表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞体外生长的影响
作者：田新霞 陈杰 林映波 屠承信 吴浩强
单位：香港中文大学病理解剖及细胞学系(田新霞、林映波、吴浩强)；中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院病理科(陈杰)；香港理工大学医疗健康系(屠承信)
关键词：神经胶质瘤；受体，表皮生长因子-尿抑胃素
中华医学杂志981122 【摘要】 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞U87MG体外生长的影响。方法 构建EGFR反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入U87MG细胞；PCR方法鉴定转染克隆；Western印迹杂交检测EGFR蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义EGFR基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果 转染反义EGFR基因的细胞克隆株AS1-AS6的EGFR蛋白表达水平均有不同程度的降低；AS1-AS6细胞体外生长明显减慢，AS1-AS6细胞克隆形成率明显降低。表明U87MG细胞体外生长速度和恶性转化能力均与EGFR表达呈正相关。结论 反义EGFR基因转染可以明显抑制U87MG细胞生长，EGFR对U87MG细胞生长具有重要的调控作用。
, 百拇医药
The effect of antisense epidermal growth factor receptor RNA on the growth of human malignant glioma cells Tian Xinxia*, Chen Jie, Lin Yingbo, et al. * Department of Anatomical and Cellular Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
【Abstract】 Objective To study the effect of antisense EGFR RNA on the growth of human malignant glioma cells.Methods An antisense EGFR expression vector was constructed and introduced into human malignant glioma cells. PCR analysis was used to determine which clones were successfully transfected with antisense EGFR constructs. Western blotting analysis was used to determine EGFR protein level in the transfected cells. The in vitro growth and their ability to grow in soft agar were studied.Results Western blotting analysis showed six clones stably expressing lower levels of EGFR protein. Antisense EGFR RNA was found to inhibit the proliferation of human malignant glioma cells and their ability to grow in soft agar. There was a negative correlation between the growth inhibiting effect of antisense EGFR and EGFR protein expression. Conclusion These results demonstrate that EGFR play an pivotal role in human malignant glioma cell growth. Antisense EGFR can inhibit the growth of human malignant glioma cells.
, 百拇医药
【Key words】 Glioma Receptors, epidermal growth factor-urogastrone
(Natl Med J China, 1998, 78：853-855)
肿瘤发生与表皮生长因子受体(EGFR)的过量表达或异常表达密切相关。有研究报道[1～3]：反义EGFR基因转染可以抑制人横纹肌肉瘤、鳞癌、大肠癌等肿瘤细胞的体外生长。但有关反义EGFR基因转染对人恶性胶质瘤影响的研究少见报道，我们对此作了研究，现报道如下。
材料和方法
一、反义EGFR表达载体的构建
应用限制性内切酶BamH1、酶切质粒PE7，得到1 024 bp EGFR cDNA片段，然后把该片段克隆到5.05 kb反转录病毒载体pBabe-puro上(质粒PE7和pBabe-puro由英国癌研究中心N.R.Lemoine博士惠赠)。该EGFR cDNA片段分别以3′～5′反义方向或5′～3′正义方向插入载体BamH1位点。酶切鉴定插入方向。所用酶均购自美国Promega公司。
, 百拇医药
二、细胞培养与基因转染
人恶性胶质瘤细胞系U87MG(购自美国ATCC公司)高表达EGFR，培养基为MEMα，加10%小牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素(均购自美国Gibco公司)。基因转染用脂质体(购自美国Promega公司)方法。在含嘌呤霉素(美国Sigma公司，2 μg/ml)的培养基内选择分离转染子克隆。
三、PCR鉴定
应用PCR技术鉴定子克隆成功的转染了反义EGFR基因。根据已发表的EGFR核酸序列[4]，自行设计并合成了一对引物，只能特异扩增插入的EGFR cDNA片段。上游引物序列为：5′-TGGATATTCTGAAAACCGTAA-3′，下游引物序列为：5′-AGTCCCTTATACACCGTGC-3′，经PCR反应扩增出自第1361～2375 nt的EGFR序列，长度为1015 bp。
, http://www.100md.com
四、Western印迹杂交
细胞蛋白质的提取见文献[5]，采用美国Bio-Rad公司蛋白测定试剂准确测定蛋白浓度。蛋白质样品用8%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到Hybond ECL硝酸纤维素膜上(英国Amersham公司)。一抗体为兔抗人EGFR多克隆抗体(浓度1∶200，美国Santa Cruz公司)，二抗体为生物素化羊抗兔IgG(浓度1∶1 000，美国Bio-Rad公司)。用ECL化学发光试剂盒(英国Amersham公司)检测杂交信号。
五、细胞体外生长实验
常规接种1×104个U87MG、EGFR正义基因表达载体转染细胞(U87MG/S-pBabe)、空载体转染细胞(U87MG/pBabe)和EGFR反义基因表达载体转染细胞克隆(AS1-AS6)于24孔板，每组接种3孔，于接种后的第2、4、6、7天分别计数细胞，取均值绘制出生长曲线。实验重复3次。
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六、软琼脂集落形成实验
6孔培养板内接种5×103个U87MG、U87MG/S-pBabe、U87MG/pBabe和AS1-AS6于0.35%低溶点琼脂糖凝胶(美国Sigma公司)，每组2孔，14天后计数克隆。在显微镜下计数细胞克隆，大于或等于200 μm的克隆计数为大克隆，小于200 μm的克隆计数为小克隆。实验重复3次。
结果
一、表达反义EGFR基因载体的构建
应用BamHⅠ酶切得到的EGFR cDNA插入pBabe-puro载体的BamHⅠ位点；应用BamHⅠ和ECoRⅠ双酶切鉴定cDNA片段插入方向，获得EGFR反义基因表达载体(pBabe-EGFR-AS)和EGFR正义基因表达载体(pBabe-EGFR-S)。
, 百拇医药 二、表达反义EGFR基因的细胞克隆鉴定
应用脂质体转染法将载体pBabe-EGFR-AS导入U87MG细胞，用嘌呤霉素筛选，挑取15个嘌呤霉素抗性克隆进行PCR鉴定，其中10个克隆为阳性。选择其中6个克隆AS1～AS6进行实验。图1显示这6个克隆均可检测到EGFR cDNA插入片段，长度为1 015 bp。我们用同样方法导入载体pBabe-EGFR-S及空载体pBabe-puro作为对照，得到的细胞克隆命名为：U87MG/S-pBabe、U87MG/pBabe。空载体对照及未转染细胞PCR检测结果为阴性。正义EGFR表达载体转染细胞PCR检测结果为阳性。
M：ΦX 174 DNA/Hae Ⅲ Markers；1：antisense EGFR-pBabe载体，2：U87MG细胞；3：U87MG细胞空载体转染的细胞(U87MG/pBabe)；
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4；正义EGFR基因转染的U87MG细胞(U87MG/S-pBabe)；
5～10：反义EGFR基因转染的细胞的不同克隆AS1-AS6
图1 转染细胞反义EGFR基因检测结果
三、转染细胞EGFR蛋白表达水平的检测
Western印迹杂交结果显示(图2)，空载体、正义EGFR基因转染细胞对照组及未经转染的U87MG细胞表达高水平的170EGFR蛋白，在经反义EGFR基因转染的克隆中，AS4和AS5表达中等水平的EGFR蛋白，其它的反义克隆株均表达低水平的EGFR蛋白。免疫组织化学染色进一步证实了Western印迹杂交结果。空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组及未经转染的U87MG细胞胞浆阳性(++)着色，在经反义EGFR基因转染的克隆中，AS4和AS5胞浆弱阳性(+)着色，其它的反义克隆株极弱阳性(+/-)或阴性着色。
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1：U87MG细胞；2：U87MG细胞空载体转染的细胞(U87MG/pBabe)；
3：正义EGFR基因转染的U87MG细胞(U87MG/S-pBabe)；
4～9：反义EGFR基因转染的细胞的不同克隆AS1-AS6，示EGFR蛋白表达明显减低.
图2 EGFR反义基因转染U87MG细胞蛋白水平EGFR检测结果
四、转染细胞体外生长检测
结果显示空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组与未经转染细胞生长迅速，反义EGFR基因转染细胞生长受到不同程度的抑制。培养7天后，若以U87MG/pBabe作为对照，反义EGFR转染克隆AS1～AS6细胞生长抑制率分别为74%、59%、55%、40%、41%和67%，表明细胞生长速度与EGFR蛋白表达水平呈正相关。
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五、软琼脂集落形成
结果显示空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组与未经转染细胞生成大量克隆，大于200 μm的克隆数分别为：533±57、423±35、653±54；小于200 μm的克隆数分别为：603±76、616±65、689±75。反义EGFR基因转染细胞AS1～AS6克隆形成受到不同程度的抑制，大于200 μm的克隆数分别为：22±8、30±11、45±7、122±16、111±21、54±16；小于200 μm的克隆数分别为：212±45、227±56、294±28、473±29、401±23、409±40。结果显示U87MG细胞克隆形成数与EGFR表达水平呈正相关。
讨论
文献报道50%以上恶性胶质瘤有EGFR基因扩增，并常常伴有基因重组和(或)过表达。EGFR过表达可源于基因扩增、受体mRNA转录水平增高和(或)受体蛋白降解延迟。EGFR过表达在肿瘤发生及发展过程中起着重要作用。人们发现：(1)正常人类EGFR过表达可导致纤维母细胞恶性转化；(2)EGFR与鸟类成红细胞增多病病毒v-erbB同源，表明它也可能具有重要的肿瘤恶性转化作用；(3)EGFR基因在人类很多恶性肿瘤有扩增和过表达，表明EGFR异常表达在这些肿瘤的发生中起着重要作用；(4)抗EGFR抗体可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长，表明EGFR具有生长刺激作用。我们重点研究探讨EGFR反义基因转染对高表达EGFR的人恶性胶质瘤细胞系U87MG的细胞EGFR蛋白表达以及体外生长的影响和作用。
, 百拇医药
人恶性胶质瘤细胞U87MG表达高水平EGFR mRNA[6]。通过EGFR反义基因的导入，U87MG细胞EGFR蛋白表达水平降低。细胞生长研究结果显示：恶性胶质瘤细胞生长与EGFR蛋白水平表达呈正相关，进一步证实了EGFR的细胞生长刺激作用。但EGFR反义基因的导入，并不能完全抑制肿瘤细胞的生长，很可能是由于碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子-1等同样对恶性胶质瘤的生长起着重要的调节作用。这些因子通过协同作用来调节恶性胶质瘤的生长，单靠抑制一种生长因子的表达，不能达到完全抑制肿瘤细胞生长的目的。研究这些生长因子之间的相互关系已成为肿瘤研究的热点之一。
我们的研究结果证实了EGFR对人恶性胶质瘤的生长起着重要调节作用。更有意义的是这些反义EGFR基因转染细胞克隆株可以用来研究EGFR影响胶质瘤细胞生长的机制及EGFR与其它细胞生长因子之间的关系，这些研究结果将进一步促进反义基因治疗的深入开展。
参考文献
, http://www.100md.com
1 De Giovanni C, Landuzzi L, Frabetti F, et al. Antisense epidermal growth factor receptor transfection impairs the proliferative ability of human rhabdomyosarcoma cells. Cancer Res, 1996,56：3898-3901.
2 Yamada H, Koizumi S, Kimura M, et al. Reduction of EGF receptor levels in human tumor cells transfected with an antisense RNA expression vector. Exp Cell Res, 1989,184：90-98.
3 Rajagopal S, Huang S, Moskal TL, et al. Epidermal growth factor expression in human colon and colon carcinomas: anti-sense epidermal growth factor receptor RNA down-regulate the proliferation of human colon cancer cells. Int J Cancer, 1995,62：661-667.
, http://www.100md.com
4 Ullrich A, Coussens L, Hayflick JS, et al. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. Nature, 1984,309：418-425.
5 J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等主编.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.889-890.
6 Nister M, Libermann TA, Betsholtz C, et al. Expression of messenger RNAs for platelet-derived growth factor and transforming growth factor-alpha and their receptors in human malignant glioma cell lines. Cancer Res, 1988,48：3910-3918.
(收稿：1997-12-05 修回：1998-06-25), 百拇医药
单位：香港中文大学病理解剖及细胞学系(田新霞、林映波、吴浩强)；中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院病理科(陈杰)；香港理工大学医疗健康系(屠承信)
关键词：神经胶质瘤；受体，表皮生长因子-尿抑胃素
中华医学杂志981122 【摘要】 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞U87MG体外生长的影响。方法 构建EGFR反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入U87MG细胞；PCR方法鉴定转染克隆；Western印迹杂交检测EGFR蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义EGFR基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果 转染反义EGFR基因的细胞克隆株AS1-AS6的EGFR蛋白表达水平均有不同程度的降低；AS1-AS6细胞体外生长明显减慢，AS1-AS6细胞克隆形成率明显降低。表明U87MG细胞体外生长速度和恶性转化能力均与EGFR表达呈正相关。结论 反义EGFR基因转染可以明显抑制U87MG细胞生长，EGFR对U87MG细胞生长具有重要的调控作用。
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The effect of antisense epidermal growth factor receptor RNA on the growth of human malignant glioma cells Tian Xinxia*, Chen Jie, Lin Yingbo, et al. * Department of Anatomical and Cellular Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
【Abstract】 Objective To study the effect of antisense EGFR RNA on the growth of human malignant glioma cells.Methods An antisense EGFR expression vector was constructed and introduced into human malignant glioma cells. PCR analysis was used to determine which clones were successfully transfected with antisense EGFR constructs. Western blotting analysis was used to determine EGFR protein level in the transfected cells. The in vitro growth and their ability to grow in soft agar were studied.Results Western blotting analysis showed six clones stably expressing lower levels of EGFR protein. Antisense EGFR RNA was found to inhibit the proliferation of human malignant glioma cells and their ability to grow in soft agar. There was a negative correlation between the growth inhibiting effect of antisense EGFR and EGFR protein expression. Conclusion These results demonstrate that EGFR play an pivotal role in human malignant glioma cell growth. Antisense EGFR can inhibit the growth of human malignant glioma cells.
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【Key words】 Glioma Receptors, epidermal growth factor-urogastrone
(Natl Med J China, 1998, 78：853-855)
肿瘤发生与表皮生长因子受体(EGFR)的过量表达或异常表达密切相关。有研究报道[1～3]：反义EGFR基因转染可以抑制人横纹肌肉瘤、鳞癌、大肠癌等肿瘤细胞的体外生长。但有关反义EGFR基因转染对人恶性胶质瘤影响的研究少见报道，我们对此作了研究，现报道如下。
材料和方法
一、反义EGFR表达载体的构建
应用限制性内切酶BamH1、酶切质粒PE7，得到1 024 bp EGFR cDNA片段，然后把该片段克隆到5.05 kb反转录病毒载体pBabe-puro上(质粒PE7和pBabe-puro由英国癌研究中心N.R.Lemoine博士惠赠)。该EGFR cDNA片段分别以3′～5′反义方向或5′～3′正义方向插入载体BamH1位点。酶切鉴定插入方向。所用酶均购自美国Promega公司。
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二、细胞培养与基因转染
人恶性胶质瘤细胞系U87MG(购自美国ATCC公司)高表达EGFR，培养基为MEMα，加10%小牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素(均购自美国Gibco公司)。基因转染用脂质体(购自美国Promega公司)方法。在含嘌呤霉素(美国Sigma公司，2 μg/ml)的培养基内选择分离转染子克隆。
三、PCR鉴定
应用PCR技术鉴定子克隆成功的转染了反义EGFR基因。根据已发表的EGFR核酸序列[4]，自行设计并合成了一对引物，只能特异扩增插入的EGFR cDNA片段。上游引物序列为：5′-TGGATATTCTGAAAACCGTAA-3′，下游引物序列为：5′-AGTCCCTTATACACCGTGC-3′，经PCR反应扩增出自第1361～2375 nt的EGFR序列，长度为1015 bp。
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四、Western印迹杂交
细胞蛋白质的提取见文献[5]，采用美国Bio-Rad公司蛋白测定试剂准确测定蛋白浓度。蛋白质样品用8%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到Hybond ECL硝酸纤维素膜上(英国Amersham公司)。一抗体为兔抗人EGFR多克隆抗体(浓度1∶200，美国Santa Cruz公司)，二抗体为生物素化羊抗兔IgG(浓度1∶1 000，美国Bio-Rad公司)。用ECL化学发光试剂盒(英国Amersham公司)检测杂交信号。
五、细胞体外生长实验
常规接种1×104个U87MG、EGFR正义基因表达载体转染细胞(U87MG/S-pBabe)、空载体转染细胞(U87MG/pBabe)和EGFR反义基因表达载体转染细胞克隆(AS1-AS6)于24孔板，每组接种3孔，于接种后的第2、4、6、7天分别计数细胞，取均值绘制出生长曲线。实验重复3次。
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六、软琼脂集落形成实验
6孔培养板内接种5×103个U87MG、U87MG/S-pBabe、U87MG/pBabe和AS1-AS6于0.35%低溶点琼脂糖凝胶(美国Sigma公司)，每组2孔，14天后计数克隆。在显微镜下计数细胞克隆，大于或等于200 μm的克隆计数为大克隆，小于200 μm的克隆计数为小克隆。实验重复3次。
结果
一、表达反义EGFR基因载体的构建
应用BamHⅠ酶切得到的EGFR cDNA插入pBabe-puro载体的BamHⅠ位点；应用BamHⅠ和ECoRⅠ双酶切鉴定cDNA片段插入方向，获得EGFR反义基因表达载体(pBabe-EGFR-AS)和EGFR正义基因表达载体(pBabe-EGFR-S)。
, 百拇医药 二、表达反义EGFR基因的细胞克隆鉴定
应用脂质体转染法将载体pBabe-EGFR-AS导入U87MG细胞，用嘌呤霉素筛选，挑取15个嘌呤霉素抗性克隆进行PCR鉴定，其中10个克隆为阳性。选择其中6个克隆AS1～AS6进行实验。图1显示这6个克隆均可检测到EGFR cDNA插入片段，长度为1 015 bp。我们用同样方法导入载体pBabe-EGFR-S及空载体pBabe-puro作为对照，得到的细胞克隆命名为：U87MG/S-pBabe、U87MG/pBabe。空载体对照及未转染细胞PCR检测结果为阴性。正义EGFR表达载体转染细胞PCR检测结果为阳性。
M：ΦX 174 DNA/Hae Ⅲ Markers；1：antisense EGFR-pBabe载体，2：U87MG细胞；3：U87MG细胞空载体转染的细胞(U87MG/pBabe)；
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4；正义EGFR基因转染的U87MG细胞(U87MG/S-pBabe)；
5～10：反义EGFR基因转染的细胞的不同克隆AS1-AS6
图1 转染细胞反义EGFR基因检测结果
三、转染细胞EGFR蛋白表达水平的检测
Western印迹杂交结果显示(图2)，空载体、正义EGFR基因转染细胞对照组及未经转染的U87MG细胞表达高水平的170EGFR蛋白，在经反义EGFR基因转染的克隆中，AS4和AS5表达中等水平的EGFR蛋白，其它的反义克隆株均表达低水平的EGFR蛋白。免疫组织化学染色进一步证实了Western印迹杂交结果。空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组及未经转染的U87MG细胞胞浆阳性(++)着色，在经反义EGFR基因转染的克隆中，AS4和AS5胞浆弱阳性(+)着色，其它的反义克隆株极弱阳性(+/-)或阴性着色。
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1：U87MG细胞；2：U87MG细胞空载体转染的细胞(U87MG/pBabe)；
3：正义EGFR基因转染的U87MG细胞(U87MG/S-pBabe)；
4～9：反义EGFR基因转染的细胞的不同克隆AS1-AS6，示EGFR蛋白表达明显减低.
图2 EGFR反义基因转染U87MG细胞蛋白水平EGFR检测结果
四、转染细胞体外生长检测
结果显示空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组与未经转染细胞生长迅速，反义EGFR基因转染细胞生长受到不同程度的抑制。培养7天后，若以U87MG/pBabe作为对照，反义EGFR转染克隆AS1～AS6细胞生长抑制率分别为74%、59%、55%、40%、41%和67%，表明细胞生长速度与EGFR蛋白表达水平呈正相关。
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五、软琼脂集落形成
结果显示空载体或正义EGFR基因转染细胞对照组与未经转染细胞生成大量克隆，大于200 μm的克隆数分别为：533±57、423±35、653±54；小于200 μm的克隆数分别为：603±76、616±65、689±75。反义EGFR基因转染细胞AS1～AS6克隆形成受到不同程度的抑制，大于200 μm的克隆数分别为：22±8、30±11、45±7、122±16、111±21、54±16；小于200 μm的克隆数分别为：212±45、227±56、294±28、473±29、401±23、409±40。结果显示U87MG细胞克隆形成数与EGFR表达水平呈正相关。
讨论
文献报道50%以上恶性胶质瘤有EGFR基因扩增，并常常伴有基因重组和(或)过表达。EGFR过表达可源于基因扩增、受体mRNA转录水平增高和(或)受体蛋白降解延迟。EGFR过表达在肿瘤发生及发展过程中起着重要作用。人们发现：(1)正常人类EGFR过表达可导致纤维母细胞恶性转化；(2)EGFR与鸟类成红细胞增多病病毒v-erbB同源，表明它也可能具有重要的肿瘤恶性转化作用；(3)EGFR基因在人类很多恶性肿瘤有扩增和过表达，表明EGFR异常表达在这些肿瘤的发生中起着重要作用；(4)抗EGFR抗体可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长，表明EGFR具有生长刺激作用。我们重点研究探讨EGFR反义基因转染对高表达EGFR的人恶性胶质瘤细胞系U87MG的细胞EGFR蛋白表达以及体外生长的影响和作用。
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人恶性胶质瘤细胞U87MG表达高水平EGFR mRNA[6]。通过EGFR反义基因的导入，U87MG细胞EGFR蛋白表达水平降低。细胞生长研究结果显示：恶性胶质瘤细胞生长与EGFR蛋白水平表达呈正相关，进一步证实了EGFR的细胞生长刺激作用。但EGFR反义基因的导入，并不能完全抑制肿瘤细胞的生长，很可能是由于碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子-1等同样对恶性胶质瘤的生长起着重要的调节作用。这些因子通过协同作用来调节恶性胶质瘤的生长，单靠抑制一种生长因子的表达，不能达到完全抑制肿瘤细胞生长的目的。研究这些生长因子之间的相互关系已成为肿瘤研究的热点之一。
我们的研究结果证实了EGFR对人恶性胶质瘤的生长起着重要调节作用。更有意义的是这些反义EGFR基因转染细胞克隆株可以用来研究EGFR影响胶质瘤细胞生长的机制及EGFR与其它细胞生长因子之间的关系，这些研究结果将进一步促进反义基因治疗的深入开展。
参考文献
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1 De Giovanni C, Landuzzi L, Frabetti F, et al. Antisense epidermal growth factor receptor transfection impairs the proliferative ability of human rhabdomyosarcoma cells. Cancer Res, 1996,56：3898-3901.
2 Yamada H, Koizumi S, Kimura M, et al. Reduction of EGF receptor levels in human tumor cells transfected with an antisense RNA expression vector. Exp Cell Res, 1989,184：90-98.
3 Rajagopal S, Huang S, Moskal TL, et al. Epidermal growth factor expression in human colon and colon carcinomas: anti-sense epidermal growth factor receptor RNA down-regulate the proliferation of human colon cancer cells. Int J Cancer, 1995,62：661-667.
, http://www.100md.com
4 Ullrich A, Coussens L, Hayflick JS, et al. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. Nature, 1984,309：418-425.
5 J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等主编.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.889-890.
6 Nister M, Libermann TA, Betsholtz C, et al. Expression of messenger RNAs for platelet-derived growth factor and transforming growth factor-alpha and their receptors in human malignant glioma cell lines. Cancer Res, 1988,48：3910-3918.
(收稿：1997-12-05 修回：1998-06-25), 百拇医药