巢式逆转录多聚酶链反应检测周围静脉血中肝癌细胞的敏感性
作者：刘扬 张柏和 钱光相 陈汉 吴孟超 傅继梁 黄长辉
单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、张柏和、钱光相、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)；第二军医大学分子生物开放实验室(黄长辉)
关键词：
中华外科杂志980921 本研究拟应用巢式逆转录多聚酶链反应(巢式RT-PCR)检测不同稀释比例的周围静脉血液中存在的肝癌细胞，并探讨其敏感性。
1. 材料和方法：(1)细胞系选择：选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM(由本校病理解剖教研室提供)，进行体外传代培养，显微镜下计数。(2)稀释血液标本的制备：抽取健康人周围静脉血液4.5 ml,与显微镜下计数的SMMC-LINM肝癌细胞进行倍比稀释。(3)有核细胞的制备：采用红细胞溶解法[1]。(4)抽提细胞总RNA:采用异硫氰酸胍一步抽提法。(5)合成cDNA：应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。(6)巢式PCR：PCR循环条件参照文献[1]并略有改进。(7)电泳分析及PCR产物鉴定分析：用15%的聚丙烯胺凝胶电泳分析不同细胞稀释比例的PCR终产物。
2.结果：巢式RT-PCR检测周围静脉血液中SMMC-LINM株肝癌细胞的敏感性：人AFPmRNA特异性PCR产物可以从一系列稀释血液标本中观察到，其检测敏感性可达每5ml血液中仅存在6个以上SMMC-LINM肝癌细胞，巢式RT-PCR就可以检测到它存在的依据。
3.讨论：目前用于肝癌早期血液转移的检测尚无理想、可靠的方法，细胞学方法及免疫组化法有一定的特异性，但缺乏敏感性，其检测范围为1/104～1/105。鉴于此，我们试图应用一种敏感性高(可达1/107)，特异性强的方法，即巢式RT-PCR检测血循环中播散或转移的肝癌细胞。本研究表明，倍比稀释的血液中的SMMC-LINM肝癌细胞可以通过巢式RT-PCR敏感的检测到其存在的依据，其敏感性可达每5ml血液中只要存在6个肝癌细胞，这就意味着只要107个单个核细胞中存在6个以上肿瘤细胞，巢式RT-PCR即可检测到它的存在，这与国外学者报道结果相似。目前，国外学者应用巢式RT-PCR已成功地进行了黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌、前列腺癌等肿瘤细胞血液转移的检测[1]，但国内目前尚无开展此项研究。
综上所述，巢式RT-PCR可以敏感的检测到血循环中播散或转移的肝癌细胞，它是一种敏感性高，特异性强的实用性检测方法。
本课题受军联重点实验基金资助
参考文献
1Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular cacinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995,75:2214-2219.
(收稿：1997-10-03 修回：1998-06-20), 百拇医药
单位：200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院(刘扬、张柏和、钱光相、陈汉、吴孟超)；第二军医大学生物教研室(傅继梁)；第二军医大学分子生物开放实验室(黄长辉)
关键词：
中华外科杂志980921 本研究拟应用巢式逆转录多聚酶链反应(巢式RT-PCR)检测不同稀释比例的周围静脉血液中存在的肝癌细胞，并探讨其敏感性。
1. 材料和方法：(1)细胞系选择：选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM(由本校病理解剖教研室提供)，进行体外传代培养，显微镜下计数。(2)稀释血液标本的制备：抽取健康人周围静脉血液4.5 ml,与显微镜下计数的SMMC-LINM肝癌细胞进行倍比稀释。(3)有核细胞的制备：采用红细胞溶解法[1]。(4)抽提细胞总RNA:采用异硫氰酸胍一步抽提法。(5)合成cDNA：应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。(6)巢式PCR：PCR循环条件参照文献[1]并略有改进。(7)电泳分析及PCR产物鉴定分析：用15%的聚丙烯胺凝胶电泳分析不同细胞稀释比例的PCR终产物。
2.结果：巢式RT-PCR检测周围静脉血液中SMMC-LINM株肝癌细胞的敏感性：人AFPmRNA特异性PCR产物可以从一系列稀释血液标本中观察到，其检测敏感性可达每5ml血液中仅存在6个以上SMMC-LINM肝癌细胞，巢式RT-PCR就可以检测到它存在的依据。
3.讨论：目前用于肝癌早期血液转移的检测尚无理想、可靠的方法，细胞学方法及免疫组化法有一定的特异性，但缺乏敏感性，其检测范围为1/104～1/105。鉴于此，我们试图应用一种敏感性高(可达1/107)，特异性强的方法，即巢式RT-PCR检测血循环中播散或转移的肝癌细胞。本研究表明，倍比稀释的血液中的SMMC-LINM肝癌细胞可以通过巢式RT-PCR敏感的检测到其存在的依据，其敏感性可达每5ml血液中只要存在6个肝癌细胞，这就意味着只要107个单个核细胞中存在6个以上肿瘤细胞，巢式RT-PCR即可检测到它的存在，这与国外学者报道结果相似。目前，国外学者应用巢式RT-PCR已成功地进行了黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌、前列腺癌等肿瘤细胞血液转移的检测[1]，但国内目前尚无开展此项研究。
综上所述，巢式RT-PCR可以敏感的检测到血循环中播散或转移的肝癌细胞，它是一种敏感性高，特异性强的实用性检测方法。
本课题受军联重点实验基金资助
参考文献
1Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocellular cacinoma cells in peripheral venous blood.Cancer,1995,75:2214-2219.
(收稿：1997-10-03 修回：1998-06-20), 百拇医药