变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的分子克隆
作者：孙汉堂 吴补领 杨聚才 孙叶芳
单位：孙汉堂(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；吴补领(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；杨聚才(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；孙叶芳(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)
关键词：变形链球菌； 葡聚糖结合蛋白； 聚合酶链式反应； 分子克隆； 序列测定
牙体牙髓牙周病学杂志000302 【摘 要】 目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法：根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段，扩增产物经 回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性 克隆，鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论：成功克隆了gbpC基因片段，为进一步的研究(探针标 记、杂交及表达等)奠定了基础。克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法：根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段，扩增产物经 回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性 克隆，鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论：成功克隆了gbpC基因片段，为进一步的研究(探针标 记、杂交及表达等)奠定了基础。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0120-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：120]
The clonging and sequencing of a segment supposed to
encode a glucan-binding domain of glucan-binding
protein C of Streptococcus mutans
SUN Han-tang， WU Bu-ling， YANG Ju-cai，et al
, http://www.100md.com
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
【Abstract】 AIM: Cloning and sequencing of a segment s upposed to encode a glucan -binding domain of glucan-binding protein C of Streptococcus mutans. METHODS: Design and synthesize a couple of oligodoxynucleotide prime rs in accordance with the sequence of gbpC of S.mutans 109cS reported by Sato et al, amplify a distinct segment of gbpC between 1105bp and 1554bp by poly merase chain reaction(PCR); after recovery and enzyme digestion, the PCR product was in serted into puc18 vector; the resulted plasmid was transformed into E.coli D H5α and the two-stranded DNA was sequenced after identification. RES ULT S:The result of sequencing was consistent with that reported by Sato et al. CONCLUSION: The distinct segment of gbpC was cloned successfully and thus made a basis for further researches(probe marking, hybridization, expression et al).
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【Key words】 S.mutans； Glucan-binding protein；PCR；mo lecular cloning；sequencing
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):120]
近年来，以免疫防龋、生态防龋为远期目标，针对变形链球菌的表面 蛋白、产物等进 行的研究方兴未艾。其最终目的，均是为上述的防龋策略寻找合适的靶物质。基于在粘附、 聚集及菌斑形成中的重要作用，一个时期以来一直被忽视的葡聚糖结合蛋白(Glucan-bindi ng proteins,Gbps)逐渐引起学者们的重视。由Sato等于1997年通过随机突变法(Random m utagenesis )发现的gbpC，可使变形链球菌在一定浓度抗生素中仍具有粘附、聚集能力， 这是一个很有意义的现象，值得进一步探讨[1]。本研究采用PCR方法，以变形链球 菌OMZ175 (S.mutans OMZ175)的基因组DNA作为模板，PCR扩增了gbpC编码区部分特异性序列并将其 克隆至puc18中，从而为后续的研究(探针标记、杂交及表达等)打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 变形链球菌的培养及基因组DNA提取[2,3]
变形链球菌国际参考株S.mutans OMZ175(serotype f)厌氧培养至饱和状态, SDS+CTAB法裂 菌，酚/氯仿法提取基因组DNA。
1.2 引物设计与合成
根据Sato等(1997)报道的变形链球菌临床分离株S.mutans 109cS的gbpC序列，设计一对引 物，扩增编码序列1105～1554p间约0.45kb的特异片段，P1：5'GCGAATTCGTTAAAATACCGG3’ ，P2：5'ATGAGGATCCTCTGGTGTTT3'，经电脑软件(PC-Gene及Blast)检验，符合要求。由Ta KaRa公司大连分部合成。
1.3 PCR反应
, 百拇医药
在200μl PCR反应专用管中依次加入10×PCR 缓冲液5μl, dNTPs(每种浓度10mmol/ L)1μl, P1(100mmol/L)1μl,P2(100mmol/L)1μl, 基因组DNA 10μl,加无菌去离子水至50 μl,稍离心混匀。沸水中煮沸变性10min,取出迅速置冰水中，加入Taq DNA polymerase 0.5 μl，置Eppendorf Gradient PCR仪中，按以下程序进行扩增反应：94℃ 4min；94℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 1.5min，5循环；94℃ 30s，68℃ 1.5min，30循环；72℃ 10min。
1.4 PCR反应产物的回收
PCR反应产物用AdvantageTM PCR-Pure Kit(Clontech Labratories Inc.USA)回收(步 骤从略)。
1.5 载体的制备
, 百拇医药
将含puc18的DH5α 菌划线接种至LB琼脂平板上(含Amp100mg/L), 37℃培养过夜；取单 菌落接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L), 37℃，160r/min,震荡培养过夜。 取3ml菌液离心沉淀，常规碱裂解法提取质粒[5]。
1.6 连接反应
酶切反应：①PCR反应产物16.5μl，10×3号缓冲液 2μl，EcoRI、BamHI(华美公司)各0. 75μl；稍离心混匀，37℃水浴 2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH 8.0的TE中)；②puc18 16.5μl，10×3号缓冲液2μl，EcoRI 1.5μl；稍离心混匀 ，37℃水浴 2h ;增容至100μl，等体积的酚、酚/氯仿各抽提1次；2倍体积无水乙醇沉淀，700ml/L乙醇洗 涤； 晾干后溶于8μl TE(pH8.0)中；加入10×3号缓冲液 1μl，BamHI 1μl；稍离心混 匀，37℃水浴2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH8.0的TE中)。
, 百拇医药
连接反应体系： PCR反应产物5.5μl，线性化载体1.5μl，5×T4 DNA Ligase 缓冲液2μl，T4 DNA Ligase 1μl，稍离心混匀；置16℃水浴中反应16h；70℃，5 min灭活 T4 DNA Ligase，-20℃贮存备用。
1.7 重组质粒转化DH5α感受态宿主菌
常规制备DH5α感受态宿主菌并用连接反应产物转化，转化产物均匀涂布于X-gal+IPTG板上 ，37℃培养过夜[5]。
1.8 重组克隆的筛选和鉴定
按照蓝白筛选法的原理，随机挑取数个白色菌落，接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L) , 37℃，160r/min震荡培养过夜。取3ml菌液离心沉淀，按碱裂解法提取质粒(同1.5) 。酶切(EcoRⅠ/BamHI)及PCR(质粒稀释500倍后充当模板，其余条件同前)鉴定。
, 百拇医药
1.9 重组质粒中插入片段的序列测定
取经鉴定正确的阳性克隆菌种，划线接种至LB琼脂平板上(含Amp100mg/L), 37℃培 养过夜；取单菌落接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L), 37℃，160r/min震荡培养过夜 。用Wizard Minipreps DNA Purification System(Promega公司)提取质粒，用PE317- A型DNA自动测序仪(PE公司,USA)进行序列测定。
2 结果
2.1 变形链球菌基因组DNA提取
S.mutans OMZ175基因组DNA的A值为0.0236/0.0128 (300倍倍比稀释后),经计算,其 浓度及纯度均达到作为模板的标准。
2.2 PCR
, 百拇医药
分别以细菌基因组DNA、重组质粒为模板的PCR产物经电泳,均出现略小于0.5kb的条带,与预 期大小 (约0.45 kb)一致(图1、2)。
图1 PCR扩增产物
1：1kb DNA Ladder; 2:PCR产物
图2 PCR及酶切鉴定结果
1：1kb DNA Ladder 4：puc180
2：puc18/gbp Cc EcoRI+BamHI切 5：puc18/gbpCc
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3：1kb DNA Ladder6：以puc18/gbpCc为模板的RCR产物
2.3 酶切
电泳结果显示,酶切样品出现两条带,大小范围分别为略小于0.5kb及2.0～3.0kb，接近3 .0kb(图2),与预期结果一致,初步表明我们获得了预期片段。
2.4 序列测定
测序结果与Sato等报道的序列一致,未发现任何突变；命名该重组质粒为puc18/gbpCC。
3 讨论
变形链球菌族(Mutans Streptococci)是公认的主要致龋菌，在人类又以变形链 球菌组(S.mutans)为主，其次是远缘链球菌(S.sobrinus)[4]。菌斑是龋病赖以发 生的局部微环境，其形成及巩 固有赖于变链菌的粘附与聚集能力。葡聚糖结合蛋白是变链菌粘附、聚集力的重要物质基础 之一，其介导的变链菌对获得性膜原位葡聚糖的粘附是初始粘附的重要组成部分，而蔗糖依 赖性粘附、聚集则是菌斑成熟、稳定所必不可少的。
, 百拇医药
迄今为止，已在S.mutans中发现了3种Gbps，即GbpA、GbpB、GbpC。GbpA发现得 最早，研究得也最为透彻。GbpB的基因尚未克隆，但因其存在于实验室培养的所有S.muta ns中，且经其免疫的小鼠患龋率明显降低，所以被公认为具有较好的研究及应用前景。最近 发现，由于gbpC可在较低浓度的抗生素中被诱导表达，体现了细菌的适应性，因此引起 了我们的极大兴趣。探讨其基因表达调控的机制，有助于阐明致龋菌与宿主间相互作用的机 理，从而为防龋研究和实践提供新的思路和方法。为此，本研究试图从血清型为f的S.mutan s OMZ175中获得该基因的特异性片段，然后实现原核表达，以便为进一步的研究打下基础。 实验结果表明我们已实现了第一个目标。
研究表明，Gbps结合葡聚糖的能力源于其葡聚糖结合结构域(Glucan-binding domain, GBD )，该结构域的功能与GTF的葡聚糖结合区(Glucan-binding region, GBR)的相似，但其 氨基酸组成目前还不太确定，在蛋白中的位置也不固定。尽管Banas等认为所谓的A重复( A Repeats)与C重复(C repeats)就是GBD，但Sato等却未在GbpC中发现类似结构，所以目 前还有争议。需要积累更多的资料以帮助分析、归纳。
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我们所测得的部分序列与Sato等报道的gbpC序列一致，表明我们已成功克隆了gbpC基因片 段，为进一步的研究奠定了基础。
【参考文献】
[1] Sato Y,Yamamoto Y,Kizaki H.Clonging and sequence analysis of the gbpC gene en coding a novel glucan-binding protein of Streptococcus mutans.Infect Immu,1997,6 5(2):668
[2] Saarela M,Alalwusua S,Takei T, et al. Genetic diversity withi n isolates of mu tans Streptococci recognized by an rRNA gene probe. J Clin Microbiol,1993,31:58 4.
, 百拇医药
[3] Ausubel FM,Brent R,Kingston RE, et al. 颜子颖，王海林，译. 精 编分子生物学实验指南. 北京：科学出版社，1998
[4] Whiley RA,Beighton D. Current classification of the oral streptoc occi: Review. Oral Microbiol Immunol,1998,13:195
[5] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T. 金冬雁，黎孟枫,译. 分子克隆实验 指数. 北京：科学出版社，1996
收稿日期：1999-10-13, 百拇医药
单位：孙汉堂(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；吴补领(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；杨聚才(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)；孙叶芳(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安，710032)
关键词：变形链球菌； 葡聚糖结合蛋白； 聚合酶链式反应； 分子克隆； 序列测定
牙体牙髓牙周病学杂志000302 【摘 要】 目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法：根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段，扩增产物经 回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性 克隆，鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论：成功克隆了gbpC基因片段，为进一步的研究(探针标 记、杂交及表达等)奠定了基础。克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法：根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段，扩增产物经 回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性 克隆，鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论：成功克隆了gbpC基因片段，为进一步的研究(探针标 记、杂交及表达等)奠定了基础。
, http://www.100md.com
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0120-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：120]
The clonging and sequencing of a segment supposed to
encode a glucan-binding domain of glucan-binding
protein C of Streptococcus mutans
SUN Han-tang， WU Bu-ling， YANG Ju-cai，et al
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School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
【Abstract】 AIM: Cloning and sequencing of a segment s upposed to encode a glucan -binding domain of glucan-binding protein C of Streptococcus mutans. METHODS: Design and synthesize a couple of oligodoxynucleotide prime rs in accordance with the sequence of gbpC of S.mutans 109cS reported by Sato et al, amplify a distinct segment of gbpC between 1105bp and 1554bp by poly merase chain reaction(PCR); after recovery and enzyme digestion, the PCR product was in serted into puc18 vector; the resulted plasmid was transformed into E.coli D H5α and the two-stranded DNA was sequenced after identification. RES ULT S:The result of sequencing was consistent with that reported by Sato et al. CONCLUSION: The distinct segment of gbpC was cloned successfully and thus made a basis for further researches(probe marking, hybridization, expression et al).
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【Key words】 S.mutans； Glucan-binding protein；PCR；mo lecular cloning；sequencing
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):120]
近年来，以免疫防龋、生态防龋为远期目标，针对变形链球菌的表面 蛋白、产物等进 行的研究方兴未艾。其最终目的，均是为上述的防龋策略寻找合适的靶物质。基于在粘附、 聚集及菌斑形成中的重要作用，一个时期以来一直被忽视的葡聚糖结合蛋白(Glucan-bindi ng proteins,Gbps)逐渐引起学者们的重视。由Sato等于1997年通过随机突变法(Random m utagenesis )发现的gbpC，可使变形链球菌在一定浓度抗生素中仍具有粘附、聚集能力， 这是一个很有意义的现象，值得进一步探讨[1]。本研究采用PCR方法，以变形链球 菌OMZ175 (S.mutans OMZ175)的基因组DNA作为模板，PCR扩增了gbpC编码区部分特异性序列并将其 克隆至puc18中，从而为后续的研究(探针标记、杂交及表达等)打下基础。
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1 材料和方法
1.1 变形链球菌的培养及基因组DNA提取[2,3]
变形链球菌国际参考株S.mutans OMZ175(serotype f)厌氧培养至饱和状态, SDS+CTAB法裂 菌，酚/氯仿法提取基因组DNA。
1.2 引物设计与合成
根据Sato等(1997)报道的变形链球菌临床分离株S.mutans 109cS的gbpC序列，设计一对引 物，扩增编码序列1105～1554p间约0.45kb的特异片段，P1：5'GCGAATTCGTTAAAATACCGG3’ ，P2：5'ATGAGGATCCTCTGGTGTTT3'，经电脑软件(PC-Gene及Blast)检验，符合要求。由Ta KaRa公司大连分部合成。
1.3 PCR反应
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在200μl PCR反应专用管中依次加入10×PCR 缓冲液5μl, dNTPs(每种浓度10mmol/ L)1μl, P1(100mmol/L)1μl,P2(100mmol/L)1μl, 基因组DNA 10μl,加无菌去离子水至50 μl,稍离心混匀。沸水中煮沸变性10min,取出迅速置冰水中，加入Taq DNA polymerase 0.5 μl，置Eppendorf Gradient PCR仪中，按以下程序进行扩增反应：94℃ 4min；94℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 1.5min，5循环；94℃ 30s，68℃ 1.5min，30循环；72℃ 10min。
1.4 PCR反应产物的回收
PCR反应产物用AdvantageTM PCR-Pure Kit(Clontech Labratories Inc.USA)回收(步 骤从略)。
1.5 载体的制备
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将含puc18的DH5α 菌划线接种至LB琼脂平板上(含Amp100mg/L), 37℃培养过夜；取单 菌落接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L), 37℃，160r/min,震荡培养过夜。 取3ml菌液离心沉淀，常规碱裂解法提取质粒[5]。
1.6 连接反应
酶切反应：①PCR反应产物16.5μl，10×3号缓冲液 2μl，EcoRI、BamHI(华美公司)各0. 75μl；稍离心混匀，37℃水浴 2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH 8.0的TE中)；②puc18 16.5μl，10×3号缓冲液2μl，EcoRI 1.5μl；稍离心混匀 ，37℃水浴 2h ;增容至100μl，等体积的酚、酚/氯仿各抽提1次；2倍体积无水乙醇沉淀，700ml/L乙醇洗 涤； 晾干后溶于8μl TE(pH8.0)中；加入10×3号缓冲液 1μl，BamHI 1μl；稍离心混 匀，37℃水浴2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH8.0的TE中)。
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连接反应体系： PCR反应产物5.5μl，线性化载体1.5μl，5×T4 DNA Ligase 缓冲液2μl，T4 DNA Ligase 1μl，稍离心混匀；置16℃水浴中反应16h；70℃，5 min灭活 T4 DNA Ligase，-20℃贮存备用。
1.7 重组质粒转化DH5α感受态宿主菌
常规制备DH5α感受态宿主菌并用连接反应产物转化，转化产物均匀涂布于X-gal+IPTG板上 ，37℃培养过夜[5]。
1.8 重组克隆的筛选和鉴定
按照蓝白筛选法的原理，随机挑取数个白色菌落，接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L) , 37℃，160r/min震荡培养过夜。取3ml菌液离心沉淀，按碱裂解法提取质粒(同1.5) 。酶切(EcoRⅠ/BamHI)及PCR(质粒稀释500倍后充当模板，其余条件同前)鉴定。
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1.9 重组质粒中插入片段的序列测定
取经鉴定正确的阳性克隆菌种，划线接种至LB琼脂平板上(含Amp100mg/L), 37℃培 养过夜；取单菌落接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L), 37℃，160r/min震荡培养过夜 。用Wizard Minipreps DNA Purification System(Promega公司)提取质粒，用PE317- A型DNA自动测序仪(PE公司,USA)进行序列测定。
2 结果
2.1 变形链球菌基因组DNA提取
S.mutans OMZ175基因组DNA的A值为0.0236/0.0128 (300倍倍比稀释后),经计算,其 浓度及纯度均达到作为模板的标准。
2.2 PCR
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分别以细菌基因组DNA、重组质粒为模板的PCR产物经电泳,均出现略小于0.5kb的条带,与预 期大小 (约0.45 kb)一致(图1、2)。
图1 PCR扩增产物
1：1kb DNA Ladder; 2:PCR产物
图2 PCR及酶切鉴定结果
1：1kb DNA Ladder 4：puc180
2：puc18/gbp Cc EcoRI+BamHI切 5：puc18/gbpCc
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3：1kb DNA Ladder6：以puc18/gbpCc为模板的RCR产物
2.3 酶切
电泳结果显示,酶切样品出现两条带,大小范围分别为略小于0.5kb及2.0～3.0kb，接近3 .0kb(图2),与预期结果一致,初步表明我们获得了预期片段。
2.4 序列测定
测序结果与Sato等报道的序列一致,未发现任何突变；命名该重组质粒为puc18/gbpCC。
3 讨论
变形链球菌族(Mutans Streptococci)是公认的主要致龋菌，在人类又以变形链 球菌组(S.mutans)为主，其次是远缘链球菌(S.sobrinus)[4]。菌斑是龋病赖以发 生的局部微环境，其形成及巩 固有赖于变链菌的粘附与聚集能力。葡聚糖结合蛋白是变链菌粘附、聚集力的重要物质基础 之一，其介导的变链菌对获得性膜原位葡聚糖的粘附是初始粘附的重要组成部分，而蔗糖依 赖性粘附、聚集则是菌斑成熟、稳定所必不可少的。
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迄今为止，已在S.mutans中发现了3种Gbps，即GbpA、GbpB、GbpC。GbpA发现得 最早，研究得也最为透彻。GbpB的基因尚未克隆，但因其存在于实验室培养的所有S.muta ns中，且经其免疫的小鼠患龋率明显降低，所以被公认为具有较好的研究及应用前景。最近 发现，由于gbpC可在较低浓度的抗生素中被诱导表达，体现了细菌的适应性，因此引起 了我们的极大兴趣。探讨其基因表达调控的机制，有助于阐明致龋菌与宿主间相互作用的机 理，从而为防龋研究和实践提供新的思路和方法。为此，本研究试图从血清型为f的S.mutan s OMZ175中获得该基因的特异性片段，然后实现原核表达，以便为进一步的研究打下基础。 实验结果表明我们已实现了第一个目标。
研究表明，Gbps结合葡聚糖的能力源于其葡聚糖结合结构域(Glucan-binding domain, GBD )，该结构域的功能与GTF的葡聚糖结合区(Glucan-binding region, GBR)的相似，但其 氨基酸组成目前还不太确定，在蛋白中的位置也不固定。尽管Banas等认为所谓的A重复( A Repeats)与C重复(C repeats)就是GBD，但Sato等却未在GbpC中发现类似结构，所以目 前还有争议。需要积累更多的资料以帮助分析、归纳。
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我们所测得的部分序列与Sato等报道的gbpC序列一致，表明我们已成功克隆了gbpC基因片 段，为进一步的研究奠定了基础。
【参考文献】
[1] Sato Y,Yamamoto Y,Kizaki H.Clonging and sequence analysis of the gbpC gene en coding a novel glucan-binding protein of Streptococcus mutans.Infect Immu,1997,6 5(2):668
[2] Saarela M,Alalwusua S,Takei T, et al. Genetic diversity withi n isolates of mu tans Streptococci recognized by an rRNA gene probe. J Clin Microbiol,1993,31:58 4.
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[3] Ausubel FM,Brent R,Kingston RE, et al. 颜子颖，王海林，译. 精 编分子生物学实验指南. 北京：科学出版社，1998
[4] Whiley RA,Beighton D. Current classification of the oral streptoc occi: Review. Oral Microbiol Immunol,1998,13:195
[5] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T. 金冬雁，黎孟枫,译. 分子克隆实验 指数. 北京：科学出版社，1996
收稿日期：1999-10-13, 百拇医药