白细胞介素6及其受体在多发性骨髓瘤患者外周血中的表达及作用
作者：林红 黎燕 倪长源 赖春宁 黄晓军 沈倍奋 肖培根 陆道培
单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所(林红、黎燕、倪长源、赖春宁、沈倍奋)；中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所(肖培根)；北京医科大学人民医院血液病研究所(黄晓军、陆道培)
关键词：
中华医学杂志980821 本研究测定了多发性骨髓瘤(MM)患者血清的白细胞介素6(IL-6)及IL-6R水平，以及外周血单个核细胞(PMNC)中IL-6和IL-6R的mRNA表达，并通过凝胶阻滞电泳(EMSA)的方法对病变条件下IL-6与PMNC核内急性期蛋白反应因子(APRF)之间的关系进行探讨。
一、对象与方法
1.血清标本：MM血清取自北京医科大学附属人民医院血液科确诊的初次入院多发性骨髓瘤患者24例。正常血清取自中国人民解放军第三○七医院血站正常献血员29份。
, 百拇医药
2.抗体和试剂：重组人IL-6受体单克隆抗体、兔抗人IL-6受体抗血清、重组人可溶性IL-6R由军事医学科学院基础所分子免疫室自制[1]。重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所边疆惠赠。
3.IL-6生物学活性检测：用IL-6依赖性细胞系7TD1进行IL-6生物学活性测定。参见文献[2]。
4.sIL-6R的酶联免疫吸附测定(ELISA)法：采用双抗体夹心ELISA法测定可溶性IL-6(sIL-6R)水平。以sIL-6R单抗包被酶联板，加入标准抗原或待测样品, 然后加入兔抗人sIL-6R抗血清；加酶标抗体孵育后，以邻苯二胺显色，490 nm波长测定吸光度(A)值。
5.原位杂交：光敏生物素标记IL-6、IL-6R探针制备及原位杂交方法按文献[3]，固定剂固定后的细胞涂片经过脱水处理、预杂交和杂交等过程, 最终经AV-AP系统显色。
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6.凝胶阻滞电泳方法[4]：通过Klenow酶补平5′端，制备α-32p标记的APRF探针。用匀浆缓冲液(homoganization buffer)及核提取液(nuclear buffer)提取外周血单个核细胞的DNA结合蛋白。然后，取等量核蛋白提取液，加结合反应液(binding buffer)混匀，加32P- APRF探针，使之与核蛋白杂交。再经5%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶进行电泳，通过放射自显影后，分析结果。
7.统计学处理：试验结果以均数±标准差表示,2组间差异的显著性比较采用t检验。
二、结果
1.MM患者血清中IL-6活性和sIL-6R水平检测：sIL-6R的ELISA法在sIL-6R浓度10 ng/ml～1.6 μg/ml之间与A490nm值具有良好的线性关系，r=0.98。本方法检测sIL-6R的最低浓度在10 ng/ml。检测几种无关细胞因子(如IL-1、IL-2、TNFα、GM-CSF等)，均无交叉反应，特别是与sIL-6R同源性较高的sIL-4R的A490nm值也接近本底值。采用IL-6依赖性细胞株7TD1进行IL-6生物活性检测，并用上述ELISA法测定sIL-6R水平。结果表明，MM患者血清中IL-6水平明显高于正常人，t检验差异有非常显著意义(P<0.01 )。
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附表 MM患者血清中IL-6及sIL-6R
水平(
±s) 组别
例数
IL-6
(ng/L)
sIL-6R
(μg/L)
MM患者
24
667±272*
213±165*
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正常对照
29
112±40
73±78
注：与正常对照组比较，* P<0.01
2.MM患者外周血单核细胞中IL-6和IL-6R mRNA表达：利用原位杂交检测结果显示，MM患者PMNC中有IL-6和IL-6R mRNA表达，而正常人PMNC中则未检测到此表达。
3.MM患者PMNC在IL-6刺激后核因子APRF的变化：应用DNA结合蛋白的阻滞电泳方法观察到IL-6处理PMNC之后，MM患者PMNC中可见有APRF条带出现或加强，而正常人PMNC中则未见有APRF条带出现(见附图)。
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A.正常人PMNC(N)：1.N1；2.N1+IL-6；3.N2；4.N2+Il-6；5.N3；6.N3+IL-6；7.N4；8.N4+IL-6；B.MM患者PMNC(P)：1.P1；2.P1+IL-6；3.P2；4.P2+IL-6；5.P3；6.P3+IL-6；7.P4；8.P4+IL-6；箭头所示为APRF带附图 IL-6处理MM患者PMNC和正常
人PMNC的APRF活性阻滞电泳结果
三、讨论
研究证实，IL-6是MM细胞的生长刺激因子[5], 而可溶性IL-6R(sIL-6R)的水平与病人存活期的长短相关。
在IL-6介导的信号转导中，信号转导子和转录激活子-3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)起着重要作用，STAT3也称APRF。IL-6与其高亲和力受体系统形成复合物之后，诱导其受体β链(gp130)的胞内区发生酪氨酸磷酸化，并促使胞浆中的STAT蛋白激酶磷酸化，移向核内与相应靶基因结合，诱导表达。本结果表明，IL-6能够诱导MM患者PMNC的APRF活性产生或加强，而在正常人的PMNC中则无IL-6反应性的APRF活性出现。提示在MM条件下，IL-6信号转导途径中的某些调控机制(如蛋白激酶等)发生改变，使核因子APRF异常活化，诱导相应的靶基因异常表达，而在正常状态下则没有此生物学效应。
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参考文献
1 董家新，孙瑛勋，于鸣，等.抗人白介素6受体单抗的制备和鉴定.中国免疫学杂志，1997，13：170-173.
2 朱勇，金伯泉，孙忱，等.用7TD1细胞检测IL-6生物活性方法的改良.上海免疫学杂志，1992，12：106-108.
3 赖春宁，任蕴芳，董家新，等.人白介素6基因探针的制备及初步应用.上海免疫学杂志，1996，16：297-299.
4 Zhong Z, Wen Z,Darnell JE,et al.Stat3:A STAT family member activated by tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor and interleukin-6. Science，1994,264:95-98.
5 Shiao RT,Mcleskey SB,Khera SY,et al. Mechanisms of inhibition of IL-6-mediated immunoglobulin secretion by dexanethasone and suramin in human lymphoid and myeloma cell lines . Leuk Lymphoma, 1996, 21：293-299.
本课题为中国人民解放军总后勤部九五重点课题基金资助项目
(收稿：1997-11-18 修回：1998-03-27), http://www.100md.com
单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所(林红、黎燕、倪长源、赖春宁、沈倍奋)；中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所(肖培根)；北京医科大学人民医院血液病研究所(黄晓军、陆道培)
关键词：
中华医学杂志980821 本研究测定了多发性骨髓瘤(MM)患者血清的白细胞介素6(IL-6)及IL-6R水平，以及外周血单个核细胞(PMNC)中IL-6和IL-6R的mRNA表达，并通过凝胶阻滞电泳(EMSA)的方法对病变条件下IL-6与PMNC核内急性期蛋白反应因子(APRF)之间的关系进行探讨。
一、对象与方法
1.血清标本：MM血清取自北京医科大学附属人民医院血液科确诊的初次入院多发性骨髓瘤患者24例。正常血清取自中国人民解放军第三○七医院血站正常献血员29份。
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2.抗体和试剂：重组人IL-6受体单克隆抗体、兔抗人IL-6受体抗血清、重组人可溶性IL-6R由军事医学科学院基础所分子免疫室自制[1]。重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所边疆惠赠。
3.IL-6生物学活性检测：用IL-6依赖性细胞系7TD1进行IL-6生物学活性测定。参见文献[2]。
4.sIL-6R的酶联免疫吸附测定(ELISA)法：采用双抗体夹心ELISA法测定可溶性IL-6(sIL-6R)水平。以sIL-6R单抗包被酶联板，加入标准抗原或待测样品, 然后加入兔抗人sIL-6R抗血清；加酶标抗体孵育后，以邻苯二胺显色，490 nm波长测定吸光度(A)值。
5.原位杂交：光敏生物素标记IL-6、IL-6R探针制备及原位杂交方法按文献[3]，固定剂固定后的细胞涂片经过脱水处理、预杂交和杂交等过程, 最终经AV-AP系统显色。
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6.凝胶阻滞电泳方法[4]：通过Klenow酶补平5′端，制备α-32p标记的APRF探针。用匀浆缓冲液(homoganization buffer)及核提取液(nuclear buffer)提取外周血单个核细胞的DNA结合蛋白。然后，取等量核蛋白提取液，加结合反应液(binding buffer)混匀，加32P- APRF探针，使之与核蛋白杂交。再经5%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶进行电泳，通过放射自显影后，分析结果。
7.统计学处理：试验结果以均数±标准差表示,2组间差异的显著性比较采用t检验。
二、结果
1.MM患者血清中IL-6活性和sIL-6R水平检测：sIL-6R的ELISA法在sIL-6R浓度10 ng/ml～1.6 μg/ml之间与A490nm值具有良好的线性关系，r=0.98。本方法检测sIL-6R的最低浓度在10 ng/ml。检测几种无关细胞因子(如IL-1、IL-2、TNFα、GM-CSF等)，均无交叉反应，特别是与sIL-6R同源性较高的sIL-4R的A490nm值也接近本底值。采用IL-6依赖性细胞株7TD1进行IL-6生物活性检测，并用上述ELISA法测定sIL-6R水平。结果表明，MM患者血清中IL-6水平明显高于正常人，t检验差异有非常显著意义(P<0.01 )。
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附表 MM患者血清中IL-6及sIL-6R
水平(
±s) 组别例数
IL-6
(ng/L)
sIL-6R
(μg/L)
MM患者
24
667±272*
213±165*
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正常对照
29
112±40
73±78
注：与正常对照组比较，* P<0.01
2.MM患者外周血单核细胞中IL-6和IL-6R mRNA表达：利用原位杂交检测结果显示，MM患者PMNC中有IL-6和IL-6R mRNA表达，而正常人PMNC中则未检测到此表达。
3.MM患者PMNC在IL-6刺激后核因子APRF的变化：应用DNA结合蛋白的阻滞电泳方法观察到IL-6处理PMNC之后，MM患者PMNC中可见有APRF条带出现或加强，而正常人PMNC中则未见有APRF条带出现(见附图)。
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A.正常人PMNC(N)：1.N1；2.N1+IL-6；3.N2；4.N2+Il-6；5.N3；6.N3+IL-6；7.N4；8.N4+IL-6；B.MM患者PMNC(P)：1.P1；2.P1+IL-6；3.P2；4.P2+IL-6；5.P3；6.P3+IL-6；7.P4；8.P4+IL-6；箭头所示为APRF带附图 IL-6处理MM患者PMNC和正常
人PMNC的APRF活性阻滞电泳结果
三、讨论
研究证实，IL-6是MM细胞的生长刺激因子[5], 而可溶性IL-6R(sIL-6R)的水平与病人存活期的长短相关。
在IL-6介导的信号转导中，信号转导子和转录激活子-3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)起着重要作用，STAT3也称APRF。IL-6与其高亲和力受体系统形成复合物之后，诱导其受体β链(gp130)的胞内区发生酪氨酸磷酸化，并促使胞浆中的STAT蛋白激酶磷酸化，移向核内与相应靶基因结合，诱导表达。本结果表明，IL-6能够诱导MM患者PMNC的APRF活性产生或加强，而在正常人的PMNC中则无IL-6反应性的APRF活性出现。提示在MM条件下，IL-6信号转导途径中的某些调控机制(如蛋白激酶等)发生改变，使核因子APRF异常活化，诱导相应的靶基因异常表达，而在正常状态下则没有此生物学效应。
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参考文献
1 董家新，孙瑛勋，于鸣，等.抗人白介素6受体单抗的制备和鉴定.中国免疫学杂志，1997，13：170-173.
2 朱勇，金伯泉，孙忱，等.用7TD1细胞检测IL-6生物活性方法的改良.上海免疫学杂志，1992，12：106-108.
3 赖春宁，任蕴芳，董家新，等.人白介素6基因探针的制备及初步应用.上海免疫学杂志，1996，16：297-299.
4 Zhong Z, Wen Z,Darnell JE,et al.Stat3:A STAT family member activated by tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor and interleukin-6. Science，1994,264:95-98.
5 Shiao RT,Mcleskey SB,Khera SY,et al. Mechanisms of inhibition of IL-6-mediated immunoglobulin secretion by dexanethasone and suramin in human lymphoid and myeloma cell lines . Leuk Lymphoma, 1996, 21：293-299.
本课题为中国人民解放军总后勤部九五重点课题基金资助项目
(收稿：1997-11-18 修回：1998-03-27), http://www.100md.com