不同人群载脂蛋白E基因多态性分布状态的研究
作者：刘华欣 曹丽春 周涌 李柏文
单位：第四军医大学吉林军医学院 吉林 132013
关键词：载脂蛋白E；基因型；基因频率；人种
中国医师杂志000908【摘要】为研究不同人群载脂蛋白(Apo)E基因多态性的分布特征，采用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，先扩增出ApoE基因第4外显子内的227bp片段，继以限制性内切酶CfoI酶解消化，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后银染显带判定基因型。结果正常汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等基因频率，ε2等位基因频率分别是8.0%、12.9%、11.3%和12.6%，ε3分别是85.7%、78.6%、79.1%和79.7%，ε4分别是6.3%、8.6%、9.7%和7.9%。说明汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等位基因频率与亚洲的日本和新加坡人群结果相近，但与欧美国家人群相比差别较大。
, 百拇医药
[中图分类号]R446.1 [文献标识码]A
[文章编号]1008-1372(2000)09-0530-03
Apolipoprotein E Polymorphish in Different Populations
LIU Hua-xin,CAO Li-chun,ZHOU Yong,et al.
(The Fourth Military Medical University,Jilin Military Medical College,Jilin,132013,China)
【Abstract】In this paper,the distribution of Apolipoprotein E polymorphism in different populations was studied.The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) technique was used to amplify 227 base-pair DNA fragments in the fourth exon of ApoE gene and to digest them with restriction endonuclease enzyme CfoI.Then electrophoresis on 8% polyacrylamide gel to identify the products.Their genotypes were determined subsequently by silver staining,and allele frequencies were calculated.Results indicated that in healthy individuals of Han,Chao,Hui and Mongolian ethnical group,the allelic frequencies of AopE，ε2 were 8.0%，12.9%，11.3% and 12.6% respectively,ε3 were 85.7%，78.6%，79.1% and 79.7% respectively,ε4 was 6.3%，8.6%，9.7% and 7.9% respectively.We concluded that the distribution of apolipoprotein E gene polymorphism in the Han,Chao,Hui and Mongolian nationalities is similar to that in Asian Japan and Singapore population,but it is largely different from those of Europe and America populations.
, 百拇医药
Key Words Apolipoprotein E;Genotype;Gene frequency;Race
近年来研究发现ApoE基因多态性与心血管病、血管性痴呆(VD)及老年性痴呆(AD)密切相关[1]。本文旨在研究和比较不同人群ApoE基因多态性的分布特征，应用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了正常汉族人群、朝族、回族和蒙古族ApoE基因型和等位基因频率，并初步探讨了各种不同人群ApoE基因多态性的分布差异和特征。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择汉族、朝族、回族和蒙古族健康个体，年龄30～78岁，所选研究对象均为无亲缘关系的三代同一民族个体，经相关检查排除心脑血管疾病及肝、肾和内分泌等影响脂类代谢的疾病。
1.2 主要试剂 CfoI内切酶为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶及4种脱氧核糖核酸(dNTP)为Promaga产品，引物上游序列为5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，下游序列为5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3’，由上海细胞所合成。其余试剂均为分析纯。
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1.3 研究方法
1.3.1 PCR扩增及内切酶CfoI消化：提取样本外周血基因组DNA作为模板，然后PCR扩增在20μl反应体系中进行，其中包括基因组DNA 200ng，引物各10pmol，4×dNTP各100μmol，氯化镁2.5mol/L，二甲基亚砜10%(V/V)，Taq DNA聚合酶IU，并加入1滴矿物油覆盖反应物。然后进行95℃35s变性，60℃ 35s退火，70℃ 60s延伸，共计30个循环，最后72℃延伸10min。
限制性酶切反应也在20μl体系中进行，其中包括PCR反应产物12μl，Cfol内切酶8U(10U/μl)，轻轻混匀后置于37℃消化过夜，消化产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(交联度29∶1)。
1.3.2 银染：电泳后将凝胶用蒸馏水冲洗2～3次，再置于含10%含醇和0.5%的冰乙酸液中固定10min。然后用蒸溜水冲洗1～2次，用0.2%硝酸银染色8min。再以蒸溜水冲洗凝胶数次，以显色液还原银颗粒，直至条带清晰，并根据电泳图谱进行ApoE基因分型。
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1.4 统计方法 基因频率采用基因计算法计算。基因型或等位基因频率的比较采用u检验。
2 结果
中国不同人群ApoE基因多态性分布状态见表1。不同人群ApoE等位基因频率比较见表2。
表1中国不同人群ApoE基因多态性分布状态 (%) 人群
例数
ApoE基因型频率
ApoE等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
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ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
汉族
206
0
13.6
2.4
78.8
, 百拇医药
8.2
1.0
8.0
85.7
6.3
朝族
36
0
20.0
5.7
62.9
11.4
0
, 百拇医药
12.9
78.6
8.6
回族
31
0
19.4
3.2
61.3
16.1
0
11.3
79.1
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9.7
蒙古族
32
0
18.8
6.3
65.6
9.4
0
12.6
79.7
7.9
表2不同人群ApoE等位基因频率比较 人群
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例数
等位基因频率(%)
ε2
ε3
ε4
瑞典[2]
407
7.8
71.9
20.3**
芬兰[3]
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1577
3.9
76.7
19.4**
法国[4]
434
12.3
75.1
12.6*
新西兰[5]
426
12.0
, 百拇医药
72.0
16.0**
苏格兰[6]
400
8.0
77.0
15.0**
德国[7]
1000
7.8
78.3
13.9*
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美国[8]
182
10.0
73.0
16.0**
新加坡[9]
188
12.2
78.2
9.6
日本[9]
319
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8.1
84.9
6.7
汉族
206
8.0
85.7
6.3
朝族
35
12.9
78.6
8.6
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回族
31
11.3
79.1
9.7
蒙古族
32
12.6
79.7
7.9
注：与中国汉族人群相比*P<0.05，**P<0.05
从表1中可见中国不同人群ApoE基因多态性分布差异无显著性(P>0.05)。从表2中可见汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等位基因频率与亚洲的日本和新加坡人群结果相近[9～10]，但与美国国家人群相比差别较大，尤其是中国汉族人群ε4等位基因频率显著低于欧美地区人群[5～8]。
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3 讨论
人类ApoE基因位于第19号染色体的长臂(19q13)上，由4个外显子和3个内含子组成。该基因呈现多态性，由三种常见的等位基因：ε2、ε3和ε4编码产生三种ApoE异构体E2、E3和E4。其多态性的分子基础源于第112位和158位单个氨基酸的替换。E2的这两个位置均为半胱氨酸(Cys)，E4的这两个位置均为精氨酸(Arg)，而E3的112位是Cys，158位是Arg。由于三种等位基因为共显性，因此由三种纯合子和三种杂合子组成的六种基因型即可表达产生六种对应的表型，即E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4。
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对以往国内外文献的统计结果表明[3～4]，ApoE诸等位基因中ε3等位基因频率最高，是任一群体中最常见的等位基因，而ε2和ε4则相对较少，所以ε3被认为是“野生型”。而ε2和ε4是由它变异得来，并且ε4等位基因频率在亚洲地区低于欧美地区。我们通过PCR-RFLP方法，所用引物特异扩增出227bp的DNA片段，经CfoI酶切后产生2～4条特异条带，易于判断分型。同时，对所选定的汉族人群的研究结果表明，所得结果支持了上述文献报道，并认为在亚洲地区ε2等位基因频率高于ε4，但目前影响ApoE等位基因频率在不同人群间分布差异的原因仍不十分清楚，可能与不同人群的基因结构及应用的检测方法的差别有关。
我们在研究中发现我国汉族人群中ε4等位基因频率显著低于欧美地区人群。鄢盛恺[10]等研究发现ε4等位基因与血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和ApoB水平增高呈显著正相关，而上述三项则均被认为是冠心病的易患因素，因而有人推测ε4等位基因与冠心病密切相关，认为不同种族与地域冠心病患病率不同可能与ApoE基因多态性有关。因此，能否认为我国汉族人群ε4等位基因频率较低是造成我国汉族人群冠心病的患病率大大低于欧美地区人群的主要原因，同时冠心病与ε4等位基因的相关程度如何，仍有待于进一步实验探讨。
, 百拇医药
参考文献
1，Siest G,Pillot T,Regis-Bailly A,et al.Apolipoprotein E:An important gene and protein to follow in laboratory mediceine.Clin Chem 1995；41(8)：1068～1086
2，Eggertsen G,Tegelman R,Ericsson S,et al.Apolipoprotein E polymorphism in a health Swedish population:variation of allele frequency with age and relation to serum lipid concentration.Clin Chem 1993；39：2125～2129
3，Lehtimaki T,Pirttila T,Mehta PD,et al.Apolipoprotein E(apoE) polymorphism and its influence on apoE concentrations in the cerebrospinal fluid in Finnish patients with Alzheimer's disease.Hum Genet 1995；85：39～42
, 百拇医药
4，Davignon J,Gregg RE,Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis.Arteriosclerosis 1988；8(1)：1
5，Wardell MR,Suckling PA,Janus ED.Genetic variation in human apolipoprotein E.J Lipid Res 1982；23：1174～1182
6，Cumming AM,Robertson FW.Polymorphism at the apolipoprotein E locus in relation to risk of coronary disease.Clin Genet 1984；25：310～313
7，Menzel HJ,Kladetsky RG,Assmann G.Apolipoprotein E Polymorphism and coronary artery disease.Arteriosclerosis 1983；3：310～315
, 百拇医药
8，Strittmatter WJ,Saunders AM,Schmechel D,et al.Apolipoprotein E:high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type a allele in late-onset familial Alzheimer disease.Proc Acad Sci USA 1993；90：1977～1981
9，Utermann G.Apolipoprotein E polymorphism in health and disease.Am Heart J 1987：113：433
10，鄢盛恺，周新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋白(α)水平的影响.基础医学与临床 1998；18(1)：48～51
[收稿日期：1999-11-15], http://www.100md.com
单位：第四军医大学吉林军医学院 吉林 132013
关键词：载脂蛋白E；基因型；基因频率；人种
中国医师杂志000908【摘要】为研究不同人群载脂蛋白(Apo)E基因多态性的分布特征，采用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，先扩增出ApoE基因第4外显子内的227bp片段，继以限制性内切酶CfoI酶解消化，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后银染显带判定基因型。结果正常汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等基因频率，ε2等位基因频率分别是8.0%、12.9%、11.3%和12.6%，ε3分别是85.7%、78.6%、79.1%和79.7%，ε4分别是6.3%、8.6%、9.7%和7.9%。说明汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等位基因频率与亚洲的日本和新加坡人群结果相近，但与欧美国家人群相比差别较大。
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[中图分类号]R446.1 [文献标识码]A
[文章编号]1008-1372(2000)09-0530-03
Apolipoprotein E Polymorphish in Different Populations
LIU Hua-xin,CAO Li-chun,ZHOU Yong,et al.
(The Fourth Military Medical University,Jilin Military Medical College,Jilin,132013,China)
【Abstract】In this paper,the distribution of Apolipoprotein E polymorphism in different populations was studied.The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) technique was used to amplify 227 base-pair DNA fragments in the fourth exon of ApoE gene and to digest them with restriction endonuclease enzyme CfoI.Then electrophoresis on 8% polyacrylamide gel to identify the products.Their genotypes were determined subsequently by silver staining,and allele frequencies were calculated.Results indicated that in healthy individuals of Han,Chao,Hui and Mongolian ethnical group,the allelic frequencies of AopE，ε2 were 8.0%，12.9%，11.3% and 12.6% respectively,ε3 were 85.7%，78.6%，79.1% and 79.7% respectively,ε4 was 6.3%，8.6%，9.7% and 7.9% respectively.We concluded that the distribution of apolipoprotein E gene polymorphism in the Han,Chao,Hui and Mongolian nationalities is similar to that in Asian Japan and Singapore population,but it is largely different from those of Europe and America populations.
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Key Words Apolipoprotein E;Genotype;Gene frequency;Race
近年来研究发现ApoE基因多态性与心血管病、血管性痴呆(VD)及老年性痴呆(AD)密切相关[1]。本文旨在研究和比较不同人群ApoE基因多态性的分布特征，应用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了正常汉族人群、朝族、回族和蒙古族ApoE基因型和等位基因频率，并初步探讨了各种不同人群ApoE基因多态性的分布差异和特征。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择汉族、朝族、回族和蒙古族健康个体，年龄30～78岁，所选研究对象均为无亲缘关系的三代同一民族个体，经相关检查排除心脑血管疾病及肝、肾和内分泌等影响脂类代谢的疾病。
1.2 主要试剂 CfoI内切酶为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶及4种脱氧核糖核酸(dNTP)为Promaga产品，引物上游序列为5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，下游序列为5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3’，由上海细胞所合成。其余试剂均为分析纯。
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1.3 研究方法
1.3.1 PCR扩增及内切酶CfoI消化：提取样本外周血基因组DNA作为模板，然后PCR扩增在20μl反应体系中进行，其中包括基因组DNA 200ng，引物各10pmol，4×dNTP各100μmol，氯化镁2.5mol/L，二甲基亚砜10%(V/V)，Taq DNA聚合酶IU，并加入1滴矿物油覆盖反应物。然后进行95℃35s变性，60℃ 35s退火，70℃ 60s延伸，共计30个循环，最后72℃延伸10min。
限制性酶切反应也在20μl体系中进行，其中包括PCR反应产物12μl，Cfol内切酶8U(10U/μl)，轻轻混匀后置于37℃消化过夜，消化产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(交联度29∶1)。
1.3.2 银染：电泳后将凝胶用蒸馏水冲洗2～3次，再置于含10%含醇和0.5%的冰乙酸液中固定10min。然后用蒸溜水冲洗1～2次，用0.2%硝酸银染色8min。再以蒸溜水冲洗凝胶数次，以显色液还原银颗粒，直至条带清晰，并根据电泳图谱进行ApoE基因分型。
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1.4 统计方法 基因频率采用基因计算法计算。基因型或等位基因频率的比较采用u检验。
2 结果
中国不同人群ApoE基因多态性分布状态见表1。不同人群ApoE等位基因频率比较见表2。
表1中国不同人群ApoE基因多态性分布状态 (%) 人群
例数
ApoE基因型频率
ApoE等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
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ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
汉族
206
0
13.6
2.4
78.8
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8.2
1.0
8.0
85.7
6.3
朝族
36
0
20.0
5.7
62.9
11.4
0
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12.9
78.6
8.6
回族
31
0
19.4
3.2
61.3
16.1
0
11.3
79.1
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9.7
蒙古族
32
0
18.8
6.3
65.6
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12.6
79.7
7.9
表2不同人群ApoE等位基因频率比较 人群
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例数
等位基因频率(%)
ε2
ε3
ε4
瑞典[2]
407
7.8
71.9
20.3**
芬兰[3]
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1577
3.9
76.7
19.4**
法国[4]
434
12.3
75.1
12.6*
新西兰[5]
426
12.0
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72.0
16.0**
苏格兰[6]
400
8.0
77.0
15.0**
德国[7]
1000
7.8
78.3
13.9*
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美国[8]
182
10.0
73.0
16.0**
新加坡[9]
188
12.2
78.2
9.6
日本[9]
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8.1
84.9
6.7
汉族
206
8.0
85.7
6.3
朝族
35
12.9
78.6
8.6
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回族
31
11.3
79.1
9.7
蒙古族
32
12.6
79.7
7.9
注：与中国汉族人群相比*P<0.05，**P<0.05
从表1中可见中国不同人群ApoE基因多态性分布差异无显著性(P>0.05)。从表2中可见汉族、朝族、回族和蒙古族ApoE等位基因频率与亚洲的日本和新加坡人群结果相近[9～10]，但与美国国家人群相比差别较大，尤其是中国汉族人群ε4等位基因频率显著低于欧美地区人群[5～8]。
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3 讨论
人类ApoE基因位于第19号染色体的长臂(19q13)上，由4个外显子和3个内含子组成。该基因呈现多态性，由三种常见的等位基因：ε2、ε3和ε4编码产生三种ApoE异构体E2、E3和E4。其多态性的分子基础源于第112位和158位单个氨基酸的替换。E2的这两个位置均为半胱氨酸(Cys)，E4的这两个位置均为精氨酸(Arg)，而E3的112位是Cys，158位是Arg。由于三种等位基因为共显性，因此由三种纯合子和三种杂合子组成的六种基因型即可表达产生六种对应的表型，即E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4。
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对以往国内外文献的统计结果表明[3～4]，ApoE诸等位基因中ε3等位基因频率最高，是任一群体中最常见的等位基因，而ε2和ε4则相对较少，所以ε3被认为是“野生型”。而ε2和ε4是由它变异得来，并且ε4等位基因频率在亚洲地区低于欧美地区。我们通过PCR-RFLP方法，所用引物特异扩增出227bp的DNA片段，经CfoI酶切后产生2～4条特异条带，易于判断分型。同时，对所选定的汉族人群的研究结果表明，所得结果支持了上述文献报道，并认为在亚洲地区ε2等位基因频率高于ε4，但目前影响ApoE等位基因频率在不同人群间分布差异的原因仍不十分清楚，可能与不同人群的基因结构及应用的检测方法的差别有关。
我们在研究中发现我国汉族人群中ε4等位基因频率显著低于欧美地区人群。鄢盛恺[10]等研究发现ε4等位基因与血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和ApoB水平增高呈显著正相关，而上述三项则均被认为是冠心病的易患因素，因而有人推测ε4等位基因与冠心病密切相关，认为不同种族与地域冠心病患病率不同可能与ApoE基因多态性有关。因此，能否认为我国汉族人群ε4等位基因频率较低是造成我国汉族人群冠心病的患病率大大低于欧美地区人群的主要原因，同时冠心病与ε4等位基因的相关程度如何，仍有待于进一步实验探讨。
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参考文献
1，Siest G,Pillot T,Regis-Bailly A,et al.Apolipoprotein E:An important gene and protein to follow in laboratory mediceine.Clin Chem 1995；41(8)：1068～1086
2，Eggertsen G,Tegelman R,Ericsson S,et al.Apolipoprotein E polymorphism in a health Swedish population:variation of allele frequency with age and relation to serum lipid concentration.Clin Chem 1993；39：2125～2129
3，Lehtimaki T,Pirttila T,Mehta PD,et al.Apolipoprotein E(apoE) polymorphism and its influence on apoE concentrations in the cerebrospinal fluid in Finnish patients with Alzheimer's disease.Hum Genet 1995；85：39～42
, 百拇医药
4，Davignon J,Gregg RE,Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis.Arteriosclerosis 1988；8(1)：1
5，Wardell MR,Suckling PA,Janus ED.Genetic variation in human apolipoprotein E.J Lipid Res 1982；23：1174～1182
6，Cumming AM,Robertson FW.Polymorphism at the apolipoprotein E locus in relation to risk of coronary disease.Clin Genet 1984；25：310～313
7，Menzel HJ,Kladetsky RG,Assmann G.Apolipoprotein E Polymorphism and coronary artery disease.Arteriosclerosis 1983；3：310～315
, 百拇医药
8，Strittmatter WJ,Saunders AM,Schmechel D,et al.Apolipoprotein E:high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type a allele in late-onset familial Alzheimer disease.Proc Acad Sci USA 1993；90：1977～1981
9，Utermann G.Apolipoprotein E polymorphism in health and disease.Am Heart J 1987：113：433
10，鄢盛恺，周新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋白(α)水平的影响.基础医学与临床 1998；18(1)：48～51
[收稿日期：1999-11-15], http://www.100md.com