抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体细胞株的建立
作者：李燕俊 韩春卉 张靖 罗雪云
单位：李燕俊(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；韩春卉(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；张靖(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；罗雪云(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)
关键词：黄曲霉毒素M1；单克隆抗体
摘要摘要：本研究建立了抗黄曲霉毒素AFM1的单克隆抗体细胞株。用AFM1-肟-牛血清白蛋白(AFM1-oxime-BSA)偶联物免疫Ba1b/c小鼠后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合，经3～4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3G2，3G3，6G8。3株抗体均属IgG1亚类。培养上清液的稀释度为1∶2 000～1∶12 800，腹水的抗体稀释度为1∶3.2×106～1∶20×107，参考工作稀释度为1∶1×106～1∶2.5×106。3G3和6G8抗体的IgG含量分别为0.8和1.43 g/L，亲和常数分别为5.438和4.369。6G8抗体与其它类型黄曲霉毒素均无交叉反应。
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中图分类号：R155.51 TS207.4 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)01-0059-03
Establishment of monoclonal antibodies against aflatoxin M1
Li Yanjun,Han Chunhui,Zhang Jing,Luo Xueyun
(Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China)
Abstract：The monoclonal antibodies against aflatoxin M1 were established.Spleen cells from Balb/c mice immunized with AFM1-oxime-BSA conjugate were fused with murine Sp2/0 myeloma cells.Three hybridoma cell lines secretine monoclonal antibodies against AFM1 were established after the fusion cells subcloned for 3～4 cycles.These antibodies were disignated as 3G2,3G3 and 6G8,respectively.All of them belonged to the subtype of IgG1.The titres of the antibody in ascites ranged from 1∶3.2×106～1∶20×106。There was no cross reaction between 6G8 monoclone antibody and other types of aflatoxin.
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Key words：aflatoxin M1, monoclonal antibody
黄曲霉毒素M1(AFM1)是动物摄入黄曲霉毒素B1(AFB1)后的代谢产物，以在动物乳中最为常见，乳与乳制品中的AFM1在生产和贮藏期间相对稳定，用巴氏消毒法难以破坏[1]。AFM1的急性毒性与AFB1大致相同，也具有致突变性和致癌性[2]。我国于1988年规定了牛乳中AFM1的允许限量标准为0.5μg/kg，乳制品按含牛乳量折算。由于AFM1的危害，国内外均有降低其限量标准的趋势。目前我国的国标方法是薄层色谱法，该法用目测半定量，已不适应需要，且需大量接触标准品，不利于保护操作者的健康。为此我们建立了免疫检测方法，即建立在单克隆抗体基础上的ELISA法，本法具备简单、快速、高灵敏度、高特异性、可同时检测大量样品等多项优点，值得在我国推广。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
AFM1-oxime-BSA偶联物、AFM1、AFM2、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、HAT及HT选择性培养基、HEPES、8-氮杂鸟嘌呤、降植烷(pristane)、福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)、吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW 1000)、抗体亚类分型试剂(IgM、IgG、IgA、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、3，3’，5，5’-四甲基联苯氨(TMB)、蛋白分子量标准(中范围)均购自Sigma公司。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司、RPMI 1640培养基和新生小牛血清(杭州四季青公司购自邦定医学公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自中山试剂公司。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由中国预防医学科学院微生物学流行病学研究所惠赠，经传代并经8-氮杂鸟嘌呤处理。Balb/c小鼠、昆明小鼠均购自中国医学科学院实验动物研究所动物繁育场。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 免疫动物及细胞融合 对8周龄雌性Balb/c小鼠(体重18～22g)，首次免疫用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏完全佐剂混匀，腹腔注射。3周后第一批用10μgAFM1-oxime-BSA脾内注射，3天后取脾融合。第二批再用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏不完全佐剂混匀后，腹腔注射追加免疫，3周后用10μg AFM1-oxime-BSA脾内注射，3天后按常规方法取脾融合。当镜检杂交瘤克隆生长达1/3～1/2视野时，取上清液进行筛选。
1.2.2 杂交瘤筛选及抗体检测 以AFM1-oxime-BSA为包被抗原，用间接非竞争性ELISA法筛选分泌抗AFM1抗体的细胞孔，用毒素间接竞争抑制性ELISA法确证。以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为阴性对照，阳性细胞孔的判定标准为(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1。
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1.2.3 杂交瘤细胞的克隆化 采用培养瓶内准确计数稀释法[3]，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。
1.2.4 单克隆抗体的生产 采用动物体内诱生单克隆抗体的方法。吹打培养的杂交瘤细胞，1000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至2×106/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml杂交瘤细胞，并同时于对侧腹腔注射0.5ml降植烷和不完全福氏佐剂混合物(1∶1混合)，10～14天后收集腹水。
1.2.5 单克隆抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化[4]，对文献方法略加改进。
1.3 单克隆抗体的鉴定
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抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用双向免疫扩散法[5]。抗体的IgG含量采用紫外分光光度法测定。抗体的分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法[6]。抗体滴度测定以AFM1-oxime-BSA为包被抗原，从1∶100倍开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2/0细胞培养上清为阴性对照，用间接非竞争性ELISA方法测定抗体滴度。以(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1的最大稀释倍数为滴定终点。抗体亲和力的测定系采用间接非竞争性ELISA法，即测定各抗体的亲和常数[6]。抗体特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M2和载体蛋白BSA。
2 结果
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2.1 单克隆抗体的制备
用AFM1-oxime-BSA免疫Balb/c小鼠获得了较好的免疫应答。共进行了四次成功的细胞融合，经三步试验筛选，并用间接竞争性ELIS确证，从中选择对AFM1有强抑制而对对照孔阳性较强的细胞，经3～4次亚克隆，建立了稳定分泌抗AFM1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3G2，3G3，6G8，半年内对获得的细胞株进行多次冻融，其分泌抗体的能力和稳定性均无改变。
2.2 单克隆抗体的鉴定
应用已获得的3株细胞制备了大量的腹水，3株抗AFM1的抗体均为IgG1亚类，其各项指标如附表所示。其中3G3抗体对AFM1最为敏感，其次为6G8抗体。此2株抗体和载体蛋白BSA及AFM2均无交叉反应，且6G8抗体与AFB1、AFG1也无交叉反应。
, 百拇医药
附表 单克隆抗体的特点(1)
杂交瘤 细胞系
抗体亚类
分子量
(KD)
IgG含量
(g/l)
培养上清
稀释度
腹水稀释度
参考工作
稀释度
, http://www.100md.com 亲和常数
(k)
3G2
IgG1
-
-
1∶2000
1∶3.2×106
1∶1×106
-
3G3
IgG1
, 百拇医药
-
0.8
1∶3200
1∶2×107
1∶2.5×106
5.438
6G8
IgG1
68
1.43
1∶12800
1∶2×107
, http://www.100md.com
1∶1×106
4.369
杂交瘤
细胞系
敏感范围
(ng/ml)
线性范围
(ng/ml)
50%抑制
浓度(ng/ml)
与AFM2
交叉
, http://www.100md.com
与AFB1
AFG1交叉
与AFB2
AFG2交叉
与载体
BSA交叉
3G2
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
不交叉
3G3
0.1～500
2～200
10.4
不交叉
交叉
不交叉
不交叉
6G8
1.0～500
5～100
, 百拇医药
16.2
不交叉
不交叉
不交叉
不交叉
注：(1)—：未作此项实验
3 讨论
AFM1是黄曲霉毒素B1在动物体内的主要衍生物，具有与AFM1相同的毒性，可致动物肿瘤。国内外的资料均提示AFM1的污染广泛，因而有必要建立敏感性好、特异性强、简便快速的免疫检测方法。
本次研究中采用了2种免疫方案，即1次基础免疫后追加脾内免疫和2次基础免疫后追加脾内免疫。经过实验对照，2种方法的融合率和阳性克隆率无明显差别，故从缩短实验周期考虑，一次基础免疫后追加脾内免疫完全可满足激活动物免疫应答的需要。
, 百拇医药
经典的单克隆抗体制备中，细胞克隆化技术多采用有限稀释法，需要进行系列稀释，操作繁琐，对细胞计数的要求也较高，工作量大，需要的克隆轮次较多。本实验中采用了培养瓶内准确计数细胞稀释法，提高了实验效率，减少了克隆轮次，在较短的时间内，得到了分泌目标单克隆抗体的细胞株。
传统的腹水法生产单克隆抗体，需在腹腔注射杂交瘤细胞株一周前先用降植烷处理小鼠，灭活腹腔巨噬细胞，以增加腹水含量。本研究在腹腔注射杂交瘤细胞株的同时，在对侧腹腔注射降植烷和福氏不完全佐剂的混合液，效果良好，一次约可采取6～7ml腹水，简化了实验步骤。
黄曲霉毒素在自然界中有许多衍生物。由于其结构极其相似，建立在多克隆抗体基础上的AFM1检测方法多与其它黄曲霉素发生交叉反应，而使其应用价值降低[7，8]。应用目前经典的单克隆抗体技术，也很难制备针对这种微小差别的特异性抗体，我国尚未能成功制备分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株，仅由上海细胞生物学研究所报道制备了5株分泌抗AFM1的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株，并且该抗体与黄曲霉素B1有严重的交叉反应[9]。本研究制备了3株分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株3G2、3G3和6G8，并测定了3G3、6G8抗体与其它黄曲霉毒素的交叉反应情况，其中3G3抗体与黄曲霉毒素B1,G1有交叉反应，6G8抗全则与其它黄曲霉毒素均无交叉反应，因而采用6G8抗体建立的ELISA方法可确保具有高度的特异性。
, 百拇医药
基金项目：卫生部科研基金项目(No.94-1-074)
作者简介：李燕俊，女，硕士，助理研究员
参考文献
1，Heish DP.Cancer risks posed by aflatoxin M1.Princess Takamatsu Symp 1985,16:57—65
2，Bujons J.Aflatoxin M1 8,9-epoxide:preparation and mutagenic activiy.Chemica Research of Toxicology.1995,8(3):328—32
3，马世兴.准确快速的细胞克隆化实验研究.单克隆抗体通讯，1993，9(2)：70—72
, http://www.100md.com
4，徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1991：125
5，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.金冬雁，等译.第2版.北京：科学出版社，1996，880—887
6，万文徽.单克隆抗体亲和常数的测定.单克隆抗体通讯，1993，9(2)：72—75
7，Jackman.Determination of aflatoxins by enzyme-linked immunosorbent assay with special reference to afiatoxin M1 in raw mild. J Food Agri,1985,36:685—698
8，WHO. Prodution and characterization of antibody against aflatoxin M1.Experientia,1979,35:1104—1107
9，季永镛.分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株的建立及其特性的研究.生物工程学报，1992，8(2)：150—156
(1999-07-19收稿), 百拇医药
单位：李燕俊(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；韩春卉(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；张靖(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)；罗雪云(卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021)
关键词：黄曲霉毒素M1；单克隆抗体
摘要摘要：本研究建立了抗黄曲霉毒素AFM1的单克隆抗体细胞株。用AFM1-肟-牛血清白蛋白(AFM1-oxime-BSA)偶联物免疫Ba1b/c小鼠后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合，经3～4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3G2，3G3，6G8。3株抗体均属IgG1亚类。培养上清液的稀释度为1∶2 000～1∶12 800，腹水的抗体稀释度为1∶3.2×106～1∶20×107，参考工作稀释度为1∶1×106～1∶2.5×106。3G3和6G8抗体的IgG含量分别为0.8和1.43 g/L，亲和常数分别为5.438和4.369。6G8抗体与其它类型黄曲霉毒素均无交叉反应。
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中图分类号：R155.51 TS207.4 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)01-0059-03
Establishment of monoclonal antibodies against aflatoxin M1
Li Yanjun,Han Chunhui,Zhang Jing,Luo Xueyun
(Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China)
Abstract：The monoclonal antibodies against aflatoxin M1 were established.Spleen cells from Balb/c mice immunized with AFM1-oxime-BSA conjugate were fused with murine Sp2/0 myeloma cells.Three hybridoma cell lines secretine monoclonal antibodies against AFM1 were established after the fusion cells subcloned for 3～4 cycles.These antibodies were disignated as 3G2,3G3 and 6G8,respectively.All of them belonged to the subtype of IgG1.The titres of the antibody in ascites ranged from 1∶3.2×106～1∶20×106。There was no cross reaction between 6G8 monoclone antibody and other types of aflatoxin.
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Key words：aflatoxin M1, monoclonal antibody
黄曲霉毒素M1(AFM1)是动物摄入黄曲霉毒素B1(AFB1)后的代谢产物，以在动物乳中最为常见，乳与乳制品中的AFM1在生产和贮藏期间相对稳定，用巴氏消毒法难以破坏[1]。AFM1的急性毒性与AFB1大致相同，也具有致突变性和致癌性[2]。我国于1988年规定了牛乳中AFM1的允许限量标准为0.5μg/kg，乳制品按含牛乳量折算。由于AFM1的危害，国内外均有降低其限量标准的趋势。目前我国的国标方法是薄层色谱法，该法用目测半定量，已不适应需要，且需大量接触标准品，不利于保护操作者的健康。为此我们建立了免疫检测方法，即建立在单克隆抗体基础上的ELISA法，本法具备简单、快速、高灵敏度、高特异性、可同时检测大量样品等多项优点，值得在我国推广。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
AFM1-oxime-BSA偶联物、AFM1、AFM2、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、HAT及HT选择性培养基、HEPES、8-氮杂鸟嘌呤、降植烷(pristane)、福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)、吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW 1000)、抗体亚类分型试剂(IgM、IgG、IgA、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、3，3’，5，5’-四甲基联苯氨(TMB)、蛋白分子量标准(中范围)均购自Sigma公司。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司、RPMI 1640培养基和新生小牛血清(杭州四季青公司购自邦定医学公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自中山试剂公司。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由中国预防医学科学院微生物学流行病学研究所惠赠，经传代并经8-氮杂鸟嘌呤处理。Balb/c小鼠、昆明小鼠均购自中国医学科学院实验动物研究所动物繁育场。
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1.2 实验方法
1.2.1 免疫动物及细胞融合 对8周龄雌性Balb/c小鼠(体重18～22g)，首次免疫用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏完全佐剂混匀，腹腔注射。3周后第一批用10μgAFM1-oxime-BSA脾内注射，3天后取脾融合。第二批再用100μgAFM1-oxime-BSA与等量福氏不完全佐剂混匀后，腹腔注射追加免疫，3周后用10μg AFM1-oxime-BSA脾内注射，3天后按常规方法取脾融合。当镜检杂交瘤克隆生长达1/3～1/2视野时，取上清液进行筛选。
1.2.2 杂交瘤筛选及抗体检测 以AFM1-oxime-BSA为包被抗原，用间接非竞争性ELISA法筛选分泌抗AFM1抗体的细胞孔，用毒素间接竞争抑制性ELISA法确证。以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为阴性对照，阳性细胞孔的判定标准为(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1。
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1.2.3 杂交瘤细胞的克隆化 采用培养瓶内准确计数稀释法[3]，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取1ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。
1.2.4 单克隆抗体的生产 采用动物体内诱生单克隆抗体的方法。吹打培养的杂交瘤细胞，1000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至2×106/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml杂交瘤细胞，并同时于对侧腹腔注射0.5ml降植烷和不完全福氏佐剂混合物(1∶1混合)，10～14天后收集腹水。
1.2.5 单克隆抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化[4]，对文献方法略加改进。
1.3 单克隆抗体的鉴定
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抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用双向免疫扩散法[5]。抗体的IgG含量采用紫外分光光度法测定。抗体的分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法[6]。抗体滴度测定以AFM1-oxime-BSA为包被抗原，从1∶100倍开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2/0细胞培养上清为阴性对照，用间接非竞争性ELISA方法测定抗体滴度。以(A试验—A空白)/(A对照—A空白)≥2.1的最大稀释倍数为滴定终点。抗体亲和力的测定系采用间接非竞争性ELISA法，即测定各抗体的亲和常数[6]。抗体特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M2和载体蛋白BSA。
2 结果
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2.1 单克隆抗体的制备
用AFM1-oxime-BSA免疫Balb/c小鼠获得了较好的免疫应答。共进行了四次成功的细胞融合，经三步试验筛选，并用间接竞争性ELIS确证，从中选择对AFM1有强抑制而对对照孔阳性较强的细胞，经3～4次亚克隆，建立了稳定分泌抗AFM1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3G2，3G3，6G8，半年内对获得的细胞株进行多次冻融，其分泌抗体的能力和稳定性均无改变。
2.2 单克隆抗体的鉴定
应用已获得的3株细胞制备了大量的腹水，3株抗AFM1的抗体均为IgG1亚类，其各项指标如附表所示。其中3G3抗体对AFM1最为敏感，其次为6G8抗体。此2株抗体和载体蛋白BSA及AFM2均无交叉反应，且6G8抗体与AFB1、AFG1也无交叉反应。
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附表 单克隆抗体的特点(1)
杂交瘤 细胞系
抗体亚类
分子量
(KD)
IgG含量
(g/l)
培养上清
稀释度
腹水稀释度
参考工作
稀释度
, http://www.100md.com 亲和常数
(k)
3G2
IgG1
-
-
1∶2000
1∶3.2×106
1∶1×106
-
3G3
IgG1
, 百拇医药
-
0.8
1∶3200
1∶2×107
1∶2.5×106
5.438
6G8
IgG1
68
1.43
1∶12800
1∶2×107
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1∶1×106
4.369
杂交瘤
细胞系
敏感范围
(ng/ml)
线性范围
(ng/ml)
50%抑制
浓度(ng/ml)
与AFM2
交叉
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与AFB1
AFG1交叉
与AFB2
AFG2交叉
与载体
BSA交叉
3G2
-
-
-
-
-
, 百拇医药
-
不交叉
3G3
0.1～500
2～200
10.4
不交叉
交叉
不交叉
不交叉
6G8
1.0～500
5～100
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16.2
不交叉
不交叉
不交叉
不交叉
注：(1)—：未作此项实验
3 讨论
AFM1是黄曲霉毒素B1在动物体内的主要衍生物，具有与AFM1相同的毒性，可致动物肿瘤。国内外的资料均提示AFM1的污染广泛，因而有必要建立敏感性好、特异性强、简便快速的免疫检测方法。
本次研究中采用了2种免疫方案，即1次基础免疫后追加脾内免疫和2次基础免疫后追加脾内免疫。经过实验对照，2种方法的融合率和阳性克隆率无明显差别，故从缩短实验周期考虑，一次基础免疫后追加脾内免疫完全可满足激活动物免疫应答的需要。
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经典的单克隆抗体制备中，细胞克隆化技术多采用有限稀释法，需要进行系列稀释，操作繁琐，对细胞计数的要求也较高，工作量大，需要的克隆轮次较多。本实验中采用了培养瓶内准确计数细胞稀释法，提高了实验效率，减少了克隆轮次，在较短的时间内，得到了分泌目标单克隆抗体的细胞株。
传统的腹水法生产单克隆抗体，需在腹腔注射杂交瘤细胞株一周前先用降植烷处理小鼠，灭活腹腔巨噬细胞，以增加腹水含量。本研究在腹腔注射杂交瘤细胞株的同时，在对侧腹腔注射降植烷和福氏不完全佐剂的混合液，效果良好，一次约可采取6～7ml腹水，简化了实验步骤。
黄曲霉毒素在自然界中有许多衍生物。由于其结构极其相似，建立在多克隆抗体基础上的AFM1检测方法多与其它黄曲霉素发生交叉反应，而使其应用价值降低[7，8]。应用目前经典的单克隆抗体技术，也很难制备针对这种微小差别的特异性抗体，我国尚未能成功制备分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株，仅由上海细胞生物学研究所报道制备了5株分泌抗AFM1的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株，并且该抗体与黄曲霉素B1有严重的交叉反应[9]。本研究制备了3株分泌抗AFM1的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株3G2、3G3和6G8，并测定了3G3、6G8抗体与其它黄曲霉毒素的交叉反应情况，其中3G3抗体与黄曲霉毒素B1,G1有交叉反应，6G8抗全则与其它黄曲霉毒素均无交叉反应，因而采用6G8抗体建立的ELISA方法可确保具有高度的特异性。
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基金项目：卫生部科研基金项目(No.94-1-074)
作者简介：李燕俊，女，硕士，助理研究员
参考文献
1，Heish DP.Cancer risks posed by aflatoxin M1.Princess Takamatsu Symp 1985,16:57—65
2，Bujons J.Aflatoxin M1 8,9-epoxide:preparation and mutagenic activiy.Chemica Research of Toxicology.1995,8(3):328—32
3，马世兴.准确快速的细胞克隆化实验研究.单克隆抗体通讯，1993，9(2)：70—72
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4，徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1991：125
5，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.金冬雁，等译.第2版.北京：科学出版社，1996，880—887
6，万文徽.单克隆抗体亲和常数的测定.单克隆抗体通讯，1993，9(2)：72—75
7，Jackman.Determination of aflatoxins by enzyme-linked immunosorbent assay with special reference to afiatoxin M1 in raw mild. J Food Agri,1985,36:685—698
8，WHO. Prodution and characterization of antibody against aflatoxin M1.Experientia,1979,35:1104—1107
9，季永镛.分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株的建立及其特性的研究.生物工程学报，1992，8(2)：150—156
(1999-07-19收稿), 百拇医药