程序化细胞死亡在颞颌关节发育中的作用
作者：李松 杨春 罗应伟 沈丽玲
单位：(昆明医学院口腔医学系，昆明 650031)
关键词：程序化细胞死亡；颞颌关节；发育
昆明医学院学报000309 摘要：为了探讨程序化细胞死亡(PCD)在颞颌关节的发育中的作用，利用原位末端标记法(TUNEL)，对胚胎及生后1周SD大鼠颞颌关节发育不同时期的PCD进行了观察.结果：各时期髁状突软骨细胞中均有PCD出现，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域，关节腔开始形成时髁状软骨表面PCD明显，出生后PCD阳性细胞于关节的功能部位(髁状突前斜面)较其他部位更明显.结果表明PCD在颞颌关节发育形成中起着重要的作用.
中图分类号：R 782 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000)03-0034-04
, 百拇医药
Role of Programmed Cell Death in
the Temporomandibular Joint Development
LI Song，YANG Chun，LUO Ying-wei，SHEN Li-ling
(Department of Stomatology, Kunming Medical College, Kunming 650031)
Abstract：Programmed cell death (PCD) involving in embryogenesis and organ formation has been verified, but the reports of PCD of development in temporomandibular joint(TMJ) have not been found. PCD in TMJ development both prenatal and postnatal was observed. The roles of PCD in development were discussed. Methods: Tdt-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) was used in observation of PCD in TMJ of SD rats during series prenatal and postnatal developmental periods. Results: PCD is involved in condylar cartilage development of different periods. The cells of PCD were mainly located in proliferative zone and the area between prehypertrophic zone and late hypertrophic zone. Conclusion: PCD plays an important role in TMJ development both prenatal and postnatal.
, 百拇医药
Key words：Programmed cell death； Temporomandibular joint； Development
颞颌关节(temporomandibular joint, TMJ)是一个左右联动的关节，它具有咀嚼、吞咽、发音等复杂的功能.由于结构和功能的特殊性，极易受到上下牙咬合关系、精神因素及创伤等因素的作用发生颞颌关节紊乱症(temporomandibular joint disorder,TMD)，严重时可导致TMJ发生退形性改变.近年来，因TMJ发育异常造成左右关节不对称、关节发育不良及青少年发育期的不适当正畸治疗所引起的TMD在逐渐增多，为正确引导TMJ正常发育，进一步明确TMJ发育过程中控制因素尤为重要.大量研究表明，程序化细胞死亡(progrmmed cell death,简称PCD)在组织器官的发育中的作用已得到证实，但有关PCD在TMJ发育中的作用尚未见报道，本文通过观察不同发育时期SD大鼠TMJ中的PCD，探讨了PCD在其中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物模型及标本制备
选用纯系、3月龄SD大鼠(上海产)20只，按雌雄4：1的比例同笼，每天早晨8：00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0天，分别于妊娠13，14，15，16，17，18，19，20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠(E)颞颌关节部置于4%的多聚甲醛中固定后，常规脱水、石蜡包埋.另取出生后(P)1，2，3，4，5，6，7 d幼鼠颞颌关节部(沿正中线切开鼠头后分切)置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中充分固定、脱钙，流水冲洗后，慢脱水、石蜡包埋.作颞颌关节矢状切片，厚度约5 μm，分别用于HE，TUNEL染色.切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶.
1.2 原位末端标记法(TUNEL法)标记PCD细胞
TUNEL法(试剂盒购自美国Oncor公司)：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min;3%H2O2的PBS溶液中处理5 min后，加50 μL的平衡液(TUNEL试剂盒原配)1 min；再加含TDT酶反应液15 μL，37℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应(TUNEL试剂盒原配)；buffer 1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；经buffer l，buffer 3漂洗后，加新配制的显色液(NBT/BCIP显色系统用buffer 3配制：NBT 4.5 μL，BCIP 3.5 μL，左旋咪唑0.24 g/L)20 μL，暗处显色.中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片.
, 百拇医药
2 结果
HE染色：E13 d TMJ区开始出现未分化间充质细胞聚集、增殖、分化为软骨细胞，至E14 d TMJ髁状突软骨组织厚，软骨各层分界明显；E14 ～15 d关节腔开始形成，E17，18 d关节盘出现；E13 d即可见下颌骨体部端有骨化出现，以后骨化逐渐扩展到髁状突颈部；出生后关节软骨逐渐变薄，下颌骨骨化接近关节软骨区.TUNEL染色结果：阳性细胞核呈紫蓝色，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图1，2).深层的肥厚层的成熟软骨细胞多呈空泡样，TUNEL法不易着色；E14～15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD阳性细胞多(图3)；出生后PCD阳性细胞也主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图4).PCD阳性软骨细胞于关节的功能部位(髁状前斜面、关节结节前斜面)更明显.
图1 E 19 d TMJ髁状突软骨增殖带PCD细胞(200×)
, 百拇医药
图2 E 19 d TMJ髁状突软骨浅肥厚层与深肥厚层交界区PCD细胞( 200×)
图3 E 14 d TMJ关节腔开始形成时髁状突软骨表面PCD明显( 200×)
图4 P 7 d TMJ 髁状突软骨浅肥厚层与深肥厚层交界区PCD细胞( 200×)
3 讨论
PCD亦称细胞凋亡(apoptosis)是1972年由Kerr首先提出的一种细胞自我消亡形式.PCD不同于细胞坏死(necrosis),它是在一组基因的控制下，细胞内出现了一系列分子变化，使核酸内切酶被激活，染色质于核小体处断裂，降解形成180～200 bp或其多倍体的DNA片段.断裂的DNA可以聚集于核膜边沿，也可以脱离细胞形成由细胞膜包被的独具特征的凋亡小体.发生了凋亡的细胞及凋亡小体由于有完整的细胞膜包被防止了其内容物溢出，因而局部并无炎症反应，最终凋亡细胞及凋亡小体为巨噬细胞或临近的细胞吞噬所消除[1，2].目前已认识到细胞凋亡在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着至关重要的作用[4].骨和关节的发育是一复杂的过程，其间伴随着PCD及其调控基因的表达和信号分子的传导，PCD的紊乱可能导致骨和关节的畸形[3，4].TMJ是结构及功能均复杂的关节，其发育过程中的PCD的异常可能导致TMJ先天性畸形、左右关节不对称等，由此可成为TMD及TMJ骨关节疾病的病因[6，7].
, http://www.100md.com
TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end ladeling)染色显示，在TMJ的发育中(出生前及生后1周)下颌髁状突软骨中均有规律性分布的PCD.PCD阳性细胞主要位于髁状突软骨的增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域.此结果与Matsuda等[6]用透射电镜观察到的，仅于P 1 d出现髁状突软骨细胞PCD不同.一般认为，增殖带是由未分化的间充质细胞构成的，它具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力.该区出现的PCD可能与增殖带细胞的分化有关，机体通过PCD控制骨细胞的数量达到控制生长速度的目的.Roach等[8]通过对鸡股骨软骨生长板的培养研究，发现软骨生长板肥厚层软骨细胞向骨端移动的过程中逐渐凋亡，证实了软骨成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡形式.而本研究中的PCD出现于浅层肥厚层与深层肥厚层交界区域，推测可能与软骨细胞的成熟相关，表明作为继发性软骨的髁状突软骨层虽然具有软骨生长板样的生长功能；但其生理特性与原发性生长板软骨可能不同.E14～15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD显著，提示关节腔的形成与PCD有关，关节腔可能是临近关节腔面的细胞PCD后出现的.出生后早期PCD也较明显，作者认为可能与吮乳、咀嚼及发音等功能活动中髁状软骨功能受力，软骨组织塑形、改建有关.
, 百拇医药
作者简介：李松(1963～)，男，云南保山人，博士，副教授.研究方向：颞颌关节生理与病理.
参考文献
[1] COHEN J J,OVERVIEW.Mechanisms of apoptsis[J].Immunol Today,1993,14:126
[2] SAVILL J, FADOK V, HENSON P,et al.Phangocyte recognition of cells undergoing apoptosis[J].Immunol Today ,1993,14 :131
[3] MICHAEL D J,MIGUEL W,MARTIN C R, et al.Programmed cell death in animal development[J].Cell,1997,88:347
, 百拇医药
[4] YOKOUCHI Y,SAKIYAMA J,KAMREDA T,et al.BMP2/4 mediate programmed cell death in chicken limb buds[J].Development,1997,122(12):3725
[5] ZOU H Y,NISWANDER L.Requirenment for BMP signaling in interdigital apoptosis and scale formation [J].Science,1996,272:738
[6] MATSUDA S,MISHIMA R C H,YOSHLMURA Y,et al. Apoptosis in the development of thetemporomandibuibular joint[J].Anat Embryol,1997,196:383
, http://www.100md.com [7] MCNANARA J A J R,TURP J C. Orthodontic trenatmet amd temporomandibular bisrders:is there a relationship?part 1:Clinical studies [J].Fortschr-kieferorthop,1997,58(2):74
[8] ROACH H I,ERENPREISA J,AIGNER T.Osteogenic differentiaton of hypertophic chondrocytes involves asymmertic cell divisions and apoptosis[J].J Jell Biol,1995,131(2):483
(2000-03-26收稿), 百拇医药
单位：(昆明医学院口腔医学系，昆明 650031)
关键词：程序化细胞死亡；颞颌关节；发育
昆明医学院学报000309 摘要：为了探讨程序化细胞死亡(PCD)在颞颌关节的发育中的作用，利用原位末端标记法(TUNEL)，对胚胎及生后1周SD大鼠颞颌关节发育不同时期的PCD进行了观察.结果：各时期髁状突软骨细胞中均有PCD出现，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域，关节腔开始形成时髁状软骨表面PCD明显，出生后PCD阳性细胞于关节的功能部位(髁状突前斜面)较其他部位更明显.结果表明PCD在颞颌关节发育形成中起着重要的作用.
中图分类号：R 782 文献标识码：A 文章编号：1003-4706(2000)03-0034-04
, 百拇医药
Role of Programmed Cell Death in
the Temporomandibular Joint Development
LI Song，YANG Chun，LUO Ying-wei，SHEN Li-ling
(Department of Stomatology, Kunming Medical College, Kunming 650031)
Abstract：Programmed cell death (PCD) involving in embryogenesis and organ formation has been verified, but the reports of PCD of development in temporomandibular joint(TMJ) have not been found. PCD in TMJ development both prenatal and postnatal was observed. The roles of PCD in development were discussed. Methods: Tdt-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) was used in observation of PCD in TMJ of SD rats during series prenatal and postnatal developmental periods. Results: PCD is involved in condylar cartilage development of different periods. The cells of PCD were mainly located in proliferative zone and the area between prehypertrophic zone and late hypertrophic zone. Conclusion: PCD plays an important role in TMJ development both prenatal and postnatal.
, 百拇医药
Key words：Programmed cell death； Temporomandibular joint； Development
颞颌关节(temporomandibular joint, TMJ)是一个左右联动的关节，它具有咀嚼、吞咽、发音等复杂的功能.由于结构和功能的特殊性，极易受到上下牙咬合关系、精神因素及创伤等因素的作用发生颞颌关节紊乱症(temporomandibular joint disorder,TMD)，严重时可导致TMJ发生退形性改变.近年来，因TMJ发育异常造成左右关节不对称、关节发育不良及青少年发育期的不适当正畸治疗所引起的TMD在逐渐增多，为正确引导TMJ正常发育，进一步明确TMJ发育过程中控制因素尤为重要.大量研究表明，程序化细胞死亡(progrmmed cell death,简称PCD)在组织器官的发育中的作用已得到证实，但有关PCD在TMJ发育中的作用尚未见报道，本文通过观察不同发育时期SD大鼠TMJ中的PCD，探讨了PCD在其中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物模型及标本制备
选用纯系、3月龄SD大鼠(上海产)20只，按雌雄4：1的比例同笼，每天早晨8：00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0天，分别于妊娠13，14，15，16，17，18，19，20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠(E)颞颌关节部置于4%的多聚甲醛中固定后，常规脱水、石蜡包埋.另取出生后(P)1，2，3，4，5，6，7 d幼鼠颞颌关节部(沿正中线切开鼠头后分切)置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的4%多聚甲醛液中充分固定、脱钙，流水冲洗后，慢脱水、石蜡包埋.作颞颌关节矢状切片，厚度约5 μm，分别用于HE，TUNEL染色.切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶.
1.2 原位末端标记法(TUNEL法)标记PCD细胞
TUNEL法(试剂盒购自美国Oncor公司)：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min;3%H2O2的PBS溶液中处理5 min后，加50 μL的平衡液(TUNEL试剂盒原配)1 min；再加含TDT酶反应液15 μL，37℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应(TUNEL试剂盒原配)；buffer 1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；经buffer l，buffer 3漂洗后，加新配制的显色液(NBT/BCIP显色系统用buffer 3配制：NBT 4.5 μL，BCIP 3.5 μL，左旋咪唑0.24 g/L)20 μL，暗处显色.中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片.
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2 结果
HE染色：E13 d TMJ区开始出现未分化间充质细胞聚集、增殖、分化为软骨细胞，至E14 d TMJ髁状突软骨组织厚，软骨各层分界明显；E14 ～15 d关节腔开始形成，E17，18 d关节盘出现；E13 d即可见下颌骨体部端有骨化出现，以后骨化逐渐扩展到髁状突颈部；出生后关节软骨逐渐变薄，下颌骨骨化接近关节软骨区.TUNEL染色结果：阳性细胞核呈紫蓝色，阳性PCD细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图1，2).深层的肥厚层的成熟软骨细胞多呈空泡样，TUNEL法不易着色；E14～15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD阳性细胞多(图3)；出生后PCD阳性细胞也主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图4).PCD阳性软骨细胞于关节的功能部位(髁状前斜面、关节结节前斜面)更明显.
图1 E 19 d TMJ髁状突软骨增殖带PCD细胞(200×)
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图2 E 19 d TMJ髁状突软骨浅肥厚层与深肥厚层交界区PCD细胞( 200×)
图3 E 14 d TMJ关节腔开始形成时髁状突软骨表面PCD明显( 200×)
图4 P 7 d TMJ 髁状突软骨浅肥厚层与深肥厚层交界区PCD细胞( 200×)
3 讨论
PCD亦称细胞凋亡(apoptosis)是1972年由Kerr首先提出的一种细胞自我消亡形式.PCD不同于细胞坏死(necrosis),它是在一组基因的控制下，细胞内出现了一系列分子变化，使核酸内切酶被激活，染色质于核小体处断裂，降解形成180～200 bp或其多倍体的DNA片段.断裂的DNA可以聚集于核膜边沿，也可以脱离细胞形成由细胞膜包被的独具特征的凋亡小体.发生了凋亡的细胞及凋亡小体由于有完整的细胞膜包被防止了其内容物溢出，因而局部并无炎症反应，最终凋亡细胞及凋亡小体为巨噬细胞或临近的细胞吞噬所消除[1，2].目前已认识到细胞凋亡在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着至关重要的作用[4].骨和关节的发育是一复杂的过程，其间伴随着PCD及其调控基因的表达和信号分子的传导，PCD的紊乱可能导致骨和关节的畸形[3，4].TMJ是结构及功能均复杂的关节，其发育过程中的PCD的异常可能导致TMJ先天性畸形、左右关节不对称等，由此可成为TMD及TMJ骨关节疾病的病因[6，7].
, http://www.100md.com
TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end ladeling)染色显示，在TMJ的发育中(出生前及生后1周)下颌髁状突软骨中均有规律性分布的PCD.PCD阳性细胞主要位于髁状突软骨的增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域.此结果与Matsuda等[6]用透射电镜观察到的，仅于P 1 d出现髁状突软骨细胞PCD不同.一般认为，增殖带是由未分化的间充质细胞构成的，它具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力.该区出现的PCD可能与增殖带细胞的分化有关，机体通过PCD控制骨细胞的数量达到控制生长速度的目的.Roach等[8]通过对鸡股骨软骨生长板的培养研究，发现软骨生长板肥厚层软骨细胞向骨端移动的过程中逐渐凋亡，证实了软骨成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡形式.而本研究中的PCD出现于浅层肥厚层与深层肥厚层交界区域，推测可能与软骨细胞的成熟相关，表明作为继发性软骨的髁状突软骨层虽然具有软骨生长板样的生长功能；但其生理特性与原发性生长板软骨可能不同.E14～15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD显著，提示关节腔的形成与PCD有关，关节腔可能是临近关节腔面的细胞PCD后出现的.出生后早期PCD也较明显，作者认为可能与吮乳、咀嚼及发音等功能活动中髁状软骨功能受力，软骨组织塑形、改建有关.
, 百拇医药
作者简介：李松(1963～)，男，云南保山人，博士，副教授.研究方向：颞颌关节生理与病理.
参考文献
[1] COHEN J J,OVERVIEW.Mechanisms of apoptsis[J].Immunol Today,1993,14:126
[2] SAVILL J, FADOK V, HENSON P,et al.Phangocyte recognition of cells undergoing apoptosis[J].Immunol Today ,1993,14 :131
[3] MICHAEL D J,MIGUEL W,MARTIN C R, et al.Programmed cell death in animal development[J].Cell,1997,88:347
, 百拇医药
[4] YOKOUCHI Y,SAKIYAMA J,KAMREDA T,et al.BMP2/4 mediate programmed cell death in chicken limb buds[J].Development,1997,122(12):3725
[5] ZOU H Y,NISWANDER L.Requirenment for BMP signaling in interdigital apoptosis and scale formation [J].Science,1996,272:738
[6] MATSUDA S,MISHIMA R C H,YOSHLMURA Y,et al. Apoptosis in the development of thetemporomandibuibular joint[J].Anat Embryol,1997,196:383
, http://www.100md.com [7] MCNANARA J A J R,TURP J C. Orthodontic trenatmet amd temporomandibular bisrders:is there a relationship?part 1:Clinical studies [J].Fortschr-kieferorthop,1997,58(2):74
[8] ROACH H I,ERENPREISA J,AIGNER T.Osteogenic differentiaton of hypertophic chondrocytes involves asymmertic cell divisions and apoptosis[J].J Jell Biol,1995,131(2):483
(2000-03-26收稿), 百拇医药