北方汉族HLA 【摘要】 目的 从基因水平了解北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性分布，获得更完整、更准确的遗传学数据。方法 应用PCR-SSP方法对107名北方汉族健康人进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因分型。结果 鉴定了14个DRB1等位基因，9个DQB1等位基因，包括了DR、DQ位点的全部血清学特异性。结论 提供了一套比较完整准确的DRB1、DQB1等位基因的基因频率和连锁不平衡参数。对群体遗传和疾病关联的研究具有重要的意义。
Polymorphism of HLA-DRB1, DQB1 in the Hans of north China
, http://www.100md.com
LI Wei*, SUN Yanmei, SHAN Xiaoyan,ZHI Hong, YUAN Qingzhen, GE Jinglian, ZHANG Zhixing
* HLA Laboratory, Beijing Red Cross Blood Center, Beijing,100088 P.R.China E-mail:lwhla @ 163.net
【Abstract】 Objective To understand polymorphism of HLA-DRB1,DQB1 in the Hans of North China and obtain more comprehensive and accurate data on genetics at DNA level.Methods Polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) were used to determine HLA-DRB1,DQB1 alleles in 107 unrelated healthy Han individuals of North China.Results The authors determined 14 DRB1，9 DQB1 alleles, which included not only the allele frequencies that corresponded to the gene frequencies of DR, DQ loci determined by other 9 cooperating labs but also the allele frequencies of DRB1*15, DRB1*16,DQB1*0301,DQB1*0302,DQB1*0303,DQB1*05,DQB1*0601,DQB1*0602 and DQB1*0604 that other serology labs did not report.Conclusion This study has obtained a more comprehensive and accurate data set of the normal allele frequencies and linkage disequilibria parameters of HLA-DRB1,DQB1 in the Hans of North China, which may be of significance in the studies on population genetics and disease association.
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【Key words】 Polymerase chain reaction-sequence specific primer HLA-DRB1,DQB1 Allele frequency
HLA是人类最复杂的遗传标记，具有显著的群体和地区间差异。由于血清学分型受血清质量和实验条件的限制，即使同一地区同一民族，几个实验室所做HLA-DR，DQ分型结果都具有显著性差异[1]。随着分子生物学的发展，DNA分型技术可以提供准确可靠的结果。我们应用PCR-SSP方法随机对北方107名汉族人进行了HLA-DRB1、DQB1等位基因分型，以了解北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性的分布情况。
1 材料和方法
1.1 检测对象 北方地区107名健康无血缘关系个体。
1.2 主要试剂和仪器 DNA扩增仪(480型PE公司)，Taq DNA聚合酶dNTP，10×Buffer (Promerga产品)，电泳仪(北京六一仪器厂)。
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1.3 序列特异性引物 参照第12届国际HLA会议提供的DNA序列和参考文献[2，3]设计DRB1 14对引物，内参照1对；DQB1 9对，内参照1对。
1.4 基因组DNA的制备 5ml EDTA抗凝外周血离心，弃上层血浆后加入10ml红细胞液(RCLB 0，288mol/L NH4Cl，20mmol/L NH4HCO，10mmol/LEDTA)裂解红细胞3次，再加入3ml白细胞裂解液(WCLB 10mmol/L Tris-HCl,pH7.6,10mmol/L EDTA，pH8.0，50mmol/L NaCl)裂解白细胞，用200μl 10%SDS和1 500μg蛋白酶K消化蛋白质(42℃过夜)，用6mol/L NaCl沉淀杂蛋白(4℃静置20分钟)3 000r/min，30分钟离心，上清转入1支干净试管中，加入等体积冷异丙醇沉淀DNA，DNA用70%乙醇洗3次后溶于400μl TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)中。测OD值，调整DNA浓度至50～100ng。
, 百拇医药
1.5 特异性PCR扩增 50ngDNA，2.5μl 10×Buffer，2.5μl dNTP，1.5μlMgCl2，5μl引物，0.125μl(5U/μl)TaqDNA聚合酶，加蒸馏水到每管终体积25μl，加入液体石蜡覆盖液面，防止蒸发，扩增条件：94℃ 4分钟预变性，按94℃ 1分钟，65℃ 1分钟，72℃ 1分钟为一个循环进行扩增，共35个循环，再72℃延伸2分钟。
1.6 电泳检测 用20μl扩增产物加电泳载样液在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外检测仪看结果，鉴定其特异性。
2 结果
107个样品均可见内参照带和特异性扩增带，根据所见特异性扩增带是由哪对特异性引物所扩增，即可进行HLA-DRB1、DQB1的DNA分型(图1)。结果经过计算机进行生物学统计计算，HLA-DRB1、DQB1基因频率见表1、2，连锁不平衡参数见表3。
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表1 107名汉族个体的HLA-DRB1等位基因的基因频率与血清学结果比较
Tab 1 Allele frequencies of HLA-DRB1 locus in 107 North Chinese and compared with serological results
Genotyping
(基因分型)
Serological typing[4]
(血清学分型)
DRB1 allele
(等位基因)
Allele frequency
, http://www.100md.com
(基因频率)
Antigen
(抗原)
Gene frequency
(基因频率)
DRB1*01
0.0442
DR1
0.0406
DRB1*03
0.0442
DR2
, 百拇医药
0.1859
DRB1*04
0.1508
DR3
0.0699
DRB1*07
0.1066
DR4
0.1569
DRB1*08
0.0595
DR5
0.1830
, 百拇医药
DRB1*09
0.1120
DR11
0.0434
DRB1*10
0.0194
DR12
0.0267
DRB1*11
0.0595
DR6
0.0368
, 百拇医药 DRB1*12
0.1120
DR13
0.0024
DRB1*13
0.0392
DR14
0.0134
DRB1*14a
0.0194
DR7
0.0699
DRB1*14b
, 百拇医药
0.0097
DR8
0.0686
DRB1*15
0.1796
DR9
0.1357
DRB1*16
0.0097
DR10
0.0121
表2 107名汉族个体的HLA-DQB1等位基因的基因频率
, 百拇医药
Tab 2 Allele frequencies of HLA-DQB1 locus in 107 North Chinese
DQB1 allele
(等位基因)
Allele frequency
(基因频率)
DQB1*0201
0.1284
DQB1*0301
0.4117
DQB1*0302
, 百拇医药 0.0646
DQB1*0303
0.1284
DQB1*04
0.0801
DQB1*05
0.1299
DQB1*0601
0.2404
DQB1*0602
0.1175
DQB1*0604
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0.0392
表3 107名汉族个体DRB1-DQB1连锁不平衡参数和T值
Tab 3 Linkage disequilibria parameter and T of DRB1-DQB1 in 107 North Chinese
Haplotype
(单倍型)
Linkage disequilibria
parameter(×10-4)
(连锁不平衡参数)(×10-4)
T
, 百拇医药
(T值)
DRB1*01-DQB1*05
388
3.21
DRB1*03-DQB1*0201
386
3.21
DRB1*04-DQB1*0301
375
2.07
DRB1*04-DQB1*0302
492
, 百拇医药
3.69
DRB1*04-DQB1*04
509
3.67
DRB1*07-DQB1*0201
706
4.53
DRB1*09-DQB1*0303
977
5.68
DRB1*10-DQB1*05
170
, 百拇医药
2.06
DRB1*12-DQB1*0301
659
5.36
DRB1*13-DQB1*0601
234
2.41
DRB1*13-DQB1*0604
377
3.01
DRB1*14a-DQB1*05
170
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2.06
DRB1*15-DQB1*0601
1107
6.51
DRB1*15-DQB1*0602
964
5.83
图1 HLA-DRB1、DQB1的分型结果 特异性是DRB1*15(205bp)，DRB1*12(110bp),DQB1*0301(225bp)，DQB1*0601(240bp)
, 百拇医药
Fig 1 Typing of HLA-DRB1, DQB1,specificities were DRB1*15(205bp),DRB1*12(110bp),DQB1*0301(225bp),DQB1*0601(240bp)
3 讨论
血清学分型鉴定其表型，PCR-SSP直接在DNA水平上进行DRB1、DQB1等位基因分型，是一种简便、快速、准确的方法。DR1-DR18血清学特异性主要是DRB1决定的，DQ血清学特异性主要由DQB1决定的。我们根据DRB1和DQB1第2外显子的核苷酸序列，设计DRB1 14对引物，DQB1 9对引物，可以鉴定出DR、DQ位点全部血清学特异性。北方汉族HLA-DRB1、DQB1多态性的研究，以往都用血清学方法，由于分型血清来源各异，单特异性抗血清很难获得，以及B淋巴细胞的纯度等都影响分型结果的准确性，数据也不完整。有文章报道Ⅱ类血清学误差率达22%[5]。我们采用PCR-SSP方法对107名北方汉族个体做了DRB1、DQB1等位基因分型，提供了一套比较完整、准确的DRB1、DQB1等位基因的基因频率和连锁不平衡参数。与北方9个实验室所做北方汉族人群DR基因频率(表1)比较[4]，血清学的DR12、DR13对应DRB1*12、DRB1*13差异显著，血清学频率报道的偏低。DR15、DR16血清学也没报道，只给了DR2的基因频率，我们还报道了DRB1*14的两个亚型DRB1*14a和DRB1*14b的基因频率。DQ位点，在我国血清学一般只鉴定DQ1-DQ4，我们提供了血清学DQ2、DQ4、DQ5、DQ6、DQ7、DQ8、DQ9对应DQB1*02、DQB1*04、DQB1*05、DQB1*06、DQB1*0301、DQB1*0302和DQB1*0303的基因频率，同时首次报道DQB1*06的3个亚型的频率。研究DQB1链时，在北方汉族人群中检测到DQB1*0604，而在湖南汉族人群中未检测到[6]。DRB1和DQB1等位基因单倍型研究中发现：DRB1*15-DQB1*0601、DRB1*15-DQB1*0602、DRB1*09-DQB1*0303、DRB1*12-DQB1*0301是较强连锁不平衡的单倍型，这为群体的迁移提供了有价值的资料，对人类遗传和疾病关联的研究有着重要的意义。
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参考文献
[1] 李哲先，贾宝祥，耳秀江.关于我国HLA-DR，DQ位点抗原多态性血清学研究的分析.中国免疫学杂志，1994，10(5)∶317-319.
[2] Bodmer JG, Marsh SGE, Parham P,et al.HLA class Ⅱ region nucleotide sequences. Tissue Antigenes, 1995,46(1)∶1-18.
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(收稿：1998-04-18 修回：1998-12-23), http://www.100md.com