大鼠脑干面口部运动神经元与5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末间的突触联系*
作者：李云庆 王智明 施际武
单位：第四军医大学解剖学教研室、梁琚脑研究中心，西安 710032
关键词：脑干面口部运动核；5-羟色胺；P物质；亮氨酸-脑啡肽；γ-氨基丁酸；甘氨酸；突触联系；大鼠
解剖学报/980404 摘 要 为了观察5-羟色胺(5-HT)样、P物质(SP)样、亮氨酸-脑啡肽(L-ENK)样、γ-氨基丁酸(GABA)样和甘氨酸(Gly)样阳性终末与脑干面口部运动核(三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核)间的突触联系，用HRP逆行追踪与免疫组织化学染色相结合的双标技术，在电镜下对5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标面口部运动神经元间的突触联系进行了观察。5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末在脑干面口部运动核内呈均匀分布，没有区域特异性。将HRP注入面口部肌肉或相应的周围神经后，HRP逆标神经元见于脑干运动核不同部位内支配相应肌肉的运动神经元。5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末主要与HRP逆标运动神经元的树突形成非对称性的轴-树突触；GABA样和Gly样阳性终末则主要与HRP逆标运动神经元的树突形成对称性的轴-树突触；偶见上述阳性轴突终末与HRP逆标运动神经元的胞体形成轴-体突触。结果提示：主要来自脑干运动前神经元的5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末及GABA样和Gly样阳性终末可能分别对脑干运动神经元发挥兴奋性或抑制性调控作用。
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近年来的机能学和形态学研究结果都证实，大脑运动皮质发出的皮质脑干束先终止于脑干运动前神经元(premotor neuron),脑干运动前神经元再投射至脑干面口部运动核，对其内的运动神经元发挥调控作用[1～3]。脑干运动前神经元是运动调控系统的中间神经元，主要分布于臂旁核簇、三叉上核、中缝核簇和脑干网状结构[4～6]，部分向脑干的三叉神经运动核(Vm)、面神经核(Ⅶ)和舌下神经核(Ⅹ Ⅱ)投射的运动前神经元含5-羟色胺(5-HT)、P物质(SP)、脑啡肽(ENK)、γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)[7～11]。Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内的运动神经元支配咀嚼肌、表情肌、舌肌等，与咀嚼、表情、吞咽、发音等复杂的精细活动有关，这些核团内均有密集的5-HT样、SP样、ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，5-HT和SP及GABA和Gly分别对中枢神经系统的运动神经元具有兴奋性及抑制性效应[12～15]。但大鼠运动前神经元的5-HT样、SP样、ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与面口部运动神经元间的突触联系，尚缺乏系统研究。本研究用HRP逆行追踪与免疫组织化学染色相结合的双标技术对5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与面口部运动核内支配不同面口部肌的运动神经元间的突触联系进行了观察。
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材料和方法
雄性SD大鼠30只，体重200～250g，分成3组，每组10只。戊巴比妥钠经腹腔麻醉(40mg/kg)后，将8～10μl的3%HRP水溶液用10μl微量注射器缓慢注入第1组大鼠的一侧咬肌(4只)、咬肌神经(2只)或二腹肌前腹(4只)，第2组大鼠的一侧口周围肌(3只)、二腹肌后腹(3只)或出茎乳孔后的面神经干(4只)，第3组大鼠的舌内肌(4只)、颏舌肌(3只)或茎突舌肌(3只)。注射完毕后，用蜡膜将肌肉或神经与周围组织隔离。动物存活3d后，用戊巴比妥钠深麻、开胸，经心脏插管至升主动脉，先以100ml的0.9%盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)灌注固定1h以上，灌注完毕立即取脑，将脑干切下并置入上述新鲜固定液中后固定6h(4℃)，再移入30%蔗糖中过夜(4℃)。振动切片机横切脑干，片厚50μm，切片隔5张取1张，分6套收集。全部动物的第1～5套切片先用钨酸钠作稳定剂的TMB呈色方法显示三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内的HRP逆标神经元，并用硫酸镍胺加强HRP的反应产物；再用ABC法进行免疫组织化学染色，以显示三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，具体步骤如下：5套切片分别入兔抗5-HT血清(1∶3 000,INC)、兔抗SP血清(1∶3 000,INC)、兔抗L-ENK血清(1∶3 000)，INC)、兔抗GABA血清(1∶1 000,Chemicon)或兔抗Gly血清(1∶1 000,Chemicon)孵育24h,次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200,Vector)孵育1h，最后用DAB呈色。经上述反应的切片入1%锇酸后固定，梯度酒精脱水(饱和醋酸铀染色与70%酒精脱水同时进行，15min×2次)，Epon812平板包埋，选择三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内有5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样或Gly样阳性终末及HRP逆标神经元的部位超薄切片、铅染、Philips-100电镜观察。将第6套切片行Nissl染色，以便对照观察结果。
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结 果
光镜观察时可见，将HRP注入咬肌和咬肌神经或二腹肌前腹后，HRP逆标运动神经元分别见于Vm的背外侧部或腹内侧部；将HRP注入口周围肌、二腹肌后腹或茎乳孔外的面神经干后，HRP逆标运动神经元分别见于Ⅶ的外侧部、内侧部或Ⅶ的各部；将HRP注入舌内肌、颏舌肌或茎突舌肌后，散在分布的HRP逆标运动神经元见于Ⅹ Ⅱ的各部，这些神经元的分布区互相重叠，没有相对集中区。HRP逆标运动神经元均为大、中型多极神经元。在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内，未见5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样免疫组织化学染色阳性神经元胞体，但均可见密集的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，在脑干的脑神经核中，脑干运动核内的上述阳性终末的密度最高，这些阳性终末常呈蓝状包绕在HRP逆标运动神经元的周围，它们在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ不同区域内的分布没有明显差异。
电镜观察可见，HRP逆标运动神经元的胞浆和树突内的TMB反应产物为不规则针状结晶，常呈板层状排列，由于经DAB和镍的加强，结晶的边缘不清晰，部分反应产物呈散在分布的细颗粒状(图1～6)。5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样免疫组织化学染色阳性产物位于轴突及其终末的突触小泡内，产物呈弥散性分布，为不定形状。由于这些神经活性物质的免疫组织化学染色阳性产物较密集，常无法判别阳性终末内突触小泡的形态(图1～6)，但在一些染色较淡的阳性终末内，可见5-HT样、SP样(图2)和L-ENK样阳性终末主要含透明圆形小泡，个别SP样和L-ENK样阳性终末内还可见致密颗粒囊泡，GABA样和Gly样阳性终末内可见透明圆形小泡和扁平小泡。
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在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内，均可见5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与支配不同面口部肌肉的HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成轴-体突触和轴-树突触(图1～6)。5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成非对称性的轴-体突触和轴-树突轴(图1～3)。在这些非对称性突触中，突触前、后膜的厚度分别约为5～7nm和15～20nm，突触间隙宽25～30nm。GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成对称性的轴-体突触和轴-树突触(图4～6)，但轴-体突触的数量明显少于轴-树突触。在这些对称性突触中，突触前、后膜的厚度分别约为5～7nm和6～8nm，突触间隙宽18～20nm。此外，可见一些5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与未标记运动神经元胞体和树突分别形成以非对称性为主或以对称性为主的轴-体突触和轴-树突触，免疫组织化学反应阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突也形成以非对称性为主的轴-体突触和轴-树突触联系，阴性轴突终末主要含透明圆形小泡(图1，5)。
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图1 5-HT样阳性终末(5-HT)和非标记终末(Ax)分别与三叉神经运动核内支配咬肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触 标尺示1.6μm(图2～5同此)
图2 SP样阳性终末(SP)与面神经核内支配二腹肌后腹的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触
图3 L-ENK样阳性终末(L-ENK)与舌下神经核内支配舌内肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触
图4 GABA样阳性终末(GABA)与三叉神经运动核内支配二腹肌前腹的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性轴-树突触
图5 GABA样阳性终末(GABA)和非标记终末(Ax)与舌下神经核内支配颏舌肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性和非对称性轴-树突触
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图6 Gly样阳性终末(Gly1和Gly2)分别与面神经核内支配口周围肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性轴-树突触 图1～6中的黑三角示突触活性区
Fig.1 A serotonin-like immunoreactive (5-HT-LI) axon terminal (5-TH) and a non-5-TH-LI axon terminal (Ax) makes asymmetrical axo-dendritic synapses with a dendrite(DH) of an HRP regrogradely labeled trigeminal motoneuron which innervates the masseter muscle.
Fig.2 An SP-LI axon terminal (SP) makes asymmetrical axo-dendritic synapses with a dendrite(DH) of an HRP labeled facial motoneuron which innervates posterior belly of the digastric muscle.
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Fig.3 An L-ENK-LI axon terminal (L-ENK)makes an asymmetrical axo-dendritic synapes with a dendrite (DH) of an HRP labeled hypoglossal motoneuron which innervates the muscles of the tongue.
Fig.4 A GABA-LI axon terminal (GABA)forms an symmetrical axo-dendritic synapse with a dendrite (DH) of an HRP labeled trigeminal motoneuron which innervates the anterior belly of the digastric muscle.
Fig.5 A GABA-LI axon terminal (GABA) and a non-GABA-LI axon terminal (Ax) forms symmetrical and asymmetrical axo-dendritic synapses,respectively,with a dendrite(DH) of an HRP labeled hypoglossal motoneuron which innervates the genioglossus muscle.
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Fig.6 Two Gly-LI axon terminals (Gly1 and Gly2) form symmetrical axo-dendritic synapses,respectively,with a dendrite (DH) of an HRP labeled facial motoneuron which innervates muscles around the mouth.Black triangles in Fig.s 1～6 indicate the active zones of the synapses.Bar in Fig.6=1.6μm and also for Figs.1～5.
讨 论
大脑运动皮质借助由其内谷氨酸样阳性的锥体细胞发出的下行投射纤维所组成的皮质脑干束兴奋脑干运动前神经元，再经运动前神经元调控脑干面口部运动核内运动神经元的活动，实现不同肌群间的协同和协调，完成一系列复杂而精细的活动。
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电泳各类不同性质的神经活性物质至面神经核(Ⅶ)内，可对其内的运动神经元活动产生不同的影响：5-HT减少K+外流，使运动神经元去极化、兴奋性增高；谷氨酸增加Na+和Ca2+内流，也使运动神经元去极化和兴奋性增高；而GABA和Gly增加Cl-内流，使运动神经元超极化[12]。5-HT和SP可强化谷氨酸对腰髓前角运动神经元的兴奋性作用，两者的强化作用基本上相似；促甲状腺激素释放激素(TRH)对运动神经元有先兴奋后抑制的效应，TRH的抑制作用可被5-HT翻转[13]。机能学研究也证实电刺激猫大脑运动皮质的咀嚼区，可引起下颌关节的节律性运动，同时在支配咬肌的运动神经元记录到抑制性突触后电位(IPSP)，但在延髓和脑桥交界处切断下位脑干后，IPSP则明显减弱或消失，这些结果提示，位于延髓的抑制性运动前神经元可能参与电刺激大脑运动皮质的咀嚼区所引起的IPSP[1]。用细胞外记录和细胞内标记相结合的方法观察到，位于三叉上核或位于Vm和三叉神经感觉主核之间的三叉间区内的抑制性运动前神经元的轴突分支投射向两侧的Vm[14]。形态学研究证明，脑干面口部运动核内有密集的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，在脑干与脑神经有关的核团中，面口部运动核内的上述阳性终末的密度最高。向脑干面口部运动核发出5-HT能、SP能、L-ENK能、GABA能和Gly能投射的运动前神经元主要位于脑干中缝核簇、臂旁核簇、三叉上核和脑干网状结构[7～11]，而向脑干运动核发出去甲肾上腺素能投射的运动前神经元主要位于A7细胞群，该群细胞包括K-F核、臂旁外侧核和蓝斑下核簇[7，8]。由上述可见，运动前神经元所含的对脑干运动神经元具有兴奋性或抑制性作用的神经活性物质是调控运动神经元、进而实现它们所支配肌肉间协同和协调的物质基础。
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本研究在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内观察到5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成非对称性轴-体和轴-树突触；GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成对称性轴-体和轴-树突触。以上结果说明，5-HT、SP和L-ENK及GABA和Gly分别对运动神经元产生兴奋性及抑制性效应。本研究的结果为以往的机能学和形态学研究提供了直接的形态学证据。本研究还观察到一些阴性轴突终末也与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成轴-体和轴-树突触联系，由于本研究中仅在每张切片上染出了一种神经活性物质，那么这些阴性轴突终末应含除此种神经活性物质以外的其他神经活性物质，如抑制性递质GABA和Gly免疫组织化学染色阴性的终末含透明圆形突触小泡，并与HRP逆标运动神经元的胞体和树突主要形成以非对称性为主的轴-体和轴-树突触联系，提示它们可能含兴奋性递质。这些问题只有在今后用多重标记方法进行电镜观察时才有望解决。
感谢张淼丽、王丹和原悦萍同志在电镜标本制备和图片制作过程中的帮助。
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参考文献
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SYNAPTIC CONNECTIONS BETWEEN SEROTONIN-,SUBSTAN-
CEP-,LEU-ENKEPHALIN-,GABA-,AND GLYCINE-LIKE
IMMUNOREACTIVE TERMINALS AND MOTONEURONS IN
THE BRAINSTEM OROFACIAL MOTOR
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NUCLEI OF THE RAT
Li Yunqing△,Wang Zhiming,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
In order to study the synaptic connections between the serotonin(5-HT)-,substance P(SP)-,leucine-enkephalin (L-ENK)-,γ-aminobutyric acid (GABA)-,and glycine (Gly)-like immunoreactive (LI) axon terminals and the motoneurons within the brainstem orofacial motor nuclei (trigeminal motor,facial,and hypoglossal nuclei)of the rat,a double-labeling method by combination of retrograde tracing with immunohistochemical staining was used in the present study.5-HT-,SP-,L-ENK-,GABA-,and Gly-LI axon terminals were densely observed in the brainstem orofacial motor nuclei.The distribution patterns of those axon terminals had no topographic differences within the different subregions of the motor nuclei.After injecting horseradish peroxidase(HRP) into the orofacial muscles or related nerves,HRP retrogradely labeled neurons were found in different subregions of the motor nuclei,in which motoneurons send their axons to innervate the orofacial muscles.5-HT-,SP-,and L-ENK-LI axon terminals made asymmetrical axo-dendritic synapses with dendrites of the HRP retrogradely labeled motoneurons,whereas GABA- and Gly-LI axon terminals formed symmetrical axo-dendritic synapses with dendrites of the HRP retrogradely labeled motoneurons.Occasionaly,axo-somatic synapses were encountered between 5-HT-,SP-,L-ENK-,GABA-,and Gly-LI axon terminals and HRP retrogradely labeled neuronal cell bodies of the motoneurons.The present results indicate that 5-HT-,SP-,and L-ENK-LI or GABA- and Gly-LI axon terminals which originated mainly from brainstem premotor neuron pool might have excitatory or inhibitory effects on orofacial motoneurons in the brainstem orofacial motor nuclei.
KEY WORDS Brainstem orofacial motor nuclei;Serotonin;Substance P;Leucine-enkephalin;GABA;Glycine;Synaptic connections;Rat
△Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011), 百拇医药
单位：第四军医大学解剖学教研室、梁琚脑研究中心，西安 710032
关键词：脑干面口部运动核；5-羟色胺；P物质；亮氨酸-脑啡肽；γ-氨基丁酸；甘氨酸；突触联系；大鼠
解剖学报/980404 摘 要 为了观察5-羟色胺(5-HT)样、P物质(SP)样、亮氨酸-脑啡肽(L-ENK)样、γ-氨基丁酸(GABA)样和甘氨酸(Gly)样阳性终末与脑干面口部运动核(三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核)间的突触联系，用HRP逆行追踪与免疫组织化学染色相结合的双标技术，在电镜下对5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标面口部运动神经元间的突触联系进行了观察。5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末在脑干面口部运动核内呈均匀分布，没有区域特异性。将HRP注入面口部肌肉或相应的周围神经后，HRP逆标神经元见于脑干运动核不同部位内支配相应肌肉的运动神经元。5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末主要与HRP逆标运动神经元的树突形成非对称性的轴-树突触；GABA样和Gly样阳性终末则主要与HRP逆标运动神经元的树突形成对称性的轴-树突触；偶见上述阳性轴突终末与HRP逆标运动神经元的胞体形成轴-体突触。结果提示：主要来自脑干运动前神经元的5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末及GABA样和Gly样阳性终末可能分别对脑干运动神经元发挥兴奋性或抑制性调控作用。
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近年来的机能学和形态学研究结果都证实，大脑运动皮质发出的皮质脑干束先终止于脑干运动前神经元(premotor neuron),脑干运动前神经元再投射至脑干面口部运动核，对其内的运动神经元发挥调控作用[1～3]。脑干运动前神经元是运动调控系统的中间神经元，主要分布于臂旁核簇、三叉上核、中缝核簇和脑干网状结构[4～6]，部分向脑干的三叉神经运动核(Vm)、面神经核(Ⅶ)和舌下神经核(Ⅹ Ⅱ)投射的运动前神经元含5-羟色胺(5-HT)、P物质(SP)、脑啡肽(ENK)、γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)[7～11]。Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内的运动神经元支配咀嚼肌、表情肌、舌肌等，与咀嚼、表情、吞咽、发音等复杂的精细活动有关，这些核团内均有密集的5-HT样、SP样、ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，5-HT和SP及GABA和Gly分别对中枢神经系统的运动神经元具有兴奋性及抑制性效应[12～15]。但大鼠运动前神经元的5-HT样、SP样、ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与面口部运动神经元间的突触联系，尚缺乏系统研究。本研究用HRP逆行追踪与免疫组织化学染色相结合的双标技术对5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与面口部运动核内支配不同面口部肌的运动神经元间的突触联系进行了观察。
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材料和方法
雄性SD大鼠30只，体重200～250g，分成3组，每组10只。戊巴比妥钠经腹腔麻醉(40mg/kg)后，将8～10μl的3%HRP水溶液用10μl微量注射器缓慢注入第1组大鼠的一侧咬肌(4只)、咬肌神经(2只)或二腹肌前腹(4只)，第2组大鼠的一侧口周围肌(3只)、二腹肌后腹(3只)或出茎乳孔后的面神经干(4只)，第3组大鼠的舌内肌(4只)、颏舌肌(3只)或茎突舌肌(3只)。注射完毕后，用蜡膜将肌肉或神经与周围组织隔离。动物存活3d后，用戊巴比妥钠深麻、开胸，经心脏插管至升主动脉，先以100ml的0.9%盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)灌注固定1h以上，灌注完毕立即取脑，将脑干切下并置入上述新鲜固定液中后固定6h(4℃)，再移入30%蔗糖中过夜(4℃)。振动切片机横切脑干，片厚50μm，切片隔5张取1张，分6套收集。全部动物的第1～5套切片先用钨酸钠作稳定剂的TMB呈色方法显示三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内的HRP逆标神经元，并用硫酸镍胺加强HRP的反应产物；再用ABC法进行免疫组织化学染色，以显示三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，具体步骤如下：5套切片分别入兔抗5-HT血清(1∶3 000,INC)、兔抗SP血清(1∶3 000,INC)、兔抗L-ENK血清(1∶3 000)，INC)、兔抗GABA血清(1∶1 000,Chemicon)或兔抗Gly血清(1∶1 000,Chemicon)孵育24h,次入Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶100,Vector)孵育3h，再入ABC复合物(1∶200,Vector)孵育1h，最后用DAB呈色。经上述反应的切片入1%锇酸后固定，梯度酒精脱水(饱和醋酸铀染色与70%酒精脱水同时进行，15min×2次)，Epon812平板包埋，选择三叉神经运动核、面神经核和舌下神经核内有5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样或Gly样阳性终末及HRP逆标神经元的部位超薄切片、铅染、Philips-100电镜观察。将第6套切片行Nissl染色，以便对照观察结果。
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结 果
光镜观察时可见，将HRP注入咬肌和咬肌神经或二腹肌前腹后，HRP逆标运动神经元分别见于Vm的背外侧部或腹内侧部；将HRP注入口周围肌、二腹肌后腹或茎乳孔外的面神经干后，HRP逆标运动神经元分别见于Ⅶ的外侧部、内侧部或Ⅶ的各部；将HRP注入舌内肌、颏舌肌或茎突舌肌后，散在分布的HRP逆标运动神经元见于Ⅹ Ⅱ的各部，这些神经元的分布区互相重叠，没有相对集中区。HRP逆标运动神经元均为大、中型多极神经元。在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内，未见5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样免疫组织化学染色阳性神经元胞体，但均可见密集的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，在脑干的脑神经核中，脑干运动核内的上述阳性终末的密度最高，这些阳性终末常呈蓝状包绕在HRP逆标运动神经元的周围，它们在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ不同区域内的分布没有明显差异。
电镜观察可见，HRP逆标运动神经元的胞浆和树突内的TMB反应产物为不规则针状结晶，常呈板层状排列，由于经DAB和镍的加强，结晶的边缘不清晰，部分反应产物呈散在分布的细颗粒状(图1～6)。5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样免疫组织化学染色阳性产物位于轴突及其终末的突触小泡内，产物呈弥散性分布，为不定形状。由于这些神经活性物质的免疫组织化学染色阳性产物较密集，常无法判别阳性终末内突触小泡的形态(图1～6)，但在一些染色较淡的阳性终末内，可见5-HT样、SP样(图2)和L-ENK样阳性终末主要含透明圆形小泡，个别SP样和L-ENK样阳性终末内还可见致密颗粒囊泡，GABA样和Gly样阳性终末内可见透明圆形小泡和扁平小泡。
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在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内，均可见5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与支配不同面口部肌肉的HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成轴-体突触和轴-树突触(图1～6)。5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成非对称性的轴-体突触和轴-树突轴(图1～3)。在这些非对称性突触中，突触前、后膜的厚度分别约为5～7nm和15～20nm，突触间隙宽25～30nm。GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成对称性的轴-体突触和轴-树突触(图4～6)，但轴-体突触的数量明显少于轴-树突触。在这些对称性突触中，突触前、后膜的厚度分别约为5～7nm和6～8nm，突触间隙宽18～20nm。此外，可见一些5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末与未标记运动神经元胞体和树突分别形成以非对称性为主或以对称性为主的轴-体突触和轴-树突触，免疫组织化学反应阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突也形成以非对称性为主的轴-体突触和轴-树突触联系，阴性轴突终末主要含透明圆形小泡(图1，5)。
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图1 5-HT样阳性终末(5-HT)和非标记终末(Ax)分别与三叉神经运动核内支配咬肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触 标尺示1.6μm(图2～5同此)
图2 SP样阳性终末(SP)与面神经核内支配二腹肌后腹的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触
图3 L-ENK样阳性终末(L-ENK)与舌下神经核内支配舌内肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成非对称性轴-树突触
图4 GABA样阳性终末(GABA)与三叉神经运动核内支配二腹肌前腹的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性轴-树突触
图5 GABA样阳性终末(GABA)和非标记终末(Ax)与舌下神经核内支配颏舌肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性和非对称性轴-树突触
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图6 Gly样阳性终末(Gly1和Gly2)分别与面神经核内支配口周围肌的HRP逆标运动神经元的树突(DH)形成对称性轴-树突触 图1～6中的黑三角示突触活性区
Fig.1 A serotonin-like immunoreactive (5-HT-LI) axon terminal (5-TH) and a non-5-TH-LI axon terminal (Ax) makes asymmetrical axo-dendritic synapses with a dendrite(DH) of an HRP regrogradely labeled trigeminal motoneuron which innervates the masseter muscle.
Fig.2 An SP-LI axon terminal (SP) makes asymmetrical axo-dendritic synapses with a dendrite(DH) of an HRP labeled facial motoneuron which innervates posterior belly of the digastric muscle.
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Fig.3 An L-ENK-LI axon terminal (L-ENK)makes an asymmetrical axo-dendritic synapes with a dendrite (DH) of an HRP labeled hypoglossal motoneuron which innervates the muscles of the tongue.
Fig.4 A GABA-LI axon terminal (GABA)forms an symmetrical axo-dendritic synapse with a dendrite (DH) of an HRP labeled trigeminal motoneuron which innervates the anterior belly of the digastric muscle.
Fig.5 A GABA-LI axon terminal (GABA) and a non-GABA-LI axon terminal (Ax) forms symmetrical and asymmetrical axo-dendritic synapses,respectively,with a dendrite(DH) of an HRP labeled hypoglossal motoneuron which innervates the genioglossus muscle.
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Fig.6 Two Gly-LI axon terminals (Gly1 and Gly2) form symmetrical axo-dendritic synapses,respectively,with a dendrite (DH) of an HRP labeled facial motoneuron which innervates muscles around the mouth.Black triangles in Fig.s 1～6 indicate the active zones of the synapses.Bar in Fig.6=1.6μm and also for Figs.1～5.
讨 论
大脑运动皮质借助由其内谷氨酸样阳性的锥体细胞发出的下行投射纤维所组成的皮质脑干束兴奋脑干运动前神经元，再经运动前神经元调控脑干面口部运动核内运动神经元的活动，实现不同肌群间的协同和协调，完成一系列复杂而精细的活动。
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电泳各类不同性质的神经活性物质至面神经核(Ⅶ)内，可对其内的运动神经元活动产生不同的影响：5-HT减少K+外流，使运动神经元去极化、兴奋性增高；谷氨酸增加Na+和Ca2+内流，也使运动神经元去极化和兴奋性增高；而GABA和Gly增加Cl-内流，使运动神经元超极化[12]。5-HT和SP可强化谷氨酸对腰髓前角运动神经元的兴奋性作用，两者的强化作用基本上相似；促甲状腺激素释放激素(TRH)对运动神经元有先兴奋后抑制的效应，TRH的抑制作用可被5-HT翻转[13]。机能学研究也证实电刺激猫大脑运动皮质的咀嚼区，可引起下颌关节的节律性运动，同时在支配咬肌的运动神经元记录到抑制性突触后电位(IPSP)，但在延髓和脑桥交界处切断下位脑干后，IPSP则明显减弱或消失，这些结果提示，位于延髓的抑制性运动前神经元可能参与电刺激大脑运动皮质的咀嚼区所引起的IPSP[1]。用细胞外记录和细胞内标记相结合的方法观察到，位于三叉上核或位于Vm和三叉神经感觉主核之间的三叉间区内的抑制性运动前神经元的轴突分支投射向两侧的Vm[14]。形态学研究证明，脑干面口部运动核内有密集的5-HT样、SP样、L-ENK样、GABA样和Gly样阳性终末，在脑干与脑神经有关的核团中，面口部运动核内的上述阳性终末的密度最高。向脑干面口部运动核发出5-HT能、SP能、L-ENK能、GABA能和Gly能投射的运动前神经元主要位于脑干中缝核簇、臂旁核簇、三叉上核和脑干网状结构[7～11]，而向脑干运动核发出去甲肾上腺素能投射的运动前神经元主要位于A7细胞群，该群细胞包括K-F核、臂旁外侧核和蓝斑下核簇[7，8]。由上述可见，运动前神经元所含的对脑干运动神经元具有兴奋性或抑制性作用的神经活性物质是调控运动神经元、进而实现它们所支配肌肉间协同和协调的物质基础。
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本研究在Vm、Ⅶ和Ⅹ Ⅱ内观察到5-HT样、SP样和L-ENK样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成非对称性轴-体和轴-树突触；GABA样和Gly样阳性终末与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成对称性轴-体和轴-树突触。以上结果说明，5-HT、SP和L-ENK及GABA和Gly分别对运动神经元产生兴奋性及抑制性效应。本研究的结果为以往的机能学和形态学研究提供了直接的形态学证据。本研究还观察到一些阴性轴突终末也与HRP逆标运动神经元的胞体和树突形成轴-体和轴-树突触联系，由于本研究中仅在每张切片上染出了一种神经活性物质，那么这些阴性轴突终末应含除此种神经活性物质以外的其他神经活性物质，如抑制性递质GABA和Gly免疫组织化学染色阴性的终末含透明圆形突触小泡，并与HRP逆标运动神经元的胞体和树突主要形成以非对称性为主的轴-体和轴-树突触联系，提示它们可能含兴奋性递质。这些问题只有在今后用多重标记方法进行电镜观察时才有望解决。
感谢张淼丽、王丹和原悦萍同志在电镜标本制备和图片制作过程中的帮助。
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SYNAPTIC CONNECTIONS BETWEEN SEROTONIN-,SUBSTAN-
CEP-,LEU-ENKEPHALIN-,GABA-,AND GLYCINE-LIKE
IMMUNOREACTIVE TERMINALS AND MOTONEURONS IN
THE BRAINSTEM OROFACIAL MOTOR
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NUCLEI OF THE RAT
Li Yunqing△,Wang Zhiming,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
In order to study the synaptic connections between the serotonin(5-HT)-,substance P(SP)-,leucine-enkephalin (L-ENK)-,γ-aminobutyric acid (GABA)-,and glycine (Gly)-like immunoreactive (LI) axon terminals and the motoneurons within the brainstem orofacial motor nuclei (trigeminal motor,facial,and hypoglossal nuclei)of the rat,a double-labeling method by combination of retrograde tracing with immunohistochemical staining was used in the present study.5-HT-,SP-,L-ENK-,GABA-,and Gly-LI axon terminals were densely observed in the brainstem orofacial motor nuclei.The distribution patterns of those axon terminals had no topographic differences within the different subregions of the motor nuclei.After injecting horseradish peroxidase(HRP) into the orofacial muscles or related nerves,HRP retrogradely labeled neurons were found in different subregions of the motor nuclei,in which motoneurons send their axons to innervate the orofacial muscles.5-HT-,SP-,and L-ENK-LI axon terminals made asymmetrical axo-dendritic synapses with dendrites of the HRP retrogradely labeled motoneurons,whereas GABA- and Gly-LI axon terminals formed symmetrical axo-dendritic synapses with dendrites of the HRP retrogradely labeled motoneurons.Occasionaly,axo-somatic synapses were encountered between 5-HT-,SP-,L-ENK-,GABA-,and Gly-LI axon terminals and HRP retrogradely labeled neuronal cell bodies of the motoneurons.The present results indicate that 5-HT-,SP-,and L-ENK-LI or GABA- and Gly-LI axon terminals which originated mainly from brainstem premotor neuron pool might have excitatory or inhibitory effects on orofacial motoneurons in the brainstem orofacial motor nuclei.
KEY WORDS Brainstem orofacial motor nuclei;Serotonin;Substance P;Leucine-enkephalin;GABA;Glycine;Synaptic connections;Rat
△Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011), 百拇医药