肠缺血再灌注损伤后大鼠肝和肺组织bFGF和TGFβ基因表达的变化*
作者：杨银辉 付小兵 孙同柱 蒋礼先
单位：解放军304医院创伤研究室 北京市 100037
关键词：肠缺血；再灌注损伤；肝；肺；成纤维细胞生长因子，碱性；转化生长因子β；基因表达
华人消化杂志981008bFGF and TGFβ mRNA expression in liver and lungs following intestinal ischemia-reperfusion injury in rats*
YANG Yin-Hui, FU Xiao-Bing, SUN Tong-Zhu and JIANG Li-Xian
Trauma Lab, Chinese PLA, 304th Hospital, Beijing 100037, China
, http://www.100md.com
Subject headings intestinal ischemia; reperfusion injury; liver; lung; transforming growth factor β; fibroblast growth factor, basic; gene expression
Abstract
AIM To investigate the relationship between endogenous bFGF and TGFβ mRNA expression and remote organ damage in rats following intestinal ischemia-reperfusion injury.
METHODS Wistar rats (n=16) were subjected to 45 minutes of superior mestenteric artery occlusion (45min) followed by reperfusion 45min (6h or 24h). In situ hybridization technique was used to determine bFGF and TGFβ mRNA expression levels.
, 百拇医药
RESULTS Both bFGF and TGFβ mRNA were expressed in normal lung and liver, and after intestinal ischemia, their expressions were stronger, peaking at 6 hours after reperfusion and returning to normal 24 hours later, which were paralleled to the changes in the severity of organ damage.
CONCLUSION The liver and lung damage induced by intestinal ischemia-reperfusion appears to be associated with endogenous bFGF and TGFβ mRNA expression, which might play an important role in internal organ repair after acute injury.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R574
摘 要
目的 观察大鼠肠缺血再灌注损伤后肝和肺的损伤程度与内源性bFGF和TGFβ mRNA表达量的变化规律，探讨两类生长因子在内脏损伤与修复中的作用.
方法 采用大鼠(n=16)肠系膜上动脉夹闭模型，(缺血45min，再灌注6h和24h)用原位杂交方法检测内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平.
结果 肠缺血45min再灌注6h时，对肝、肺的损伤最严重，而此时内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平显著增高，达峰值；再灌注24h，肝，肺的损伤已基本恢复，内源性bFGF和TGFβ mRNA表达量也基本恢复至正常水平.
结论 内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平的变化与肝、肺的损伤程度呈正相关，表明这两类生长因子在内脏损伤后可能存在促进修复的作用.
, 百拇医药
0 引言
大量研究证实，多种生长因子参与体表创面的修复过程. 然而有关生长因子在内脏损伤中的修复作用却研究较少. 部分实验发现，应用外源性生长因子能够促进某些内脏器官的修复[1,2]. 因此，我们利用大鼠肠系膜上动脉夹闭造成肠缺血再灌注损伤，通过观察肝、肺损伤的时相性与内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGFβ)mRNA表达水平的变化规律，探讨内源性生长因子在内脏损伤中的作用以及应用外源性生长因子促进修复的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 选取健康雄性Wistar大鼠16只(250g±10g)，随机分为正常对照、缺血45min、缺血45min+再灌注6h以及缺血45min+再灌注24h四组. 经20g/L戊巴比妥钠麻醉，对照组常规腹部消毒后取肝、肺组织，其余组别钝性分离肠系膜上动脉根部，用微血管夹夹闭，完全阻断血流45min，松夹后分别于设定时间取肝脏、肺脏组织，一部分经40g/L多聚甲醛固定后用于原位杂交，另一部分常规福尔马林固定用于HE染色.
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1.2 方法 ①常规组织学观察 标本置100mL/L福尔马林固定，梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，常规HE染色，组织学观察. ②原位杂交[3] 40g/L多聚甲醛固定的标本经石蜡包埋，切片，充分脱蜡后置pH7.4的PBS中充分漂洗，然后用0.2mo1/LHC1处理20min，再用蛋白酶K(1mg/L)42℃消化25min，并用2g/L甘氨酸浸泡15min终止反应. 经40g/L多聚甲醛后固定20min，梯度乙醇脱水后，将标本在42℃预杂交2h，杂交20h. bFGF和TGFβ的cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒(德国B.M.公司)进行标记，杂交前在100℃水浴变性10min. 杂交后依次用2×SSC，0.1×SSC进行漂洗. 然后加Anti-DIG-抗体(1：500)孵育2h，NBT/BCIP显色过夜，常规脱水、透明、封片. 设略去探针的阴性对照. mRNA表达的阳性信号为蓝紫色颗粒. 每张切片随机取5幅视野，对阳性染色颗粒和细胞总数计数，计算阳性染色率，并进行统计学分析.
2 结果
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2.1 常规组织学观察 常规HE染色发现，肠系膜上动脉夹闭造成肠道缺血45min时，肝脏细胞略有水肿，而肺组织中可见中性粒细胞聚集、贴壁、部分间质水肿. 再灌注6h后，肝细胞明显水肿，排列紊乱，肝血窦部分消失，肺间质明显水肿，肺泡代偿性增大. 再灌注24h后，肝脏、肺脏组织学结构均基本恢复正常，但仍有轻微水肿.
2.2 原位杂交结果 正常大鼠肝和肺组织中均存在少量bFGF和TGFβ mRNA弱阳性信号，其中bFGF多于TGFβ. 缺血45min时，肝脏、肺脏中均见TGFβ mRNA阳性信号增加，而bFGF信号略少或无明显变化. 再灌注6h时，肝脏、肺脏中bFGF和TGFβ mRNA阳性信号均明显增加并达峰值. 再灌注24h时两种脏器中bFGF和TGFβ mRNA表达水平均接近于正常对照(图1，2).
图1 大鼠肠缺血再灌注损伤后肝脏TGFβ和bFGF mRNA表达.
, 百拇医药
图2 大鼠肠缺血再灌注损伤后肺脏TGFβ和bFGF mRNA表达.
3 讨论
bFGF是一种Mr16000的蛋白多肽，广泛分布于体内几乎所有组织. 体内实验发现，bFGF对成纤维细胞有强烈的促增殖效应，能刺激血管生成，对中胚层来源的细胞具有广泛的促进增殖和分化作用[4]. TGFβ是一种Mr23000的二聚体蛋白，在许多正常细胞中均有分布，尤以血液中血小板等贮存量最大. TGFβ的作用随自身浓度的不同而有所变化，低浓度时，它是中性粒细胞和巨噬细胞的趋化剂，高浓度时，可诱导其他多种生长因子的产生. bFGF和TGFβ在促进创伤愈合中均起重要作用，尤其是促进体表创面的修复作用已获得广泛认同. 但有关生长因子在促进内脏器官损伤修复中的研究却较少，特别是内脏损伤后内源性生长因子的作用尚未见报道. 肠道缺血再灌注作为一种典型的创伤，能同时引起多种脏器的损伤，这种损伤主要来源于中性粒细胞[5]、TNFa，IL-1等细胞因子的直接损伤[6]，内毒素的间接损伤[7]等. 已有实验证实应用外源性生长因子有助于受损内脏器官损伤后的修复[2]. 为此，我们应用常规组织学观察和原位杂交方法，通过观察肠缺血再灌注后肝、肺的损伤程度与内源性生长因子bFGF和TGFβ基因表达量的关系，探讨生长因子在内脏器官损伤修复中的作用.
, 百拇医药
研究结果显示，bFGF和TGFβ mRNA在正常的肝、肺组织中均存在一定的基础表达. 在肝脏中主要存在于肝细胞和肝血窦中，在肺脏中主要存在于肺泡上皮细胞和微静脉中. 肝脏、肺脏中bFGF的基础表达量均高于TGFβ. 这一方面说明两种生长因子对维持肝、肺的功能是必不可少的，另一方面显示bFGF对维持内脏正常生理功能的作用较TGFβ强. 组织学观察发现缺血再灌注6h时肝、肺的损伤最严重，这与Poggetti et al[8]通过检测其他指标的结果是一致的. 原位杂交结果显示此时bFGF和TGFβ mRNA表达水平显著增加，达到峰值. 再灌注24h后，肝、肺的组织学结构基本恢复，bFGF和TGFβ的mRNA水平也同时下降至正常水平.
两种生长因子mRNA表达量的变化与内脏器官损伤程度的时项呈显著正相关，说明bFGF和TGFβ在内脏损伤后的一系列细胞活动及组织修复中起重要作用.表明两种生长因子在内脏损伤后可能存在主动修复作用，而且是一种代偿性的自身保护机制. 而再灌注6h时损伤程度的加重，表明内源性生长因子在内脏损伤中自身保护的能力是有限的，这也部分解释了在伤前或缺血即刻应用外源性生长因子促进内脏损伤修复的机制.
, 百拇医药
杨银辉，女，1966-04-28生，河北省阳原县人，汉族. 1989年武汉大学本科毕业，1996年军事医学科学院硕士，助理研究员，主要从事创伤修复机制的研究，发表论文7篇.
*国家杰出青年科学基金资助项目，No. 39525024.
通讯作者 杨银辉，100037，解放军304医院创伤研究室，北京市阜成路51号
*Supported by the National Outstanding Youth Research Programme of China, No. 39525024.
Correspondence to:YANG Yin-Hui, Trauma Lab, Chinese PLA, 304th Hospital, 51 Fuchenglu, Beijing 100037, China
, 百拇医药
Tel. +86*10*66867396， Fax. +86*10*68429998
收稿日期 1998-06-10
4 参考文献
1 Lefter AM. Mechanisms of the protective effects of transforming growth factor-beta in reperfusion injury. Biochem Pharmacol, 1991;42(7):1323-1327
2 付小兵，P. Cuevas, 田惠民，盛志勇. 酸性成纤维细胞生长因子能减轻急性缺血与再灌注对骨骼肌的损伤. 解放军医学杂志，1995；20(2)：95-97
3 Josiah NW. Fundamental principles of in situ hybridization. J Histochem Cytochem, 1993;41(12):1725-1733
, http://www.100md.com
4 付小兵. 生长因子与创伤修复. 北京：人民军医出版社，1991：91-100
5 Schmeling DJ, Caty MG, Oldham KT, Guice KS, Hinshaw DB. Evidence for neutrophil-related acute lung injury after intestinal ischemia-reperfusion. Surgery, 1989;106(2):195-202
6 Caty MG, Guice KS, Oldham KT, Remick DG, Kunkel SI. Evidence for Tumor Necrosis Factor-induced pulmonary microvascular injury after intestinal ischemia-reperfusion injury. Ann Surg, 1990;212(6):694-700
7 Turnage RH, Guice KS, Oldham KT. Endotoxemia and remote organ injury following intestinal reperfusion. J Surg Res, 1994;56(6):571-578
8 Poggetti RS, Moore FA, Moore EE, Bensard DD, Anderson BO, Banerjee A. Liver injury is a reversible neutrophil-mediated event following gut ischemia. Arch Surg, 1992;127(2):175-179, 百拇医药
单位：解放军304医院创伤研究室 北京市 100037
关键词：肠缺血；再灌注损伤；肝；肺；成纤维细胞生长因子，碱性；转化生长因子β；基因表达
华人消化杂志981008bFGF and TGFβ mRNA expression in liver and lungs following intestinal ischemia-reperfusion injury in rats*
YANG Yin-Hui, FU Xiao-Bing, SUN Tong-Zhu and JIANG Li-Xian
Trauma Lab, Chinese PLA, 304th Hospital, Beijing 100037, China
, http://www.100md.com
Subject headings intestinal ischemia; reperfusion injury; liver; lung; transforming growth factor β; fibroblast growth factor, basic; gene expression
Abstract
AIM To investigate the relationship between endogenous bFGF and TGFβ mRNA expression and remote organ damage in rats following intestinal ischemia-reperfusion injury.
METHODS Wistar rats (n=16) were subjected to 45 minutes of superior mestenteric artery occlusion (45min) followed by reperfusion 45min (6h or 24h). In situ hybridization technique was used to determine bFGF and TGFβ mRNA expression levels.
, 百拇医药
RESULTS Both bFGF and TGFβ mRNA were expressed in normal lung and liver, and after intestinal ischemia, their expressions were stronger, peaking at 6 hours after reperfusion and returning to normal 24 hours later, which were paralleled to the changes in the severity of organ damage.
CONCLUSION The liver and lung damage induced by intestinal ischemia-reperfusion appears to be associated with endogenous bFGF and TGFβ mRNA expression, which might play an important role in internal organ repair after acute injury.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R574
摘 要
目的 观察大鼠肠缺血再灌注损伤后肝和肺的损伤程度与内源性bFGF和TGFβ mRNA表达量的变化规律，探讨两类生长因子在内脏损伤与修复中的作用.
方法 采用大鼠(n=16)肠系膜上动脉夹闭模型，(缺血45min，再灌注6h和24h)用原位杂交方法检测内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平.
结果 肠缺血45min再灌注6h时，对肝、肺的损伤最严重，而此时内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平显著增高，达峰值；再灌注24h，肝，肺的损伤已基本恢复，内源性bFGF和TGFβ mRNA表达量也基本恢复至正常水平.
结论 内源性bFGF和TGFβ mRNA表达水平的变化与肝、肺的损伤程度呈正相关，表明这两类生长因子在内脏损伤后可能存在促进修复的作用.
, 百拇医药
0 引言
大量研究证实，多种生长因子参与体表创面的修复过程. 然而有关生长因子在内脏损伤中的修复作用却研究较少. 部分实验发现，应用外源性生长因子能够促进某些内脏器官的修复[1,2]. 因此，我们利用大鼠肠系膜上动脉夹闭造成肠缺血再灌注损伤，通过观察肝、肺损伤的时相性与内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGFβ)mRNA表达水平的变化规律，探讨内源性生长因子在内脏损伤中的作用以及应用外源性生长因子促进修复的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 选取健康雄性Wistar大鼠16只(250g±10g)，随机分为正常对照、缺血45min、缺血45min+再灌注6h以及缺血45min+再灌注24h四组. 经20g/L戊巴比妥钠麻醉，对照组常规腹部消毒后取肝、肺组织，其余组别钝性分离肠系膜上动脉根部，用微血管夹夹闭，完全阻断血流45min，松夹后分别于设定时间取肝脏、肺脏组织，一部分经40g/L多聚甲醛固定后用于原位杂交，另一部分常规福尔马林固定用于HE染色.
, http://www.100md.com
1.2 方法 ①常规组织学观察 标本置100mL/L福尔马林固定，梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，常规HE染色，组织学观察. ②原位杂交[3] 40g/L多聚甲醛固定的标本经石蜡包埋，切片，充分脱蜡后置pH7.4的PBS中充分漂洗，然后用0.2mo1/LHC1处理20min，再用蛋白酶K(1mg/L)42℃消化25min，并用2g/L甘氨酸浸泡15min终止反应. 经40g/L多聚甲醛后固定20min，梯度乙醇脱水后，将标本在42℃预杂交2h，杂交20h. bFGF和TGFβ的cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒(德国B.M.公司)进行标记，杂交前在100℃水浴变性10min. 杂交后依次用2×SSC，0.1×SSC进行漂洗. 然后加Anti-DIG-抗体(1：500)孵育2h，NBT/BCIP显色过夜，常规脱水、透明、封片. 设略去探针的阴性对照. mRNA表达的阳性信号为蓝紫色颗粒. 每张切片随机取5幅视野，对阳性染色颗粒和细胞总数计数，计算阳性染色率，并进行统计学分析.
2 结果
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2.1 常规组织学观察 常规HE染色发现，肠系膜上动脉夹闭造成肠道缺血45min时，肝脏细胞略有水肿，而肺组织中可见中性粒细胞聚集、贴壁、部分间质水肿. 再灌注6h后，肝细胞明显水肿，排列紊乱，肝血窦部分消失，肺间质明显水肿，肺泡代偿性增大. 再灌注24h后，肝脏、肺脏组织学结构均基本恢复正常，但仍有轻微水肿.
2.2 原位杂交结果 正常大鼠肝和肺组织中均存在少量bFGF和TGFβ mRNA弱阳性信号，其中bFGF多于TGFβ. 缺血45min时，肝脏、肺脏中均见TGFβ mRNA阳性信号增加，而bFGF信号略少或无明显变化. 再灌注6h时，肝脏、肺脏中bFGF和TGFβ mRNA阳性信号均明显增加并达峰值. 再灌注24h时两种脏器中bFGF和TGFβ mRNA表达水平均接近于正常对照(图1，2).
图1 大鼠肠缺血再灌注损伤后肝脏TGFβ和bFGF mRNA表达.
, 百拇医药
图2 大鼠肠缺血再灌注损伤后肺脏TGFβ和bFGF mRNA表达.
3 讨论
bFGF是一种Mr16000的蛋白多肽，广泛分布于体内几乎所有组织. 体内实验发现，bFGF对成纤维细胞有强烈的促增殖效应，能刺激血管生成，对中胚层来源的细胞具有广泛的促进增殖和分化作用[4]. TGFβ是一种Mr23000的二聚体蛋白，在许多正常细胞中均有分布，尤以血液中血小板等贮存量最大. TGFβ的作用随自身浓度的不同而有所变化，低浓度时，它是中性粒细胞和巨噬细胞的趋化剂，高浓度时，可诱导其他多种生长因子的产生. bFGF和TGFβ在促进创伤愈合中均起重要作用，尤其是促进体表创面的修复作用已获得广泛认同. 但有关生长因子在促进内脏器官损伤修复中的研究却较少，特别是内脏损伤后内源性生长因子的作用尚未见报道. 肠道缺血再灌注作为一种典型的创伤，能同时引起多种脏器的损伤，这种损伤主要来源于中性粒细胞[5]、TNFa，IL-1等细胞因子的直接损伤[6]，内毒素的间接损伤[7]等. 已有实验证实应用外源性生长因子有助于受损内脏器官损伤后的修复[2]. 为此，我们应用常规组织学观察和原位杂交方法，通过观察肠缺血再灌注后肝、肺的损伤程度与内源性生长因子bFGF和TGFβ基因表达量的关系，探讨生长因子在内脏器官损伤修复中的作用.
, 百拇医药
研究结果显示，bFGF和TGFβ mRNA在正常的肝、肺组织中均存在一定的基础表达. 在肝脏中主要存在于肝细胞和肝血窦中，在肺脏中主要存在于肺泡上皮细胞和微静脉中. 肝脏、肺脏中bFGF的基础表达量均高于TGFβ. 这一方面说明两种生长因子对维持肝、肺的功能是必不可少的，另一方面显示bFGF对维持内脏正常生理功能的作用较TGFβ强. 组织学观察发现缺血再灌注6h时肝、肺的损伤最严重，这与Poggetti et al[8]通过检测其他指标的结果是一致的. 原位杂交结果显示此时bFGF和TGFβ mRNA表达水平显著增加，达到峰值. 再灌注24h后，肝、肺的组织学结构基本恢复，bFGF和TGFβ的mRNA水平也同时下降至正常水平.
两种生长因子mRNA表达量的变化与内脏器官损伤程度的时项呈显著正相关，说明bFGF和TGFβ在内脏损伤后的一系列细胞活动及组织修复中起重要作用.表明两种生长因子在内脏损伤后可能存在主动修复作用，而且是一种代偿性的自身保护机制. 而再灌注6h时损伤程度的加重，表明内源性生长因子在内脏损伤中自身保护的能力是有限的，这也部分解释了在伤前或缺血即刻应用外源性生长因子促进内脏损伤修复的机制.
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杨银辉，女，1966-04-28生，河北省阳原县人，汉族. 1989年武汉大学本科毕业，1996年军事医学科学院硕士，助理研究员，主要从事创伤修复机制的研究，发表论文7篇.
*国家杰出青年科学基金资助项目，No. 39525024.
通讯作者 杨银辉，100037，解放军304医院创伤研究室，北京市阜成路51号
*Supported by the National Outstanding Youth Research Programme of China, No. 39525024.
Correspondence to:YANG Yin-Hui, Trauma Lab, Chinese PLA, 304th Hospital, 51 Fuchenglu, Beijing 100037, China
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Tel. +86*10*66867396， Fax. +86*10*68429998
收稿日期 1998-06-10
4 参考文献
1 Lefter AM. Mechanisms of the protective effects of transforming growth factor-beta in reperfusion injury. Biochem Pharmacol, 1991;42(7):1323-1327
2 付小兵，P. Cuevas, 田惠民，盛志勇. 酸性成纤维细胞生长因子能减轻急性缺血与再灌注对骨骼肌的损伤. 解放军医学杂志，1995；20(2)：95-97
3 Josiah NW. Fundamental principles of in situ hybridization. J Histochem Cytochem, 1993;41(12):1725-1733
, http://www.100md.com
4 付小兵. 生长因子与创伤修复. 北京：人民军医出版社，1991：91-100
5 Schmeling DJ, Caty MG, Oldham KT, Guice KS, Hinshaw DB. Evidence for neutrophil-related acute lung injury after intestinal ischemia-reperfusion. Surgery, 1989;106(2):195-202
6 Caty MG, Guice KS, Oldham KT, Remick DG, Kunkel SI. Evidence for Tumor Necrosis Factor-induced pulmonary microvascular injury after intestinal ischemia-reperfusion injury. Ann Surg, 1990;212(6):694-700
7 Turnage RH, Guice KS, Oldham KT. Endotoxemia and remote organ injury following intestinal reperfusion. J Surg Res, 1994;56(6):571-578
8 Poggetti RS, Moore FA, Moore EE, Bensard DD, Anderson BO, Banerjee A. Liver injury is a reversible neutrophil-mediated event following gut ischemia. Arch Surg, 1992;127(2):175-179, 百拇医药