变应性鼻炎鼻粘膜中一氧化氮合酶的组织化学变化
作者：周卫东 章如新 李兆基
单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海 200433
关键词：一氧化氮合酶；鼻炎；变应性；鼻粘膜
第二军医大学学报001211 [摘要] 目的：通过比较豚鼠正常和变应 性鼻炎(AR)鼻粘膜中一氧化氮合酶(NOS)的分布，探讨NOS与AR的关系。方法 ：应用酶组织化学技术，以还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶(N ADPH-d)特异性地测定NOS在正常组和AR组豚鼠鼻粘膜中的分布及AR组NOS活性变化。结果：正常和AR组豚鼠鼻粘膜酶组织化学染色均有反应，AR组呈强阳性反应 ，主要分布于腺体细胞、上皮细胞及血管内皮细胞胞质。结论：正常 豚鼠鼻粘膜存在NOS，AR的鼻粘膜NOS活性明显高于正常组，提示NOS可能与AR有关 。
[中图分类号] R 765.2102 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1133-02
Histochemical changes of nitric oxide synthase in nasal mucosa of allergic rhinitis
ZHOU Wei-Dong ZHANG Ru-Xin LI Zhao-Ji
(Department of Otolaryngology， Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)
[ABSTRACT] Objective： The activity of nitric oxide synthase(NOS)in nasal mucosa of normal guinea-pigs was compared with that of allergic rhiniti s(AR)guinea-pigs to investigate the relationship between NOS and AR. Methods: Localization of NOS in nasal mucosa of normal and AR guinea-pi gs was examined by means of NADPH-diaphorase (NADPH-d) histochemical stain. [ WTHZ〗Results: Nasal mucosa of both normal and AR groups was positive f or NADPH-d, though the AR group reacted more strongly. Reaction was localized to the cytoplasm of glandular cell, epithelium and vascular endothelium. Conclusion: There is distribution of NOS in nasal mucosa of normal gui nea-pigs. The activity of NOS in guinea-pig AR model was significantly stron ger than that in normal group. NOS is related to AR.
, 百拇医药
[KEY WORDS] nitric oxide synthase; rhinitis,allergic; nasal mucosa
一氧化氮(NO)是一种具有多种而复杂生物学活性的小分子物质，新近发现它参与体内 众多的生理、病理过程。已知NO具有松弛血管平滑肌、调节血液循环、抑制血小板聚集等作 用，并被认为是一种重要的神经递质[1]。催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶(N OS)，NO的生物合成主要受NOS调节。本实验旨在探索NOS在鼻粘膜中的分布及其与变应性鼻 炎的关系。
1 材料和方法
1.1 动物分组和模型制备 豚鼠24只，雌雄不拘，体质量250 g左右(第二军医大 学实验动物中心提供)，随机分为2组，A组(n=12)为致敏组，B组(n=12) 为正常对照组。按章如新[2]报道的方法制备变应性鼻炎动物模型。致敏抗原采用 卵白蛋白(上海伯奥生物科技公司)，氢氧化铝粉末30 mg作为佐剂。腹腔内注射作为基础 致敏，再以0.25%卵白蛋白的生理盐水溶液2 ml超声雾化吸入，为强化致敏，鼻腔内再以1% 卵白蛋白20 μl激发。对照组以生理盐水代替卵白蛋白。致敏组12只有10只激发出典型的变 应性鼻炎症状，如鼻部阵发抓痒、频繁喷嚏、大量清涕，对照组仅出现轻微的抓痒和喷嚏。
, 百拇医药
1.2 病理切片制备 两组豚鼠均于30 min内断头处死，迅速取下鼻腔的背侧鼻甲 粘膜，置入10%中性甲醛液中固定，6 h后移入15%蔗糖液中过夜。鼻粘膜包埋在OCT水溶性包 埋剂 中，冰冻切片厚5 μm，分别行H-E染色和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶(N ADPH-d)组织化学染色。
1.3 酶组织化学染色 冰冻切片经0.1 mol/L 的PBS(pH7.4)冲洗后，待其干燥 ，加入含有0.8 mg/ml的NADPH四钠盐(Sigma产品)、0.6 mg/ml的硝基四氮唑蓝(NBT) 和0.3% Triton-X100的孵育液，置于37℃恒温箱内孵育1.5 h，显色后0.1 mol/L PBS冲洗 3 次，以中止反应，烘干后进行核固红衬染，使细胞核着色，常规乙醇脱水、透明、封片。对 染色强度采 用目测半定量法，即深蓝色为强阳性反应，蓝色为阳性反应，浅蓝色为弱阳性反应，着色与 背景相同为阴性反应。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 病理学变化 致敏组动物中激发出典型变应性鼻炎症状的豚鼠鼻粘膜常规H- E染色，显示为上皮内杯状细胞增多，粘膜固有层动、静脉及毛细血管不同程度地扩张，组 织水肿，间质内有嗜酸粒细胞浸润，并有多量淋巴细胞出现。正常对照组无此改变。
2.2 酶组织化学观察 正常豚鼠鼻粘膜中(图1A，见封四)可见NOS染色呈弱阳性 反应，为浅蓝色，主要分布于浆液腺、粘液腺腺细胞胞质，上皮细胞、血管内皮细胞胞质。 核固红衬染的细胞核呈红色。在致敏组豚鼠鼻粘膜中(图1B，见封四)，NOS染色呈强阳性 ，亦主要分布于上述部位，胞质蓝色极深，有的部位连同胞核区一起成为蓝色，分不出胞质 、胞核，核固红衬染后细胞核不易着色。
图1 豚鼠鼻粘膜NOS的表达(NADPH-d，×200)
Fig.1 Expression of NOS in the nasal mucosa in guinea-pigs (NADPH-d，×20)
, 百拇医药
A：Normal guinea-pig；B：Allergic rhinitis guinea-pig
3 讨论
近年来，越来越多的研究表明NO在维持鼻腔正常功能方面发挥重要作用。除了调节鼻粘 膜的血流、分泌和纤毛运动外，还具有抗菌和抗病毒作用，在不同条件下，NO可表现为细胞 保护和细胞毒性双重效应。正常人经鼻腔雾化吸入NO供体硝普钠后，除了呼出的NO气体浓度 明显提高外，鼻腔粘膜血流量和纤毛活性也显著增加。变应性鼻炎患者呼出的NO气体浓度明 显高于正常组[3]。
Hope等[4]于1991年证实，NOS和NADPH-d属同类物质，NADPH-d在体内的分布和活 性可作为NOS在体内的定位和活性的一种标志，因而NADPH-d染色提供了直接观察NOS在鼻粘 膜特异性定位的方法。Hanazawa等[5]于1997年用NADPH-d法证明正常人鼻粘膜 中存在NOS阳性纤维分布，并发现翼腭神经节的神经元亦为阳性反应。
, 百拇医药
本研究结果表明：(1) NOS分布于正常豚鼠鼻粘膜腺体细胞、上皮细胞、血管内皮细 胞的胞质内，这和Furukawa等[6]论证的正常人和慢性鼻炎患者鼻粘膜上NOS 的分布部位相一致，说明NO参与鼻腔正常生理功能的调节。(2) 在致敏成功的豚鼠模型鼻 粘膜中，上述部位的NOS染色明显加深，提示NOS表达增加，导致随后的NO释放增多，为NO参 与变应性鼻炎提供了依据。
随着对NO在生物体内生理、病理作用的逐步发现，为许多生命过程和病理现象增添了新的认 识 ，同样对认识鼻腔的生理功能和鼻腔疾患的发病机制也将有更深刻的意义。变应性鼻炎在临 床上是一种最常见的变态反应性疾病，尽管已证明与多种炎性介质有关，如组胺、缓激肽等 ，但上述活性物质的拮抗剂并不能完全控制变应性鼻炎的症状[7]。迄今变应性鼻 炎的发病机制尚未完全被揭示，然而对神经肽及NO参与变应性鼻炎病理过程的认识将具有重 要意义[8]。本研究结果提示NOS与鼻腔生理功能的调节以及变应性鼻炎的发病有关 ，但NOS如何对鼻粘膜的腺体分泌、血液循环进行调节的复杂机制尚有待进一步探索。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(3960777)；上海市“百人计划”部分资助(98BR003).
[作者简介] 周卫东(1968-)，男(汉族)，硕士，主治医师.
参考文献
[1] Moilanen E, Vapaatalo H. Nitric oxide in inflammation and im mune response[J]. Ann Med,1995,27(4):359-367.
[2] 章如新，江德胜，李兆基. P物质能神经阻滞剂治疗变应性鼻炎的实验研究[J ].中华耳鼻咽喉科杂志，1994，29(5)：282-285.
[3] Kharitonov SA, Rajakulasingam K, O'Connor B, et al. Nasal nitric oxide is increased in patients with asthma and allergic rhinitis and may be modu lated by nasal glucocorticoids[J]. J Allergy Clin Immunol， 1997,99(1 Pt 1):58 -64.
, 百拇医药
[4] Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, et al. Neuroal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(7):2811-2814.
[5] Hanazawa T, Tanaka K, Chiba T, et al. Distribution and origin of nitric oxide synthase-containing nerve fibers in human nasal mucosa[J]. Acta Otolaryngol Stockh， 1997,117(5):735-737.
[6] Furukawa K, Harrison DG, Saleh D, et al. Expression of nitric oxi de synthase in the human nasal mucosa[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1996,153 (3):847-850.
[7] 章如新, 董 震. P物质与变应性鼻炎[J]. 国外医学*耳鼻喉科学分册, 1993,17(3):158-160.
[8] 周卫东, 章如新. 一氧化氮在鼻科的进展[J].国外医学*耳鼻喉科学分册, 1 999,23(2):86-89.
[收稿日期] 2000-03-27
[修回日期] 2000-08-03, 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海 200433
关键词：一氧化氮合酶；鼻炎；变应性；鼻粘膜
第二军医大学学报001211 [摘要] 目的：通过比较豚鼠正常和变应 性鼻炎(AR)鼻粘膜中一氧化氮合酶(NOS)的分布，探讨NOS与AR的关系。方法 ：应用酶组织化学技术，以还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶(N ADPH-d)特异性地测定NOS在正常组和AR组豚鼠鼻粘膜中的分布及AR组NOS活性变化。结果：正常和AR组豚鼠鼻粘膜酶组织化学染色均有反应，AR组呈强阳性反应 ，主要分布于腺体细胞、上皮细胞及血管内皮细胞胞质。结论：正常 豚鼠鼻粘膜存在NOS，AR的鼻粘膜NOS活性明显高于正常组，提示NOS可能与AR有关 。
[中图分类号] R 765.2102 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1133-02
Histochemical changes of nitric oxide synthase in nasal mucosa of allergic rhinitis
ZHOU Wei-Dong ZHANG Ru-Xin LI Zhao-Ji
(Department of Otolaryngology， Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)
[ABSTRACT] Objective： The activity of nitric oxide synthase(NOS)in nasal mucosa of normal guinea-pigs was compared with that of allergic rhiniti s(AR)guinea-pigs to investigate the relationship between NOS and AR. Methods: Localization of NOS in nasal mucosa of normal and AR guinea-pi gs was examined by means of NADPH-diaphorase (NADPH-d) histochemical stain. [ WTHZ〗Results: Nasal mucosa of both normal and AR groups was positive f or NADPH-d, though the AR group reacted more strongly. Reaction was localized to the cytoplasm of glandular cell, epithelium and vascular endothelium. Conclusion: There is distribution of NOS in nasal mucosa of normal gui nea-pigs. The activity of NOS in guinea-pig AR model was significantly stron ger than that in normal group. NOS is related to AR.
, 百拇医药
[KEY WORDS] nitric oxide synthase; rhinitis,allergic; nasal mucosa
一氧化氮(NO)是一种具有多种而复杂生物学活性的小分子物质，新近发现它参与体内 众多的生理、病理过程。已知NO具有松弛血管平滑肌、调节血液循环、抑制血小板聚集等作 用，并被认为是一种重要的神经递质[1]。催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶(N OS)，NO的生物合成主要受NOS调节。本实验旨在探索NOS在鼻粘膜中的分布及其与变应性鼻 炎的关系。
1 材料和方法
1.1 动物分组和模型制备 豚鼠24只，雌雄不拘，体质量250 g左右(第二军医大 学实验动物中心提供)，随机分为2组，A组(n=12)为致敏组，B组(n=12) 为正常对照组。按章如新[2]报道的方法制备变应性鼻炎动物模型。致敏抗原采用 卵白蛋白(上海伯奥生物科技公司)，氢氧化铝粉末30 mg作为佐剂。腹腔内注射作为基础 致敏，再以0.25%卵白蛋白的生理盐水溶液2 ml超声雾化吸入，为强化致敏，鼻腔内再以1% 卵白蛋白20 μl激发。对照组以生理盐水代替卵白蛋白。致敏组12只有10只激发出典型的变 应性鼻炎症状，如鼻部阵发抓痒、频繁喷嚏、大量清涕，对照组仅出现轻微的抓痒和喷嚏。
, 百拇医药
1.2 病理切片制备 两组豚鼠均于30 min内断头处死，迅速取下鼻腔的背侧鼻甲 粘膜，置入10%中性甲醛液中固定，6 h后移入15%蔗糖液中过夜。鼻粘膜包埋在OCT水溶性包 埋剂 中，冰冻切片厚5 μm，分别行H-E染色和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶(N ADPH-d)组织化学染色。
1.3 酶组织化学染色 冰冻切片经0.1 mol/L 的PBS(pH7.4)冲洗后，待其干燥 ，加入含有0.8 mg/ml的NADPH四钠盐(Sigma产品)、0.6 mg/ml的硝基四氮唑蓝(NBT) 和0.3% Triton-X100的孵育液，置于37℃恒温箱内孵育1.5 h，显色后0.1 mol/L PBS冲洗 3 次，以中止反应，烘干后进行核固红衬染，使细胞核着色，常规乙醇脱水、透明、封片。对 染色强度采 用目测半定量法，即深蓝色为强阳性反应，蓝色为阳性反应，浅蓝色为弱阳性反应，着色与 背景相同为阴性反应。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 病理学变化 致敏组动物中激发出典型变应性鼻炎症状的豚鼠鼻粘膜常规H- E染色，显示为上皮内杯状细胞增多，粘膜固有层动、静脉及毛细血管不同程度地扩张，组 织水肿，间质内有嗜酸粒细胞浸润，并有多量淋巴细胞出现。正常对照组无此改变。
2.2 酶组织化学观察 正常豚鼠鼻粘膜中(图1A，见封四)可见NOS染色呈弱阳性 反应，为浅蓝色，主要分布于浆液腺、粘液腺腺细胞胞质，上皮细胞、血管内皮细胞胞质。 核固红衬染的细胞核呈红色。在致敏组豚鼠鼻粘膜中(图1B，见封四)，NOS染色呈强阳性 ，亦主要分布于上述部位，胞质蓝色极深，有的部位连同胞核区一起成为蓝色，分不出胞质 、胞核，核固红衬染后细胞核不易着色。
图1 豚鼠鼻粘膜NOS的表达(NADPH-d，×200)
Fig.1 Expression of NOS in the nasal mucosa in guinea-pigs (NADPH-d，×20)
, 百拇医药
A：Normal guinea-pig；B：Allergic rhinitis guinea-pig
3 讨论
近年来，越来越多的研究表明NO在维持鼻腔正常功能方面发挥重要作用。除了调节鼻粘 膜的血流、分泌和纤毛运动外，还具有抗菌和抗病毒作用，在不同条件下，NO可表现为细胞 保护和细胞毒性双重效应。正常人经鼻腔雾化吸入NO供体硝普钠后，除了呼出的NO气体浓度 明显提高外，鼻腔粘膜血流量和纤毛活性也显著增加。变应性鼻炎患者呼出的NO气体浓度明 显高于正常组[3]。
Hope等[4]于1991年证实，NOS和NADPH-d属同类物质，NADPH-d在体内的分布和活 性可作为NOS在体内的定位和活性的一种标志，因而NADPH-d染色提供了直接观察NOS在鼻粘 膜特异性定位的方法。Hanazawa等[5]于1997年用NADPH-d法证明正常人鼻粘膜 中存在NOS阳性纤维分布，并发现翼腭神经节的神经元亦为阳性反应。
, 百拇医药
本研究结果表明：(1) NOS分布于正常豚鼠鼻粘膜腺体细胞、上皮细胞、血管内皮细 胞的胞质内，这和Furukawa等[6]论证的正常人和慢性鼻炎患者鼻粘膜上NOS 的分布部位相一致，说明NO参与鼻腔正常生理功能的调节。(2) 在致敏成功的豚鼠模型鼻 粘膜中，上述部位的NOS染色明显加深，提示NOS表达增加，导致随后的NO释放增多，为NO参 与变应性鼻炎提供了依据。
随着对NO在生物体内生理、病理作用的逐步发现，为许多生命过程和病理现象增添了新的认 识 ，同样对认识鼻腔的生理功能和鼻腔疾患的发病机制也将有更深刻的意义。变应性鼻炎在临 床上是一种最常见的变态反应性疾病，尽管已证明与多种炎性介质有关，如组胺、缓激肽等 ，但上述活性物质的拮抗剂并不能完全控制变应性鼻炎的症状[7]。迄今变应性鼻 炎的发病机制尚未完全被揭示，然而对神经肽及NO参与变应性鼻炎病理过程的认识将具有重 要意义[8]。本研究结果提示NOS与鼻腔生理功能的调节以及变应性鼻炎的发病有关 ，但NOS如何对鼻粘膜的腺体分泌、血液循环进行调节的复杂机制尚有待进一步探索。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(3960777)；上海市“百人计划”部分资助(98BR003).
[作者简介] 周卫东(1968-)，男(汉族)，硕士，主治医师.
参考文献
[1] Moilanen E, Vapaatalo H. Nitric oxide in inflammation and im mune response[J]. Ann Med,1995,27(4):359-367.
[2] 章如新，江德胜，李兆基. P物质能神经阻滞剂治疗变应性鼻炎的实验研究[J ].中华耳鼻咽喉科杂志，1994，29(5)：282-285.
[3] Kharitonov SA, Rajakulasingam K, O'Connor B, et al. Nasal nitric oxide is increased in patients with asthma and allergic rhinitis and may be modu lated by nasal glucocorticoids[J]. J Allergy Clin Immunol， 1997,99(1 Pt 1):58 -64.
, 百拇医药
[4] Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, et al. Neuroal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(7):2811-2814.
[5] Hanazawa T, Tanaka K, Chiba T, et al. Distribution and origin of nitric oxide synthase-containing nerve fibers in human nasal mucosa[J]. Acta Otolaryngol Stockh， 1997,117(5):735-737.
[6] Furukawa K, Harrison DG, Saleh D, et al. Expression of nitric oxi de synthase in the human nasal mucosa[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1996,153 (3):847-850.
[7] 章如新, 董 震. P物质与变应性鼻炎[J]. 国外医学*耳鼻喉科学分册, 1993,17(3):158-160.
[8] 周卫东, 章如新. 一氧化氮在鼻科的进展[J].国外医学*耳鼻喉科学分册, 1 999,23(2):86-89.
[收稿日期] 2000-03-27
[修回日期] 2000-08-03, 百拇医药