肠缺血再灌注时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡与肺损伤
作者：尹晓林 金丽娟
单位：尹晓林(第一军医大学病理生理学教研室，广东 广州 510515)；金丽娟(第一军医大学病理生理学教研室，广东 广州 510515)
关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞；凋亡；肺损伤
第一军医大学学报000409 摘要：目的 观察肠缺血再灌注中肺损伤与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法 Wistar大鼠，肠系膜上动脉夹闭后松夹造成肠缺血再灌注。不同时间点活杀动物，测肺通透指数、肺泡灌洗液(BALF)和血浆中NO、IL-2含量，分离肺泡Ⅱ型上皮细胞，观察凋亡率。结果与结论 肠缺血再灌注可能引起肺损伤；肠缺血再灌注后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率上升，再灌注30 min 达高峰；缺血再灌注后血、BALF中NO、IL-2增加；肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率与肺通透指数显著相关，BALF中IL-2水平与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著相关。
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中图分类号：R329.25 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0339-03
Apoptosis of alveolar typeⅡepithelial cells in lung injury after intestinal ischemia-reperfusion
YIN Xiao-lin, JIN Li-juan
(Department of Pathophysiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the role of apoptosis of alveolar type II epithelial cells in lung injury after intestinal ischemia-reperfusion and the mechanism. Methods Superior mesenteric artery in Wistar rat was occluded and declamped to produce intestinal ischemia-reperfusion. All of the animals were killed at different time points, and the alveolar leak index, nitric oxide(NO) and interlukin-2(IL-2) concentrations in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined. Alveolar type II epithelial cells were isolated and apoptosis rate was determined. Results and conclusions It was found that intestinal ischemia-reperfusion might result in lung injury: apoptosis rate of alveolar type II epithelial cells increased, peaked at 30 min of reperfusion; NO and IL-2 concentrations in serum and BALF increased after intestinal ischemia-reperfusion. Apoptosis rate of alveolar type II epithelial cells is significantly positively related to alveolar lung leak index, and the concentration of IL-2 in BALF to apoptosis rate and alveolar leak index.
, 百拇医药
Key words: alveolar typeⅡepithelial cells; apoptosis; lung injury
肠道缺血再灌注损伤在烧伤、大面积创伤中均有发生，并在其后的多器官功能不全综合征(MODS)发生中起着启动作用。动物实验表明，单纯肠缺血再灌注损伤可引起肝、肾、肺损伤[1]。肠缺血再灌注引起的肺损伤表现为广泛的肺泡毛细血管屏障损伤。肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡膜的重要组成成分，分泌表面活性物质以维持肺泡形状，主动转运水钠以维持肺泡干燥。本实验以肠缺血再灌注复制肺损伤模型，以研究肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在肺损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组
健康雄性成年清洁级Wistar大鼠25只，体质量220～250 g，随机分为：假手术(Control组)、肠缺血2 h (I2 h组)、肠缺血2 h再灌注15 min(R15 min组)、30 min(R30 min组)、60 min(R60 min组)共5组，每组5只。1%戊巴比妥钠0.03 ml/kg.b.w.背部皮下注射麻醉。胸腹部去毛、消毒，无菌条件下开腹，夹闭肠系膜上动脉。根据肠系膜的动脉停止搏动确定肠缺血，2 h后松夹再灌注，肠系膜动脉恢复搏动。不同时间点处死动物，处死前5 min予肝素(400 U/kg.b.w.)抗凝，腹腔静脉抽血，5 ml生理盐水肺泡灌注，获取肺泡灌洗液(BALF)，离心取血浆、BALF上清，-20℃冷冻。
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1.2 肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离
动物在不同时间点处死后，开胸，以90 ml生理盐水自左心室缓慢均匀用力灌注，同时以注射器自气管插管向肺内注入空气，反复扩张肺3次。游离双肺及气管，置于超净台上，以37 ℃预热过的消化液(0.1%弹性蛋白酶，0.05%胰蛋白酶，0.01% DNase I，0.2%胶原酶IV，溶于D-Hanks液中)10 ml灌肺。此后每隔5 min补充5 ml，消化20 min后，将肺组织移入烧杯中，去气管、支气管和淋巴结，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 大小，转入锥形瓶中，加入含20%小牛血清的DMEM终止消化，摇晃震荡1 min，依次以150目、400目钢网过滤，Hanks液洗3次，调整细胞浓度至 3×106/ml，接种于培养瓶中，置37 ℃、5% CO2 培养箱培养3～3.5 h，收集悬浮细胞，用Hanks液洗3次。改良巴氏染色法示细胞纯度为75%～84%。
1.3 细胞凋亡的流式细胞仪检测
, 百拇医药
1×106个细胞，离心弃上清，加入100 μl标记液(Annexin-V原液20 μl，Boehringer Mannheim公司，10 mg/ml PI 20μl，加入孵化液1 ml，孵化液配置：10 mmol/L HEPES、140 mmol/L NaCl、15 mmol/L CaCl2溶于1 000 ml蒸馏水)重悬，避光保存10～15 min，加入0.4 ml孵化液，400目钢网过滤，上流式细胞仪分析。
1.4 NO含量测定
通过测定NO2来确定。取血浆或BALF 0.6 ml，加入4 mol/L过氯酸0.1 ml，混匀，200 r/min离心 15 min。取0.5 ml上清加入管内，加入Rivanol 200μl，12 mol/L盐酸400μl，加蒸馏水至总体积为2 ml，避光保存2 min。在752型分光光度计(波长520 nm)比色得吸光度值，代入回归方程中计算结果。
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1.5 IL-2含量测定
采用酶联免疫吸附法测定。IL-2一抗、二抗和IL-2标准品均由本校分子免疫研究所提供。
1.6 肺泡灌洗液沉渣细胞分类计数
采用改良巴氏染色法。
1.7 肺通透指数测定
紫外分光光度法测定血浆蛋白和BALF蛋白含量，肺通透指数=BALF蛋白浓度/血浆蛋白浓度。
1.8 统计分析
采用单因素方差分析和相关分析，两组间比较用SNK法，所有统计均采用SPSS统计软件。
2 结果
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2.1 肠缺血再灌注引起肺损伤
单纯肠缺血并不引起肺通透指数变化，肠缺血再灌15 min即肺通透指数增高，并随再灌注时间延长而进一步增高(表1)。
表1 大鼠肠缺血再灌注时肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的变化(n=5，
±s)
Tab.1 Alveolar leak index and apoptosis rate of alveolar type II epithelial
cells in intestinal ischemia and reperfusion rats (n=5, Mean±SD)
Group
, 百拇医药
Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Alveolar leak index
(×102)
3.23±0.47
3.90±0.34
5.03±0.67*△
5.73±1.12*△
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6.111.00*△
Apoptosis rate (%)
0.34±0.38
2.28±2.83
10.36±3.75*
27.14±10.44*△
8.4±5.67
*P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group; I2h: Ischemia for 2 h; R15 min: reperfusion for 15 min after intestinal ischemia for 2 h
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2.2 肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的变化
假手术组很少有肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，肠缺血再灌注后凋亡率增加，再灌注30 min达高峰，其后有所下降(表1)。
2.3 BALF及血浆中NO水平变化
肠缺血再灌注15 min，血浆中NO含量即升高，其后进一步升高，再灌注60 min时略有下降。BALF中NO含量也有升高，但不如血浆水平高，且升高时间短，迅速回到原来水平(表2)。
表2 大鼠肠缺血再灌注时BALF、血浆中NO2-水平变化(μg/ml，n=5，±s)
Tab.1 NO2- levels in BALF or serum in intestinal ischemia
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and reperfusion rats (μg/ml, n=5, Mean±SD)
Group
Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Serum
0.92±0.16
1.22±0.33
1.45±0.31*
, 百拇医药
2.42±0.17*△
1.77±0.31*△
BALF
0.61±0.15
0.84±0.19
1.06±0.17*
0.87±0.16
0.86±0.13
BALF: Bronchoalveolar lavage fluid; *P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group
, 百拇医药
2.4 BALF及血浆IL-2含量变化
血浆及BALF中IL-2含量变化基本一致。在肠缺血再灌注后，血浆与BALF中IL-2含量均升高，且随再灌注时间延长而增加。对BALF IL-2含量/血浆IL-2含量比值的统计分析表明，有显著差异，肠缺血再灌注后比值上升(表3)。
表3 大鼠肠缺血再灌注时BALF、血浆中IL-2水平变化(pg/ml，n=5，±s)
Tab. 3 IL-2 levels in BALF or serum in intestinal ischemia
and reperfusion rats (pg/ml, n=5, Mean±SD)
, 百拇医药 Group
Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Serum
686±107
897±84
1057±112*
1913±418*△
1872±223*△
, 百拇医药
BALF
541±108
871±195
1309±277*
2411±374*△
2622±289*△
BALF/serum
0.813±0.244
0.991±0.294
1.257±0.354
1.286±0.192
, 百拇医药
1.425±0.282*
*P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group
2.5 BALF沉渣细胞分类计数
BALF细胞浓度随肠缺血再灌注时间延长而增加，说明肠缺血再灌注时有肺泡内细胞浸润和细胞脱落。分类计数表明，中性粒细胞、淋巴细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞均有增加。
2.6 相关分析
相关分析表明，肺通透指数与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率呈极显著相关(r=0.667, P<0.001)；凋亡率、肺通透指数与BALF IL-2含量显著相关(前者r=0.5972, P=0.02；后者r=0.7430, P<0.001)。尽管BALF NO含量也有上升，但相关分析表明，它与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率并无显著相关(P>0.05)。
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3 讨论
细胞凋亡是一种与坏死截然不同的自主性死亡方式。细胞凋亡时，胞浆、染色质浓缩，DNA降解为180 bp不同整数倍片段，出现凋亡小体，细胞膜完整，内容物不溢出，因而不引起炎症反应[2]。盲肠结扎穿孔后的免疫抑制与巨噬细胞、淋巴细胞的大量凋亡有关[3]，中性粒细胞的延迟凋亡则导致全身性炎症反应综合征的放大[4]。实质细胞凋亡的作用则尚无定论。凋亡细胞不引起炎症反应，因而可能是机体清除衰老和不适应细胞的一种保护机制。另一方面，大量细胞凋亡无疑会影响脏器功能。
肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在内毒素血症、脓毒症、IL-2引起的肺损伤中均有报道[5～7]，对其发生机制则尚未作过探讨。以肠缺血再灌注复制肺损伤，发现单纯肠缺血不引起肺损伤，再灌注时迅速出现肺损伤，并随再灌注时间延长而加剧。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了肺损伤的发生，因为：①肺通透指数增高，表明有肺泡水肿、肺泡上皮损伤；②BALF沉渣细胞计数显示肺泡Ⅱ型上皮细胞百分数和总数均增加，提示肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤、脱落；③分离肺泡Ⅱ型上皮细胞，流式细胞仪提示有细胞凋亡；④相关分析表明，凋亡率与肺通透指数呈显著正相关。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡时，可能通过以下机制引起肺损伤：①表面活性物质分泌减少；②主动转运能力受损，加重肺水肿；③凋亡时细胞粘附性能下降，未脱落细胞也可发生卷曲，损伤肺泡膜完整性；④分裂增殖、修补损伤的能力下降。
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IL-2引起的肺损伤中存在肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡[7]。IL-2也是早期免疫调节的重要因子，可能诱导多种细胞因子表达，ARDS患者早期即有肺泡灌洗液IL-2和血IL-2升高[8]。在肠缺血再灌注期间IL-2含量的升高，可见肺是IL-2的来源之一。相关分析表明，IL-2可能参与肠缺血再灌注时的肺损伤和肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。IL-2可以活化T淋巴细胞，活化的CD8+T淋巴细胞表面表达FasL，后者作用于Fas(+)的靶细胞诱导凋亡[9]，而肺泡Ⅱ型上皮细胞能够诱导表达Fas抗原[10、11]，是CD8+T淋巴细胞的靶细胞之一。在BALF细胞分类计数中，也确实发现淋巴细胞的聚集。因此，肠缺血再灌注中IL-2可能通过Fas途径诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞调亡。
NO是介导细胞凋亡的因素之一。虽然在肠缺血再灌注期间肺泡灌洗液中NO有升高，然而相关分析表明NO含量与肺通透指数和肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率并无显著相关。因此，我们的实验尚未确定NO是否参与了肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和肺损伤。
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作者简介：尹晓林，男，湖南东口人，1998年毕业于第一军医大学，硕士，主治医师，现工作单位为解放军第158医院内一科，电话：0772-2682918
参考文献：
[1] Oldham KT, Guea KS, Magee JC, et al. The systemic consequences of intestinal ischemia /reperfusion injury[J]. J Vasc Surg, 1993, 18:137.
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[3] Cobb JP, Hotchkiss RS, Kart IE, et al. Mechanism of cell injury and death[J]. Br J Anesthesia, 1996, 77(2):3-10.
[4] Ayala A, Urbanich MA, Herdon CD, et al. Is sepsis-induced apoptosis associated with macrophage dysfunction?[J]. J Trauma, 1996, 40(4):568-73.
[5] Jimenez MF, Watson RW, Parodo J, et al. Dysregulated expression of neutrophil apoptosis in the systemic inflammatory response syndrome[J]. Arch Surg, 1997, 132(12):1253-70.
, 百拇医药
[6] Ayala A, Herdon CD, Lehman DL, et al. Differential induction of apoptosis in lymphoid tissues during sepsis: variation in onset, frequency, and the nature of the mediators[J]. Blood, 1996, 87(10): 4261-75.
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, 百拇医药
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[11] Wen LP, Madani K, Fahri JA, et al. Dexamathasone inhibits lung epithelial cell apoptosis induced by IFN-γand Fas[J]. Am J Physiol, 1997, 273(5 Pt 1):L921-9.
收稿日期：1999-10-21, 百拇医药
单位：尹晓林(第一军医大学病理生理学教研室，广东 广州 510515)；金丽娟(第一军医大学病理生理学教研室，广东 广州 510515)
关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞；凋亡；肺损伤
第一军医大学学报000409 摘要：目的 观察肠缺血再灌注中肺损伤与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法 Wistar大鼠，肠系膜上动脉夹闭后松夹造成肠缺血再灌注。不同时间点活杀动物，测肺通透指数、肺泡灌洗液(BALF)和血浆中NO、IL-2含量，分离肺泡Ⅱ型上皮细胞，观察凋亡率。结果与结论 肠缺血再灌注可能引起肺损伤；肠缺血再灌注后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率上升，再灌注30 min 达高峰；缺血再灌注后血、BALF中NO、IL-2增加；肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率与肺通透指数显著相关，BALF中IL-2水平与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著相关。
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中图分类号：R329.25 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0339-03
Apoptosis of alveolar typeⅡepithelial cells in lung injury after intestinal ischemia-reperfusion
YIN Xiao-lin, JIN Li-juan
(Department of Pathophysiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To investigate the role of apoptosis of alveolar type II epithelial cells in lung injury after intestinal ischemia-reperfusion and the mechanism. Methods Superior mesenteric artery in Wistar rat was occluded and declamped to produce intestinal ischemia-reperfusion. All of the animals were killed at different time points, and the alveolar leak index, nitric oxide(NO) and interlukin-2(IL-2) concentrations in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined. Alveolar type II epithelial cells were isolated and apoptosis rate was determined. Results and conclusions It was found that intestinal ischemia-reperfusion might result in lung injury: apoptosis rate of alveolar type II epithelial cells increased, peaked at 30 min of reperfusion; NO and IL-2 concentrations in serum and BALF increased after intestinal ischemia-reperfusion. Apoptosis rate of alveolar type II epithelial cells is significantly positively related to alveolar lung leak index, and the concentration of IL-2 in BALF to apoptosis rate and alveolar leak index.
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Key words: alveolar typeⅡepithelial cells; apoptosis; lung injury
肠道缺血再灌注损伤在烧伤、大面积创伤中均有发生，并在其后的多器官功能不全综合征(MODS)发生中起着启动作用。动物实验表明，单纯肠缺血再灌注损伤可引起肝、肾、肺损伤[1]。肠缺血再灌注引起的肺损伤表现为广泛的肺泡毛细血管屏障损伤。肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡膜的重要组成成分，分泌表面活性物质以维持肺泡形状，主动转运水钠以维持肺泡干燥。本实验以肠缺血再灌注复制肺损伤模型，以研究肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在肺损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型与分组
健康雄性成年清洁级Wistar大鼠25只，体质量220～250 g，随机分为：假手术(Control组)、肠缺血2 h (I2 h组)、肠缺血2 h再灌注15 min(R15 min组)、30 min(R30 min组)、60 min(R60 min组)共5组，每组5只。1%戊巴比妥钠0.03 ml/kg.b.w.背部皮下注射麻醉。胸腹部去毛、消毒，无菌条件下开腹，夹闭肠系膜上动脉。根据肠系膜的动脉停止搏动确定肠缺血，2 h后松夹再灌注，肠系膜动脉恢复搏动。不同时间点处死动物，处死前5 min予肝素(400 U/kg.b.w.)抗凝，腹腔静脉抽血，5 ml生理盐水肺泡灌注，获取肺泡灌洗液(BALF)，离心取血浆、BALF上清，-20℃冷冻。
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1.2 肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离
动物在不同时间点处死后，开胸，以90 ml生理盐水自左心室缓慢均匀用力灌注，同时以注射器自气管插管向肺内注入空气，反复扩张肺3次。游离双肺及气管，置于超净台上，以37 ℃预热过的消化液(0.1%弹性蛋白酶，0.05%胰蛋白酶，0.01% DNase I，0.2%胶原酶IV，溶于D-Hanks液中)10 ml灌肺。此后每隔5 min补充5 ml，消化20 min后，将肺组织移入烧杯中，去气管、支气管和淋巴结，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 大小，转入锥形瓶中，加入含20%小牛血清的DMEM终止消化，摇晃震荡1 min，依次以150目、400目钢网过滤，Hanks液洗3次，调整细胞浓度至 3×106/ml，接种于培养瓶中，置37 ℃、5% CO2 培养箱培养3～3.5 h，收集悬浮细胞，用Hanks液洗3次。改良巴氏染色法示细胞纯度为75%～84%。
1.3 细胞凋亡的流式细胞仪检测
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1×106个细胞，离心弃上清，加入100 μl标记液(Annexin-V原液20 μl，Boehringer Mannheim公司，10 mg/ml PI 20μl，加入孵化液1 ml，孵化液配置：10 mmol/L HEPES、140 mmol/L NaCl、15 mmol/L CaCl2溶于1 000 ml蒸馏水)重悬，避光保存10～15 min，加入0.4 ml孵化液，400目钢网过滤，上流式细胞仪分析。
1.4 NO含量测定
通过测定NO2来确定。取血浆或BALF 0.6 ml，加入4 mol/L过氯酸0.1 ml，混匀，200 r/min离心 15 min。取0.5 ml上清加入管内，加入Rivanol 200μl，12 mol/L盐酸400μl，加蒸馏水至总体积为2 ml，避光保存2 min。在752型分光光度计(波长520 nm)比色得吸光度值，代入回归方程中计算结果。
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1.5 IL-2含量测定
采用酶联免疫吸附法测定。IL-2一抗、二抗和IL-2标准品均由本校分子免疫研究所提供。
1.6 肺泡灌洗液沉渣细胞分类计数
采用改良巴氏染色法。
1.7 肺通透指数测定
紫外分光光度法测定血浆蛋白和BALF蛋白含量，肺通透指数=BALF蛋白浓度/血浆蛋白浓度。
1.8 统计分析
采用单因素方差分析和相关分析，两组间比较用SNK法，所有统计均采用SPSS统计软件。
2 结果
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2.1 肠缺血再灌注引起肺损伤
单纯肠缺血并不引起肺通透指数变化，肠缺血再灌15 min即肺通透指数增高，并随再灌注时间延长而进一步增高(表1)。
表1 大鼠肠缺血再灌注时肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的变化(n=5，
±s)Tab.1 Alveolar leak index and apoptosis rate of alveolar type II epithelial
cells in intestinal ischemia and reperfusion rats (n=5, Mean±SD)
Group
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Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Alveolar leak index
(×102)
3.23±0.47
3.90±0.34
5.03±0.67*△
5.73±1.12*△
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6.111.00*△
Apoptosis rate (%)
0.34±0.38
2.28±2.83
10.36±3.75*
27.14±10.44*△
8.4±5.67
*P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group; I2h: Ischemia for 2 h; R15 min: reperfusion for 15 min after intestinal ischemia for 2 h
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2.2 肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率的变化
假手术组很少有肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，肠缺血再灌注后凋亡率增加，再灌注30 min达高峰，其后有所下降(表1)。
2.3 BALF及血浆中NO水平变化
肠缺血再灌注15 min，血浆中NO含量即升高，其后进一步升高，再灌注60 min时略有下降。BALF中NO含量也有升高，但不如血浆水平高，且升高时间短，迅速回到原来水平(表2)。
表2 大鼠肠缺血再灌注时BALF、血浆中NO2-水平变化(μg/ml，n=5，
±s)Tab.1 NO2- levels in BALF or serum in intestinal ischemia
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and reperfusion rats (μg/ml, n=5, Mean±SD)
Group
Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Serum
0.92±0.16
1.22±0.33
1.45±0.31*
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2.42±0.17*△
1.77±0.31*△
BALF
0.61±0.15
0.84±0.19
1.06±0.17*
0.87±0.16
0.86±0.13
BALF: Bronchoalveolar lavage fluid; *P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group
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2.4 BALF及血浆IL-2含量变化
血浆及BALF中IL-2含量变化基本一致。在肠缺血再灌注后，血浆与BALF中IL-2含量均升高，且随再灌注时间延长而增加。对BALF IL-2含量/血浆IL-2含量比值的统计分析表明，有显著差异，肠缺血再灌注后比值上升(表3)。
表3 大鼠肠缺血再灌注时BALF、血浆中IL-2水平变化(pg/ml，n=5，
±s)Tab. 3 IL-2 levels in BALF or serum in intestinal ischemia
and reperfusion rats (pg/ml, n=5, Mean±SD)
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Control
I2 h
R15 min
R30 min
R60 min
Serum
686±107
897±84
1057±112*
1913±418*△
1872±223*△
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BALF
541±108
871±195
1309±277*
2411±374*△
2622±289*△
BALF/serum
0.813±0.244
0.991±0.294
1.257±0.354
1.286±0.192
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1.425±0.282*
*P<0.05 vs control group, △P<0.05 vs I2 h group
2.5 BALF沉渣细胞分类计数
BALF细胞浓度随肠缺血再灌注时间延长而增加，说明肠缺血再灌注时有肺泡内细胞浸润和细胞脱落。分类计数表明，中性粒细胞、淋巴细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞均有增加。
2.6 相关分析
相关分析表明，肺通透指数与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率呈极显著相关(r=0.667, P<0.001)；凋亡率、肺通透指数与BALF IL-2含量显著相关(前者r=0.5972, P=0.02；后者r=0.7430, P<0.001)。尽管BALF NO含量也有上升，但相关分析表明，它与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率并无显著相关(P>0.05)。
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3 讨论
细胞凋亡是一种与坏死截然不同的自主性死亡方式。细胞凋亡时，胞浆、染色质浓缩，DNA降解为180 bp不同整数倍片段，出现凋亡小体，细胞膜完整，内容物不溢出，因而不引起炎症反应[2]。盲肠结扎穿孔后的免疫抑制与巨噬细胞、淋巴细胞的大量凋亡有关[3]，中性粒细胞的延迟凋亡则导致全身性炎症反应综合征的放大[4]。实质细胞凋亡的作用则尚无定论。凋亡细胞不引起炎症反应，因而可能是机体清除衰老和不适应细胞的一种保护机制。另一方面，大量细胞凋亡无疑会影响脏器功能。
肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在内毒素血症、脓毒症、IL-2引起的肺损伤中均有报道[5～7]，对其发生机制则尚未作过探讨。以肠缺血再灌注复制肺损伤，发现单纯肠缺血不引起肺损伤，再灌注时迅速出现肺损伤，并随再灌注时间延长而加剧。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了肺损伤的发生，因为：①肺通透指数增高，表明有肺泡水肿、肺泡上皮损伤；②BALF沉渣细胞计数显示肺泡Ⅱ型上皮细胞百分数和总数均增加，提示肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤、脱落；③分离肺泡Ⅱ型上皮细胞，流式细胞仪提示有细胞凋亡；④相关分析表明，凋亡率与肺通透指数呈显著正相关。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡时，可能通过以下机制引起肺损伤：①表面活性物质分泌减少；②主动转运能力受损，加重肺水肿；③凋亡时细胞粘附性能下降，未脱落细胞也可发生卷曲，损伤肺泡膜完整性；④分裂增殖、修补损伤的能力下降。
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IL-2引起的肺损伤中存在肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡[7]。IL-2也是早期免疫调节的重要因子，可能诱导多种细胞因子表达，ARDS患者早期即有肺泡灌洗液IL-2和血IL-2升高[8]。在肠缺血再灌注期间IL-2含量的升高，可见肺是IL-2的来源之一。相关分析表明，IL-2可能参与肠缺血再灌注时的肺损伤和肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。IL-2可以活化T淋巴细胞，活化的CD8+T淋巴细胞表面表达FasL，后者作用于Fas(+)的靶细胞诱导凋亡[9]，而肺泡Ⅱ型上皮细胞能够诱导表达Fas抗原[10、11]，是CD8+T淋巴细胞的靶细胞之一。在BALF细胞分类计数中，也确实发现淋巴细胞的聚集。因此，肠缺血再灌注中IL-2可能通过Fas途径诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞调亡。
NO是介导细胞凋亡的因素之一。虽然在肠缺血再灌注期间肺泡灌洗液中NO有升高，然而相关分析表明NO含量与肺通透指数和肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率并无显著相关。因此，我们的实验尚未确定NO是否参与了肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和肺损伤。
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作者简介：尹晓林，男，湖南东口人，1998年毕业于第一军医大学，硕士，主治医师，现工作单位为解放军第158医院内一科，电话：0772-2682918
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收稿日期：1999-10-21, 百拇医药