汞对雌性小鼠生殖功能及脏器的影响
作者：沈维干 陈彦 李朝军 季全兰 贡昌春 荀爱华 陈兰
单位：沈维干(扬州大学医学院，扬州 225001)；季全兰(扬州大学医学院，扬州 225001)；贡昌春(扬州大学医学院，扬州 225001)；荀爱华(扬州大学医学院，扬州 225001)；陈兰(扬州大学医学院，扬州 225001)；陈彦(徐州医学院生物学教研室)；李朝军(南京师范大学生命科学学院)
关键词：氯化汞；卵母细胞；生发泡破裂；第一极体；体外受精
摘 要摘 要：为探讨汞化合物对脏器及生殖的毒性，采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了汞对小鼠脏器系数、卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果表明，0.5和1.5mg/kg BW汞对小鼠的肝脏、肾脏有明显的毒性作用，1.5mg/kg BW组还对卵巢有明显的毒性作用，并能显著降低超排卵的卵母细胞数；汞对体内卵母细胞生发泡破裂没有影响，但可以抑制卵母细胞第一极体的释放，影响卵母细胞的存活率并降低体外受精(IVF)率。结果提示，氯化汞可以影响卵母细胞的成熟，明显破坏卵母细胞的体外受精能力，损伤或降低小鼠的生殖能力。
, http://www.100md.com
分类号：Q593 Q132.7 O614.243 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0075-03
Effect of mercury chloride on the reproductive function
and visceral organ of female mouse
Shen Weigan Chen Yan Li Chaojun Ji Quanlan，et al.
(Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China)
Abstract：In this paper the effects of mercury chloride on the coefficient of visceral organ of mouse and the meiotic maturation and the fertilization ability of mouse oocyte were studied by in vitro culture and in vitro fertilization (IVF) of mouse oocytes，etc.The results showed that mercury chloride (0.5 and 1.5mg/kg BW) had obviously toxicity to the liver and the kidney of mouse, and the dose of 1.5mg/kg BW could damage the ovary function and reduce the number of superovulation oocytes.The results also showed that mercury chloride could inhibit the extruding of the first polar body and affect the quality and the viability of mouse oocyte and reduce the rate of IVF，but little impact on germinal vesicle breakdown (GVBD) of mouse oocyte in vivo.The results indicated that mercury chloride could affect the meiotic maturation of mouse oocyte，obviously block the IVF and injury or make a reduction of reproductive capacity of mouse.
, 百拇医药
Key words： mercury chloride，oocyte，germinal vesicle breakdown，the first polar body
汞是生命非必需元素，汞化合物广泛分布于自然界。国内外对汞的毒性作用进行了大量的研究，证实汞对细胞的每一种生长过程都有重要影响。汞对动物的神经系统、肝、肾组织均有明显的毒性损伤作用；汞化合物具有较强的致畸性，并可以引起染色体畸变。汞中毒引起胎儿水俣病早就引起人们广泛的关注[1]。一些学者的研究证实，氯化甲基汞对卵巢细胞周期及细胞内DNA的合成具有抑制作用；甲基汞对动物的生殖系统具有毒性作用[2]。为了进一步探讨汞化合物的生殖毒性，我们采用给小鼠腹腔注射氯化汞后取出卵母细胞进行体外培养、体外受精(in vitro fertilization，IVF)以及直接取出卵母细胞进行体外培养的方法[3，4]，研究了汞对雌性小鼠脏器、卵母细胞的成熟、减数分裂以及受精能力的影响，探讨汞对动物生殖细胞的危害，并研究危害的可能机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养液 培养液为DMEM(低糖)+BSA(Sigma产品)；体外受精是在TYH液中进行；胚胎细胞培养是在CZB+谷氨酰胺(Sigma产品)中进行；工作液为M2和M2+次黄嘌呤(用以抑制卵母细胞的自发成熟)。
1.1.2 氯化汞(HgCl2)透明质酸酶、矿物油(均为Sigma产品)，孕马血清促性腺激素(PMSG，天津激素厂)，人绒毛膜促性腺激素(hCG，南大制药厂)。
1.1.3 实验动物 为21天龄的雌性ICR小鼠(南京铁道医学院动物中心提供，普通级，合格证号为苏动质第97002号)。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 小鼠在体实验和IVF实验 设立空白对照组、0.5和1.5mg/kg BW的HgCl2实验组，连续腹腔注射3天，每只鼠处死前62～65h腹腔注射5IU的PMSG促使卵泡发育，48h后腹腔注射hCG进行超排卵，hCG作用14～17h后，一部分按李朝军等的方法获取卵母细胞并进行IVF[3]，24h后观察受精情况，受精率以2-细胞胚胎数(或3-细胞以上胚胎数)占成熟卵母细胞(排出第一极体)的比例计算；另一部分用吸卵管将带有大量颗粒细胞的卵母细胞移入含透明质酸酶(150IU/ml)的培养液中，室温放置15min，待颗粒细胞从卵母细胞上脱落下来，用吸卵管反复吹打后移入DMEM+BSA的培养液中立即在倒置显微镜下观察并记录比较各组卵母细胞的发育情况，计算小鼠平均超排卵母细胞数，接着继续培养，按不同间隔时间观察结果；各组小鼠分别剪取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、卵巢称重，并计算各脏器系数(以各脏器的重量占小鼠的体重的比例来表示，单位是：mg/g BW)。
1.2.2 卵母细胞的获取和培养 正常小鼠经PMSG腹腔注射48h后，按李朝军等的方法取出生发泡完整饱满的卵母细胞，置于覆盖有矿物油的50μl的0.5和1.5mg/L的HgCl2培养液微滴中培养[3]，以卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)作为减数分裂启动的标志，第一极体释放为第一次减数分裂完成的标志，实验结果记录8h时的GVBD率，24h时记录卵母细胞的第一极体的释放率和卵母细胞的存活率。
, 百拇医药
上述体外受精和细胞培养均是在37℃、5%CO2、湿度饱和的CO2培养箱中进行。
小鼠脏器系数、平均超排卵母细胞数采用t检验进行统计学处理，受精率、GVBD率、第一极体释放率和卵母细胞存活率采用χ2检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 汞对小鼠脏器系数的影响
由表1可见，0.5mg/kg BW组小鼠的心脏、脾脏和卵巢的脏器系数与对照组相比差异无显著性意义，肾脏和肝脏的脏器系数与对照组相比差异有显著性意义(肝脏t=2.957、肾脏t=3.749，v=5，P<0.05)；1.5mg/kg BW组的心脏、脾脏的脏器系数与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)，卵巢的脏器系数与对照组相比差异有显著性意义(t=3.020，v=5，P<0.05)，而肝脏和肾脏的脏器系数与对照组相比差异有极显著性意义(肝脏t=4.183、肾脏t=4.676，v=5，P<0.01)。
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表1 腹腔注射HgCl2对小鼠脏器系数的影响(
±s)
mg/g BW
组别
心脏
肝脏
肾肝
脾脏
卵巢
对照组
6.40±1.83
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46.39±4.84
12.18±1.17
4.89±0.80
0.38±0.12
0.5mg/kg BW组
6.34±1.30(1)
59.10±6.95(2)
14.72±1.62(2)
4.45±0.60(1)
0.52±0.15(1)
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1.5mg/kg BW组
5.53±0.66(1)
60.82±4.05(3)
15.72±1.81(3)
4.45±0.59(1)
0.60±0.15(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.05 (3)P<0.012.2 汞对卵母细胞成熟的影响
由表2可见，实验组的GVBD率与对照组无差异；0.5mg/kg BW组的超排卵母细胞数与对照组相比差异无显著性意义(t=1.287，v=5，P>0.05)，1.5mg/kg BW组的超排卵母细胞数下降有显著性意义(t=2.605，v=5，P<0.05)；2个剂量组的第一极体释放率在不同时间间隔与对照组相比有显著性意义的下降(0.5mg/kg BW组χ2值分别是12.625、32.386、14.333，1.5mg/kg BW组χ2值分别是24.195、82.888、36.444，P<0.01)，然而随着培养时间的延续，实验组的第一极释放率在48h时与0h相比提高均有极显著性意义(0.5mg/kg BW组χ2=12.971，1.5mg/kg BW组χ2=15.169，P<0.01)；HgCl2对卵母细胞存活率(以细胞饱满透明、颗粒分布均匀、透明带规则透明有光泽的卵母细胞数占总卵母细胞数的比例表示)的影响，尽管对照组随培养时间的延长存活率显著性下降(这种下降可能是由于随着培养时间的延长，培养液中的营养物质逐渐减少，而影响细胞的生长所致)，但是各剂量组在相同间隔时间内的卵母细胞存活率与对照组相比有极显著性意义的下降(0.5mg/kg BW组χ2值分别是31.758、33.758、27.516，1.5mg/kg BW组χ2值分别是23.481、36.418、59.756，P<0.01)。
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表2 腹腔注射HgCl2对卵母细胞的影响
组 别
t/h
超排卵的卵母细胞数
总卵母细
胞数(个)
生发泡破
裂率(%)
第一极体释
放率(%)
卵母细胞存活率
(%)
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对照组
0
39.17±2.64
122
100
45.08
95.90
24
39.14±2.64
127
100
73.23
85.83
, 百拇医药
48
39.14±2.64
113
100
76.11
67.26
0.5mg/kg BW组
0
37.33±1.03(1)
130
100
23.85(2)
, 百拇医药
68.46(2)
24
37.33±1.03(1)
125
100
37.60(2)
52.00(2)
48
37.33±1.03(1)
131
100
, http://www.100md.com
45.04(2，3)
33.59(2)
1.5mg/kg BW组
0
34.67±2.94(2)
136
100
16.91(2)
64.71(2)
24
34.67±2.94(2)
, 百拇医药
137
100
17.52(2)
51.09(2)
48
34.67±2.94(2)
137
100
37.96(2，3)
18.98(2)
注：(1)与对照组相比P<0.05 (2)与同一时间的对照组相比P<0.01 (3)与本组0h相比P<0.01
, 百拇医药
2.3 汞对卵母细胞体外受精的影响
由表3可见，实验组的IVF率与对照组相比下降有极显著性意义(0.5mg/kg BW组χ2值分别是96.222、89.048，1.5mg/kg BW组χ2=75.909，P<0.01)。
表3 HgCl2对小鼠卵母细胞体外受精的影响
组别
t/h
卵母
细胞数
2-细胞
胚胎率
, 百拇医药
(%)
3-细胞以
上胚胎率
(%)
总受
精率
(%)
对照组
24
83
69.88
0
69.88
, http://www.100md.com
48
83
20.48
49.40
69.88
72
83
8.43
61.45
69.88
0.5mg/kg BW组
24
97
, 百拇医药
1.03
0
1.03(1)
48
97
2.06
1.03
3.09(1)
72
97
2.06
1.03
3.09(1)
, 百拇医药
1.5mg/kg BW组
24
71
1.41
0
1.41(1)
48
71
1.41
0
1.41(1)
72
, 百拇医药 71
1.41
0
1.41(1)
注：(1)与对照组相比P<0.01
2.4 汞对体外培养卵母细胞的影响
由表4可见，在培养8h时实验组与对照组相比能显著地抑制卵母细胞的GVBD率(0.5mg/kg BW组χ2=10.084，1.5mg/kg BW组χ2=7.446，P<0.01)，但是随着培养时间的延续，这种抑制作用逐渐减小；2个实验组24h时均能显著性地降低卵母细胞第一极体的释放率(0.5mg/kg BW组χ2=29.491，1.5mg/kg BW组χ2=30.164，P<0.01)和卵母细胞的体外存活率(0.5mg/kg BW组χ2=5.921，P<0.05，1.5mg/kg BW组χ2=23.649，P<0.01)。
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表4 HgCl2对体外培养卵母细胞的影响
组 别
总卵母
细胞数
(个)
生发泡
破裂率
(%)
第一极体
释放率
(%)
卵母细胞
存活率
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(%)
对照组
70
98.57
70.00
85.71
0.5mg/L组
84
83.33(2)
26.19(2)
69.05(1)
1.5mg/L组
, 百拇医药
74
86.49(2)
24.32(2)
47.30(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01
3 讨论
既往动物实验结果显示，高剂量的汞增加了生殖紊乱的风险，如不孕、自发流产、死产和先天畸形等[5]。本实验结果显示，腹腔注射HgCl2对在体卵母细胞的GVBD无影响，但可以抑制第一极体的释放，并可降低IVF率，随着卵母细胞体外培养的进行，HgCl2对第一极体的抑制作用逐渐解除，恢复细胞分裂，第一极体释放率明显提高，说明HgCl2对第一极体释放的抑制作用可能是可逆的或者仅仅是延迟了减数分裂的过程，但是由于IVF率并没有增加，说明HgCl2能损害卵母细胞的受精能力。2个实验组对小鼠的肝脏和肾脏都有明显的毒性作用，与文献相符[1]，且表现为明显的剂量-效应关系，0.5mg/kg BW组对卵巢和超排卵母细胞数无影响，1.5m/kg BW组不仅可以显著性地降低超排卵母细胞数，而且对卵巢也有明显的毒性作用。实验组对正常超排后进行体外培养卵母细胞的GVBD率在15h时与对照组相比有显著性降低，随着培养时间的延长，GVBD率又能逐渐恢复。HgCl2也能明显地抑制体外培养卵母细胞第一极体的释放，降低卵母细胞的存活率，进一步说明HgCl2不仅对卵母细胞的受精能力有损伤作用，而且对卵母细胞的质量和存活都有明显的破坏作用。HgCl2对卵母细胞第一极体释放的抑制作用可能是由于汞作为细胞内的一种微管合成的抑制剂，能抑制微管的组装和聚合，使纺锤体、有丝分裂器不能正常形成和移动，细胞分裂无法正常进行，第一极体不能形成，无法进入第二次减数分裂，卵细胞不能正常受精，从而导致IVF率下降。汞对卵巢、肝脏、肾脏等脏器的毒性作用以及对卵母细胞的存活率和IVF率的不可逆地降低，说明汞的毒性作用的机制非常复杂，而在正常培养基中培养的卵母细胞第一极体的释放率随着培养时间的延续而显著提高，说明汞对卵母细胞成熟的抑制是可逆的或者仅是延迟了减数分裂的进行，提示育龄妇女接触汞及其化合物后，只要停止接触污染物，其生殖细胞的成熟仍然可以恢复正常。本研究显示，汞可以破坏或抑制卵母细胞的减数分裂过程，降低卵母细胞的受精能力和存活率，提示育龄妇女接触汞及其化合物会导致生育能力降低，甚至造成不育或不孕。
, 百拇医药
基金项目：江苏省自然科学基金(BK99064)
作者简介：沈维干，男，硕士，讲师
参考文献：
[1]王夔主编.生命科学中的微量元素.上卷.北京：中国计量出版社，1992.147—173
[2]李景舜，赵淑华，金明华，等.氯化甲基汞对小鼠卵巢细胞周期的影响.环境与健康杂志，1997，14(6)：252—253
[3李朝军，吴海涛，蔡霞华，等.香烟烟雾水溶物对小鼠卵母细胞体外减数分裂的影响.中国环境科学，1997，17(4)：312—315
[4]李朝军，王斌，范必勤，等.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究.南京大学学报(自然科学版)，1997，33(2)：265—272
[5]Schuurs AH.Reproductive toxicity of occupational mercury:a review of the literature. J Dent，1999，27(4):249—256
收稿日期：1999-06-18, http://www.100md.com
单位：沈维干(扬州大学医学院，扬州 225001)；季全兰(扬州大学医学院，扬州 225001)；贡昌春(扬州大学医学院，扬州 225001)；荀爱华(扬州大学医学院，扬州 225001)；陈兰(扬州大学医学院，扬州 225001)；陈彦(徐州医学院生物学教研室)；李朝军(南京师范大学生命科学学院)
关键词：氯化汞；卵母细胞；生发泡破裂；第一极体；体外受精
摘 要摘 要：为探讨汞化合物对脏器及生殖的毒性，采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了汞对小鼠脏器系数、卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果表明，0.5和1.5mg/kg BW汞对小鼠的肝脏、肾脏有明显的毒性作用，1.5mg/kg BW组还对卵巢有明显的毒性作用，并能显著降低超排卵的卵母细胞数；汞对体内卵母细胞生发泡破裂没有影响，但可以抑制卵母细胞第一极体的释放，影响卵母细胞的存活率并降低体外受精(IVF)率。结果提示，氯化汞可以影响卵母细胞的成熟，明显破坏卵母细胞的体外受精能力，损伤或降低小鼠的生殖能力。
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分类号：Q593 Q132.7 O614.243 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0075-03
Effect of mercury chloride on the reproductive function
and visceral organ of female mouse
Shen Weigan Chen Yan Li Chaojun Ji Quanlan，et al.
(Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China)
Abstract：In this paper the effects of mercury chloride on the coefficient of visceral organ of mouse and the meiotic maturation and the fertilization ability of mouse oocyte were studied by in vitro culture and in vitro fertilization (IVF) of mouse oocytes，etc.The results showed that mercury chloride (0.5 and 1.5mg/kg BW) had obviously toxicity to the liver and the kidney of mouse, and the dose of 1.5mg/kg BW could damage the ovary function and reduce the number of superovulation oocytes.The results also showed that mercury chloride could inhibit the extruding of the first polar body and affect the quality and the viability of mouse oocyte and reduce the rate of IVF，but little impact on germinal vesicle breakdown (GVBD) of mouse oocyte in vivo.The results indicated that mercury chloride could affect the meiotic maturation of mouse oocyte，obviously block the IVF and injury or make a reduction of reproductive capacity of mouse.
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Key words： mercury chloride，oocyte，germinal vesicle breakdown，the first polar body
汞是生命非必需元素，汞化合物广泛分布于自然界。国内外对汞的毒性作用进行了大量的研究，证实汞对细胞的每一种生长过程都有重要影响。汞对动物的神经系统、肝、肾组织均有明显的毒性损伤作用；汞化合物具有较强的致畸性，并可以引起染色体畸变。汞中毒引起胎儿水俣病早就引起人们广泛的关注[1]。一些学者的研究证实，氯化甲基汞对卵巢细胞周期及细胞内DNA的合成具有抑制作用；甲基汞对动物的生殖系统具有毒性作用[2]。为了进一步探讨汞化合物的生殖毒性，我们采用给小鼠腹腔注射氯化汞后取出卵母细胞进行体外培养、体外受精(in vitro fertilization，IVF)以及直接取出卵母细胞进行体外培养的方法[3，4]，研究了汞对雌性小鼠脏器、卵母细胞的成熟、减数分裂以及受精能力的影响，探讨汞对动物生殖细胞的危害，并研究危害的可能机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养液 培养液为DMEM(低糖)+BSA(Sigma产品)；体外受精是在TYH液中进行；胚胎细胞培养是在CZB+谷氨酰胺(Sigma产品)中进行；工作液为M2和M2+次黄嘌呤(用以抑制卵母细胞的自发成熟)。
1.1.2 氯化汞(HgCl2)透明质酸酶、矿物油(均为Sigma产品)，孕马血清促性腺激素(PMSG，天津激素厂)，人绒毛膜促性腺激素(hCG，南大制药厂)。
1.1.3 实验动物 为21天龄的雌性ICR小鼠(南京铁道医学院动物中心提供，普通级，合格证号为苏动质第97002号)。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 小鼠在体实验和IVF实验 设立空白对照组、0.5和1.5mg/kg BW的HgCl2实验组，连续腹腔注射3天，每只鼠处死前62～65h腹腔注射5IU的PMSG促使卵泡发育，48h后腹腔注射hCG进行超排卵，hCG作用14～17h后，一部分按李朝军等的方法获取卵母细胞并进行IVF[3]，24h后观察受精情况，受精率以2-细胞胚胎数(或3-细胞以上胚胎数)占成熟卵母细胞(排出第一极体)的比例计算；另一部分用吸卵管将带有大量颗粒细胞的卵母细胞移入含透明质酸酶(150IU/ml)的培养液中，室温放置15min，待颗粒细胞从卵母细胞上脱落下来，用吸卵管反复吹打后移入DMEM+BSA的培养液中立即在倒置显微镜下观察并记录比较各组卵母细胞的发育情况，计算小鼠平均超排卵母细胞数，接着继续培养，按不同间隔时间观察结果；各组小鼠分别剪取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、卵巢称重，并计算各脏器系数(以各脏器的重量占小鼠的体重的比例来表示，单位是：mg/g BW)。
1.2.2 卵母细胞的获取和培养 正常小鼠经PMSG腹腔注射48h后，按李朝军等的方法取出生发泡完整饱满的卵母细胞，置于覆盖有矿物油的50μl的0.5和1.5mg/L的HgCl2培养液微滴中培养[3]，以卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)作为减数分裂启动的标志，第一极体释放为第一次减数分裂完成的标志，实验结果记录8h时的GVBD率，24h时记录卵母细胞的第一极体的释放率和卵母细胞的存活率。
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上述体外受精和细胞培养均是在37℃、5%CO2、湿度饱和的CO2培养箱中进行。
小鼠脏器系数、平均超排卵母细胞数采用t检验进行统计学处理，受精率、GVBD率、第一极体释放率和卵母细胞存活率采用χ2检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 汞对小鼠脏器系数的影响
由表1可见，0.5mg/kg BW组小鼠的心脏、脾脏和卵巢的脏器系数与对照组相比差异无显著性意义，肾脏和肝脏的脏器系数与对照组相比差异有显著性意义(肝脏t=2.957、肾脏t=3.749，v=5，P<0.05)；1.5mg/kg BW组的心脏、脾脏的脏器系数与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)，卵巢的脏器系数与对照组相比差异有显著性意义(t=3.020，v=5，P<0.05)，而肝脏和肾脏的脏器系数与对照组相比差异有极显著性意义(肝脏t=4.183、肾脏t=4.676，v=5，P<0.01)。
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表1 腹腔注射HgCl2对小鼠脏器系数的影响(
±s)mg/g BW
组别
心脏
肝脏
肾肝
脾脏
卵巢
对照组
6.40±1.83
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46.39±4.84
12.18±1.17
4.89±0.80
0.38±0.12
0.5mg/kg BW组
6.34±1.30(1)
59.10±6.95(2)
14.72±1.62(2)
4.45±0.60(1)
0.52±0.15(1)
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1.5mg/kg BW组
5.53±0.66(1)
60.82±4.05(3)
15.72±1.81(3)
4.45±0.59(1)
0.60±0.15(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.05 (3)P<0.012.2 汞对卵母细胞成熟的影响
由表2可见，实验组的GVBD率与对照组无差异；0.5mg/kg BW组的超排卵母细胞数与对照组相比差异无显著性意义(t=1.287，v=5，P>0.05)，1.5mg/kg BW组的超排卵母细胞数下降有显著性意义(t=2.605，v=5，P<0.05)；2个剂量组的第一极体释放率在不同时间间隔与对照组相比有显著性意义的下降(0.5mg/kg BW组χ2值分别是12.625、32.386、14.333，1.5mg/kg BW组χ2值分别是24.195、82.888、36.444，P<0.01)，然而随着培养时间的延续，实验组的第一极释放率在48h时与0h相比提高均有极显著性意义(0.5mg/kg BW组χ2=12.971，1.5mg/kg BW组χ2=15.169，P<0.01)；HgCl2对卵母细胞存活率(以细胞饱满透明、颗粒分布均匀、透明带规则透明有光泽的卵母细胞数占总卵母细胞数的比例表示)的影响，尽管对照组随培养时间的延长存活率显著性下降(这种下降可能是由于随着培养时间的延长，培养液中的营养物质逐渐减少，而影响细胞的生长所致)，但是各剂量组在相同间隔时间内的卵母细胞存活率与对照组相比有极显著性意义的下降(0.5mg/kg BW组χ2值分别是31.758、33.758、27.516，1.5mg/kg BW组χ2值分别是23.481、36.418、59.756，P<0.01)。
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表2 腹腔注射HgCl2对卵母细胞的影响
组 别
t/h
超排卵的卵母细胞数
总卵母细
胞数(个)
生发泡破
裂率(%)
第一极体释
放率(%)
卵母细胞存活率
(%)
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对照组
0
39.17±2.64
122
100
45.08
95.90
24
39.14±2.64
127
100
73.23
85.83
, 百拇医药
48
39.14±2.64
113
100
76.11
67.26
0.5mg/kg BW组
0
37.33±1.03(1)
130
100
23.85(2)
, 百拇医药
68.46(2)
24
37.33±1.03(1)
125
100
37.60(2)
52.00(2)
48
37.33±1.03(1)
131
100
, http://www.100md.com
45.04(2，3)
33.59(2)
1.5mg/kg BW组
0
34.67±2.94(2)
136
100
16.91(2)
64.71(2)
24
34.67±2.94(2)
, 百拇医药
137
100
17.52(2)
51.09(2)
48
34.67±2.94(2)
137
100
37.96(2，3)
18.98(2)
注：(1)与对照组相比P<0.05 (2)与同一时间的对照组相比P<0.01 (3)与本组0h相比P<0.01
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2.3 汞对卵母细胞体外受精的影响
由表3可见，实验组的IVF率与对照组相比下降有极显著性意义(0.5mg/kg BW组χ2值分别是96.222、89.048，1.5mg/kg BW组χ2=75.909，P<0.01)。
表3 HgCl2对小鼠卵母细胞体外受精的影响
组别
t/h
卵母
细胞数
2-细胞
胚胎率
, 百拇医药
(%)
3-细胞以
上胚胎率
(%)
总受
精率
(%)
对照组
24
83
69.88
0
69.88
, http://www.100md.com
48
83
20.48
49.40
69.88
72
83
8.43
61.45
69.88
0.5mg/kg BW组
24
97
, 百拇医药
1.03
0
1.03(1)
48
97
2.06
1.03
3.09(1)
72
97
2.06
1.03
3.09(1)
, 百拇医药
1.5mg/kg BW组
24
71
1.41
0
1.41(1)
48
71
1.41
0
1.41(1)
72
, 百拇医药 71
1.41
0
1.41(1)
注：(1)与对照组相比P<0.01
2.4 汞对体外培养卵母细胞的影响
由表4可见，在培养8h时实验组与对照组相比能显著地抑制卵母细胞的GVBD率(0.5mg/kg BW组χ2=10.084，1.5mg/kg BW组χ2=7.446，P<0.01)，但是随着培养时间的延续，这种抑制作用逐渐减小；2个实验组24h时均能显著性地降低卵母细胞第一极体的释放率(0.5mg/kg BW组χ2=29.491，1.5mg/kg BW组χ2=30.164，P<0.01)和卵母细胞的体外存活率(0.5mg/kg BW组χ2=5.921，P<0.05，1.5mg/kg BW组χ2=23.649，P<0.01)。
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表4 HgCl2对体外培养卵母细胞的影响
组 别
总卵母
细胞数
(个)
生发泡
破裂率
(%)
第一极体
释放率
(%)
卵母细胞
存活率
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(%)
对照组
70
98.57
70.00
85.71
0.5mg/L组
84
83.33(2)
26.19(2)
69.05(1)
1.5mg/L组
, 百拇医药
74
86.49(2)
24.32(2)
47.30(2)
注：与对照组相比(1)P<0.05 (2)P<0.01
3 讨论
既往动物实验结果显示，高剂量的汞增加了生殖紊乱的风险，如不孕、自发流产、死产和先天畸形等[5]。本实验结果显示，腹腔注射HgCl2对在体卵母细胞的GVBD无影响，但可以抑制第一极体的释放，并可降低IVF率，随着卵母细胞体外培养的进行，HgCl2对第一极体的抑制作用逐渐解除，恢复细胞分裂，第一极体释放率明显提高，说明HgCl2对第一极体释放的抑制作用可能是可逆的或者仅仅是延迟了减数分裂的过程，但是由于IVF率并没有增加，说明HgCl2能损害卵母细胞的受精能力。2个实验组对小鼠的肝脏和肾脏都有明显的毒性作用，与文献相符[1]，且表现为明显的剂量-效应关系，0.5mg/kg BW组对卵巢和超排卵母细胞数无影响，1.5m/kg BW组不仅可以显著性地降低超排卵母细胞数，而且对卵巢也有明显的毒性作用。实验组对正常超排后进行体外培养卵母细胞的GVBD率在15h时与对照组相比有显著性降低，随着培养时间的延长，GVBD率又能逐渐恢复。HgCl2也能明显地抑制体外培养卵母细胞第一极体的释放，降低卵母细胞的存活率，进一步说明HgCl2不仅对卵母细胞的受精能力有损伤作用，而且对卵母细胞的质量和存活都有明显的破坏作用。HgCl2对卵母细胞第一极体释放的抑制作用可能是由于汞作为细胞内的一种微管合成的抑制剂，能抑制微管的组装和聚合，使纺锤体、有丝分裂器不能正常形成和移动，细胞分裂无法正常进行，第一极体不能形成，无法进入第二次减数分裂，卵细胞不能正常受精，从而导致IVF率下降。汞对卵巢、肝脏、肾脏等脏器的毒性作用以及对卵母细胞的存活率和IVF率的不可逆地降低，说明汞的毒性作用的机制非常复杂，而在正常培养基中培养的卵母细胞第一极体的释放率随着培养时间的延续而显著提高，说明汞对卵母细胞成熟的抑制是可逆的或者仅是延迟了减数分裂的进行，提示育龄妇女接触汞及其化合物后，只要停止接触污染物，其生殖细胞的成熟仍然可以恢复正常。本研究显示，汞可以破坏或抑制卵母细胞的减数分裂过程，降低卵母细胞的受精能力和存活率，提示育龄妇女接触汞及其化合物会导致生育能力降低，甚至造成不育或不孕。
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基金项目：江苏省自然科学基金(BK99064)
作者简介：沈维干，男，硕士，讲师
参考文献：
[1]王夔主编.生命科学中的微量元素.上卷.北京：中国计量出版社，1992.147—173
[2]李景舜，赵淑华，金明华，等.氯化甲基汞对小鼠卵巢细胞周期的影响.环境与健康杂志，1997，14(6)：252—253
[3李朝军，吴海涛，蔡霞华，等.香烟烟雾水溶物对小鼠卵母细胞体外减数分裂的影响.中国环境科学，1997，17(4)：312—315
[4]李朝军，王斌，范必勤，等.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究.南京大学学报(自然科学版)，1997，33(2)：265—272
[5]Schuurs AH.Reproductive toxicity of occupational mercury:a review of the literature. J Dent，1999，27(4):249—256
收稿日期：1999-06-18, http://www.100md.com