哮喘患者嗜酸细胞及其阳离子蛋白的痰液检测
作者：张丹 杨振峰
单位：张丹(第一军医大学珠江医院呼吸科，广东 广州 510282)；杨振峰(第一军医大学珠江医院呼吸科，广东 广州 510282)
关键词：哮喘；嗜酸细胞；阳离子蛋白；痰液检测
第一军医大学学报000345 摘要：嗜酸细胞及其阳离子蛋白在哮喘发病中具有重要地位，从血清、肺泡灌洗液和痰液中均可检测出其水平，其中痰检是一项有效、可行、反映性好、可重复进行的无创性方法。痰检有望进一步改进和完善，成为哮喘评定的一项有效指标。
中图分类号：R562.25 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0283-02
哮喘是多种炎性细胞、炎症介质共同参与的慢性气道炎症，检测细胞因子、炎症介质最直接、可靠的方法是获取炎症局部的体液、组织，如支气管粘膜活检、支气管肺泡灌洗液及痰液检测，均能直接、特异地反映局部炎症。其中痰液检测是一项简单易行、准确率较高、不受病情限制且安全的非侵入性方法。参与哮喘发病的多种炎性细胞、炎性介质及细胞因子都可从痰中检出。本文就目前国内外关于哮喘患者痰中嗜酸细胞(EOS)及其阳离子蛋白(ECP)的含量与临床意义的研究进展综述如下。
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1 痰液收集
哮喘患者痰液收集可分为自发痰和诱导痰两种。停服支气管扩张剂6 d，让患者自发地将痰咳至一无菌容器中，即得到自主痰。诱导痰则先吸入沙丁胺醇(喘乐宁)，以抑制诱导过程中可能发生的气道收缩，用高渗盐水雾化吸入，逐渐增高吸入盐水的浓度(3%、4%和5%)，每次7 min，每个吸入浓度后均测FEV1.0以保证安全，同时要求患者漱口咽水，用鼻呼吸，以降低唾液和鼻后滴的污染，再尽力将痰咳至容器内。
诱导痰与自发痰在痰重、总细胞计数、非鳞状细胞比例和类胰蛋白酶水平等方面相近，但自发痰中细胞活力低，诱导痰中活性细胞比例高，鳞状细胞污染少，可以代表深部流体段(fluid-phase)的痰液[1]。诱导痰收集后用倒置显微镜选择没有唾液污染的来自下呼吸道的痰栓，包括所有粘液和密度高的部分。Spanevello 等[2]比较了选择痰和整个痰，二者均可代表下气道的分泌物，具有诊断价值，但选择痰的EOS计数和ECP含量更高，鳞状细胞污染更少。
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经选择后的诱导痰还需进行处理，以减少鳞状细胞的污染并分散细胞，提高ECP水平。处理方法常有：(1)咳痰之前先将唾液(稀薄部分)吐弃，再将痰(粘稠部分)吐入无菌容器内[3]；(2)用PBS(磷酸缓冲盐)处理痰；或(3)用DTT(二巯基苏糖醇)处理。DTT通过除去巯基修饰物中保护巯基的集团，达到细胞分离。DTT可能会降低细胞成活力，但与PBS处理比较，总细胞计数和ECP水平较高，分化细胞比例、IL-5、IL-8等相近，所以DTT处理诱导痰可以有效分离细胞，使ECP水平增高，而且不影响其它介质的检测[4]。
2 哮喘患者痰中EOS、ECP变化
EOS是哮喘中的主要炎性细胞，激活时释放多种蛋白，这些蛋白的生物学功能及其在不同组织中的浓度反映了EOS在疾病中的组织学和临床表现中的作用，其中ECP最为重要。利用放射免疫分析法可以检测ECP在不同组织体液(如血清、痰、支气管肺泡灌洗液(BALF)和鼻灌洗液等)中的水平。
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2.1 EOS、ECP水平与哮喘临床表现的关系
许多研究表明哮喘患者诱导痰中EOS计数和ECP水平显著增高。Spanevello[5]等检测了53例稳定期哮喘患者痰中EOS百分数为(12.2±12.9)%、ECP水平为(827±491)mg/L，与鼻炎[EOS：(0.4±0.8)%、ECP：(127±82)mg/L]和正常对照组[EOS：(0.4±0.7)%、ECP：(157±203)mg/L]相比均升高。Pizzichini[6]等将9例哮喘患者同20例对照(其中正常受试者10例，非阻塞性有吸烟史的支气管炎者10例)进行了统计学检验，结果痰中EOS比例为 5.2%：0.3% ，P < 0.001；ECP含量比为1 040.0 mg/L：455.3 mg/L，P=0.001。由此可见痰中EOS计数与ECP水平具有显著的相关性[7](r=0.532，P<0.01)。同时，EOS计数和ECP水平与平均每周总的症状得分呈显著正相关(r分别为0.52和 0.48)，与平均PEFR呈负相关(r分别为 -0.50和 -0.65)。这些结果表明了气道内EOS的活化可以反映哮喘的症状和气道梗阻[8]。哮喘患者在发作期间最大峰值流速(PEF)明显降低，痰中EOS、ECP水平与PEFR的平均值及呼气流速和PC20呈负相关[8，9]，痰中ECP与FEV1.0%呈显著负相关[10]。
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Fahy[11]对8例哮喘受试者气雾性刺激前后诱导痰中的成分进行了检测和分析，发现诱导痰中EOS平均百分数在过敏原刺激后4 h由0.5%升至12.0% (P<0.05)，并持续至24 h。而ECP水平在刺激后4 h也由39.8升至151.3 mg/L (P<0.05)，且在24 h更高。Fujimoto[8]等还发现痰中ECP水平随哮喘程度加重而显著升高，而EOS仅在重症哮喘升高明显，在轻、中度哮喘无明显差异。哮喘有症状患者痰中ECP比无症状患者高。ECP为EOS活化产物，较EOS指标更为敏感、准确地反映哮喘的严重程度，痰中ECP水平可作为评估哮喘严重程度和监控气道炎症的一项有意义指标[8，12]。
然而，Pizzichizzi[6]应用在接受- 操作特征性(ROC)曲线上定点数据的方法检测实验的灵敏度和特异度时，比较了各种指标的曲线下面积，发现尽管痰中ECP的曲线下面积大于血EOS和血清ECP的曲线下面积，但差异不显著(P≥0.1)，可能为偶然结果，痰中EOS计数则比血清EOS计数更准确。痰液检测早在40年前已有报道，但只是在最近5年才开始发展。大多数学者研究显示哮喘患者痰中EOS、ECP改变与哮喘的临床表现(包括症状出现、肺功能改变、严重等级)是一致的，但此类实验的重复率还不充分，研究例数不够大，少数结果依然存在争议。目前对哮喘进行诊断、评估的指标很多，据统计，在已确诊的哮喘患者，组织胺激发试验的敏感度为48%、PEF测定为65%、痰中ECP敏感度为74%、血清ECP为78%，认为可通过改进痰检测来提高哮喘监控指标的敏感性[13]。
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2.2 在疾病鉴别诊断中的应用
诊断哮喘的同时需要与慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等均可引起气道梗阻和肺功能改变的疾病进行鉴别诊断。以往通过临床表现及肺功能变化的可逆性来鉴别，其客观性不够完善。既然多种体液中ECP水平在哮喘发作时显著升高，那么在其他类型肺部疾病中是否也有同样变化呢？ 前已述及，哮喘患者痰中EOS、ECP明显高于慢性支气管炎患者[9]。Virchow[14]在对7例支气管哮喘与7例慢性支气管炎患者的对比中也发现，每克痰中ECP的浓度在哮喘为(893.4±346.2)mg/L，在慢性支气管炎为(30.0±8.5)mg/L(P=0.002)，并且哮喘患者痰ECP与气道梗阻的程度呈正相关(r=0.76，P =0.05)，而慢性支气管炎患者此相关性不显著(r=0.24，P>0.05)。
Motofima[15]等报道，哮喘患者血清 ECP明显高于COPD患者，血清 ECP与(FEV1.0)% 呈明显负相关，与痰中ECP也显著相关，可以作为鉴别诊断指标之一。但对此也有争议。通常认为，COPD气道炎症以中性粒细胞浸润为主，哮喘以 EOS浸润为主，但有实验发现二者痰中ECP 均升高，哮喘患者每克痰中 ECP浓度为(984.5±1 245.5)mg/L，COPD患者为(417.5±36.5)mg/L，两种病人间无显著差别，不能用作哮喘与COPD的鉴别诊断依据[16，17]。
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2.3 疗效评定
糖皮质激素是哮喘治疗首选的抗炎药物。国内有学者发现哮喘患者经糖皮质激素治疗后，痰中EOS百分数由(11.6±1.7)%降至(4.1±0.7 )%、ECP由(500.3±49.6 )mg/L降至(59.8±10.9 )mg/L，治疗前后有显著差异(P<0.01)[18]。Pizzichini [10]等报道，用强的松治疗后，哮喘的症状、FEV1、血清EOS和ECP在第一个24 h内即有改善，而痰中EOS和ECP直到48 h后才改善，痰液指标恢复晚，提示应用痰液检测EOS和ECP可作为评价治疗效果的一个动态指标。但也有报道[19]，痰液或血清中ECP与PC20 以及痰中ECP与FEV1.0之间的相关性较弱。
多年以来β2受体激动剂仍为临床治疗哮喘的最常用药物之一，Mcivor [20]用其替代激素对比治疗，发现患者用药后虽然症状和肺功能可以达到正常，但痰液检测EOS和ECP水平反而有所升高，提示β2受体激动剂的症状控制作用可能掩盖了病情恶化。已有较多学者将痰液检测EOS和ECP作为疗效评定的一个重要指标。
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3 痰液检测与血清学、BALF检测比较
Sorva[21]等对小儿哮喘患者进行了痰和血清ECP的比较，发现痰和血清中ECP水平较正常受试者高，但痰中ECP与正常受试者的差异更显著，治疗后临床改善伴有痰ECP下降，而血清ECP无变化，可认为在诊断和检测哮喘时，痰ECP比血清ECP更敏感。Pizzichini[6]在10例哮喘患者中检测血清中ECP升高(P=0.08)，痰中ECP水平也高(P=0.001)。而Tanimoto[22]发现，血中ECP与痰ECP在哮喘儿童中均升高，但彼此之间无相关性，痰中ECP水平在哮喘发作早期即明显升高，在3 d后才开始下降。
支气管肺泡灌洗液(BALF)和支气管粘膜活检，可以直接观察到支气管粘膜损伤和局部浸润的炎性细胞及其产物。痰中EOS、ECP与BALF中测定值存在相关性，但前者非鳞状细胞数和ECP水平比后者更高[23](P<0.001)。由于痰检为非侵入性手段，比BALF更简单、更安全，而且收集的样本更集中和丰富，且具有可重复性等优点，现已广泛用于气道炎症的检测。
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痰液检测刚刚起步，尚处于研究探索阶段，且存在一些争议，如诱导痰的机制尚不完全清楚，痰检指标是否具有很好的疾病代表性，能否在鉴别诊断中成为依据之一；哮喘长期用药是临床问题之一，痰中ECP在治疗后恢复期各阶段的检测是否有显著意义等，还有待更深入的试验研究和统计学处理。当前对哮喘的研究处于多因子、多技术、多机制的洪流之中，痰液检测有望得到进一步的改善并应用于临床。
张丹(1973-),女,第一军医大学硕士生在读,住院医师
参考文献
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1999-10-14, http://www.100md.com
单位：张丹(第一军医大学珠江医院呼吸科，广东 广州 510282)；杨振峰(第一军医大学珠江医院呼吸科，广东 广州 510282)
关键词：哮喘；嗜酸细胞；阳离子蛋白；痰液检测
第一军医大学学报000345 摘要：嗜酸细胞及其阳离子蛋白在哮喘发病中具有重要地位，从血清、肺泡灌洗液和痰液中均可检测出其水平，其中痰检是一项有效、可行、反映性好、可重复进行的无创性方法。痰检有望进一步改进和完善，成为哮喘评定的一项有效指标。
中图分类号：R562.25 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0283-02
哮喘是多种炎性细胞、炎症介质共同参与的慢性气道炎症，检测细胞因子、炎症介质最直接、可靠的方法是获取炎症局部的体液、组织，如支气管粘膜活检、支气管肺泡灌洗液及痰液检测，均能直接、特异地反映局部炎症。其中痰液检测是一项简单易行、准确率较高、不受病情限制且安全的非侵入性方法。参与哮喘发病的多种炎性细胞、炎性介质及细胞因子都可从痰中检出。本文就目前国内外关于哮喘患者痰中嗜酸细胞(EOS)及其阳离子蛋白(ECP)的含量与临床意义的研究进展综述如下。
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1 痰液收集
哮喘患者痰液收集可分为自发痰和诱导痰两种。停服支气管扩张剂6 d，让患者自发地将痰咳至一无菌容器中，即得到自主痰。诱导痰则先吸入沙丁胺醇(喘乐宁)，以抑制诱导过程中可能发生的气道收缩，用高渗盐水雾化吸入，逐渐增高吸入盐水的浓度(3%、4%和5%)，每次7 min，每个吸入浓度后均测FEV1.0以保证安全，同时要求患者漱口咽水，用鼻呼吸，以降低唾液和鼻后滴的污染，再尽力将痰咳至容器内。
诱导痰与自发痰在痰重、总细胞计数、非鳞状细胞比例和类胰蛋白酶水平等方面相近，但自发痰中细胞活力低，诱导痰中活性细胞比例高，鳞状细胞污染少，可以代表深部流体段(fluid-phase)的痰液[1]。诱导痰收集后用倒置显微镜选择没有唾液污染的来自下呼吸道的痰栓，包括所有粘液和密度高的部分。Spanevello 等[2]比较了选择痰和整个痰，二者均可代表下气道的分泌物，具有诊断价值，但选择痰的EOS计数和ECP含量更高，鳞状细胞污染更少。
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经选择后的诱导痰还需进行处理，以减少鳞状细胞的污染并分散细胞，提高ECP水平。处理方法常有：(1)咳痰之前先将唾液(稀薄部分)吐弃，再将痰(粘稠部分)吐入无菌容器内[3]；(2)用PBS(磷酸缓冲盐)处理痰；或(3)用DTT(二巯基苏糖醇)处理。DTT通过除去巯基修饰物中保护巯基的集团，达到细胞分离。DTT可能会降低细胞成活力，但与PBS处理比较，总细胞计数和ECP水平较高，分化细胞比例、IL-5、IL-8等相近，所以DTT处理诱导痰可以有效分离细胞，使ECP水平增高，而且不影响其它介质的检测[4]。
2 哮喘患者痰中EOS、ECP变化
EOS是哮喘中的主要炎性细胞，激活时释放多种蛋白，这些蛋白的生物学功能及其在不同组织中的浓度反映了EOS在疾病中的组织学和临床表现中的作用，其中ECP最为重要。利用放射免疫分析法可以检测ECP在不同组织体液(如血清、痰、支气管肺泡灌洗液(BALF)和鼻灌洗液等)中的水平。
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2.1 EOS、ECP水平与哮喘临床表现的关系
许多研究表明哮喘患者诱导痰中EOS计数和ECP水平显著增高。Spanevello[5]等检测了53例稳定期哮喘患者痰中EOS百分数为(12.2±12.9)%、ECP水平为(827±491)mg/L，与鼻炎[EOS：(0.4±0.8)%、ECP：(127±82)mg/L]和正常对照组[EOS：(0.4±0.7)%、ECP：(157±203)mg/L]相比均升高。Pizzichini[6]等将9例哮喘患者同20例对照(其中正常受试者10例，非阻塞性有吸烟史的支气管炎者10例)进行了统计学检验，结果痰中EOS比例为 5.2%：0.3% ，P < 0.001；ECP含量比为1 040.0 mg/L：455.3 mg/L，P=0.001。由此可见痰中EOS计数与ECP水平具有显著的相关性[7](r=0.532，P<0.01)。同时，EOS计数和ECP水平与平均每周总的症状得分呈显著正相关(r分别为0.52和 0.48)，与平均PEFR呈负相关(r分别为 -0.50和 -0.65)。这些结果表明了气道内EOS的活化可以反映哮喘的症状和气道梗阻[8]。哮喘患者在发作期间最大峰值流速(PEF)明显降低，痰中EOS、ECP水平与PEFR的平均值及呼气流速和PC20呈负相关[8，9]，痰中ECP与FEV1.0%呈显著负相关[10]。
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Fahy[11]对8例哮喘受试者气雾性刺激前后诱导痰中的成分进行了检测和分析，发现诱导痰中EOS平均百分数在过敏原刺激后4 h由0.5%升至12.0% (P<0.05)，并持续至24 h。而ECP水平在刺激后4 h也由39.8升至151.3 mg/L (P<0.05)，且在24 h更高。Fujimoto[8]等还发现痰中ECP水平随哮喘程度加重而显著升高，而EOS仅在重症哮喘升高明显，在轻、中度哮喘无明显差异。哮喘有症状患者痰中ECP比无症状患者高。ECP为EOS活化产物，较EOS指标更为敏感、准确地反映哮喘的严重程度，痰中ECP水平可作为评估哮喘严重程度和监控气道炎症的一项有意义指标[8，12]。
然而，Pizzichizzi[6]应用在接受- 操作特征性(ROC)曲线上定点数据的方法检测实验的灵敏度和特异度时，比较了各种指标的曲线下面积，发现尽管痰中ECP的曲线下面积大于血EOS和血清ECP的曲线下面积，但差异不显著(P≥0.1)，可能为偶然结果，痰中EOS计数则比血清EOS计数更准确。痰液检测早在40年前已有报道，但只是在最近5年才开始发展。大多数学者研究显示哮喘患者痰中EOS、ECP改变与哮喘的临床表现(包括症状出现、肺功能改变、严重等级)是一致的，但此类实验的重复率还不充分，研究例数不够大，少数结果依然存在争议。目前对哮喘进行诊断、评估的指标很多，据统计，在已确诊的哮喘患者，组织胺激发试验的敏感度为48%、PEF测定为65%、痰中ECP敏感度为74%、血清ECP为78%，认为可通过改进痰检测来提高哮喘监控指标的敏感性[13]。
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2.2 在疾病鉴别诊断中的应用
诊断哮喘的同时需要与慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等均可引起气道梗阻和肺功能改变的疾病进行鉴别诊断。以往通过临床表现及肺功能变化的可逆性来鉴别，其客观性不够完善。既然多种体液中ECP水平在哮喘发作时显著升高，那么在其他类型肺部疾病中是否也有同样变化呢？ 前已述及，哮喘患者痰中EOS、ECP明显高于慢性支气管炎患者[9]。Virchow[14]在对7例支气管哮喘与7例慢性支气管炎患者的对比中也发现，每克痰中ECP的浓度在哮喘为(893.4±346.2)mg/L，在慢性支气管炎为(30.0±8.5)mg/L(P=0.002)，并且哮喘患者痰ECP与气道梗阻的程度呈正相关(r=0.76，P =0.05)，而慢性支气管炎患者此相关性不显著(r=0.24，P>0.05)。
Motofima[15]等报道，哮喘患者血清 ECP明显高于COPD患者，血清 ECP与(FEV1.0)% 呈明显负相关，与痰中ECP也显著相关，可以作为鉴别诊断指标之一。但对此也有争议。通常认为，COPD气道炎症以中性粒细胞浸润为主，哮喘以 EOS浸润为主，但有实验发现二者痰中ECP 均升高，哮喘患者每克痰中 ECP浓度为(984.5±1 245.5)mg/L，COPD患者为(417.5±36.5)mg/L，两种病人间无显著差别，不能用作哮喘与COPD的鉴别诊断依据[16，17]。
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2.3 疗效评定
糖皮质激素是哮喘治疗首选的抗炎药物。国内有学者发现哮喘患者经糖皮质激素治疗后，痰中EOS百分数由(11.6±1.7)%降至(4.1±0.7 )%、ECP由(500.3±49.6 )mg/L降至(59.8±10.9 )mg/L，治疗前后有显著差异(P<0.01)[18]。Pizzichini [10]等报道，用强的松治疗后，哮喘的症状、FEV1、血清EOS和ECP在第一个24 h内即有改善，而痰中EOS和ECP直到48 h后才改善，痰液指标恢复晚，提示应用痰液检测EOS和ECP可作为评价治疗效果的一个动态指标。但也有报道[19]，痰液或血清中ECP与PC20 以及痰中ECP与FEV1.0之间的相关性较弱。
多年以来β2受体激动剂仍为临床治疗哮喘的最常用药物之一，Mcivor [20]用其替代激素对比治疗，发现患者用药后虽然症状和肺功能可以达到正常，但痰液检测EOS和ECP水平反而有所升高，提示β2受体激动剂的症状控制作用可能掩盖了病情恶化。已有较多学者将痰液检测EOS和ECP作为疗效评定的一个重要指标。
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3 痰液检测与血清学、BALF检测比较
Sorva[21]等对小儿哮喘患者进行了痰和血清ECP的比较，发现痰和血清中ECP水平较正常受试者高，但痰中ECP与正常受试者的差异更显著，治疗后临床改善伴有痰ECP下降，而血清ECP无变化，可认为在诊断和检测哮喘时，痰ECP比血清ECP更敏感。Pizzichini[6]在10例哮喘患者中检测血清中ECP升高(P=0.08)，痰中ECP水平也高(P=0.001)。而Tanimoto[22]发现，血中ECP与痰ECP在哮喘儿童中均升高，但彼此之间无相关性，痰中ECP水平在哮喘发作早期即明显升高，在3 d后才开始下降。
支气管肺泡灌洗液(BALF)和支气管粘膜活检，可以直接观察到支气管粘膜损伤和局部浸润的炎性细胞及其产物。痰中EOS、ECP与BALF中测定值存在相关性，但前者非鳞状细胞数和ECP水平比后者更高[23](P<0.001)。由于痰检为非侵入性手段，比BALF更简单、更安全，而且收集的样本更集中和丰富，且具有可重复性等优点，现已广泛用于气道炎症的检测。
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痰液检测刚刚起步，尚处于研究探索阶段，且存在一些争议，如诱导痰的机制尚不完全清楚，痰检指标是否具有很好的疾病代表性，能否在鉴别诊断中成为依据之一；哮喘长期用药是临床问题之一，痰中ECP在治疗后恢复期各阶段的检测是否有显著意义等，还有待更深入的试验研究和统计学处理。当前对哮喘的研究处于多因子、多技术、多机制的洪流之中，痰液检测有望得到进一步的改善并应用于临床。
张丹(1973-),女,第一军医大学硕士生在读,住院医师
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