EB病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达
作者：郭长占 韩文龙 潘秀芳 周为民 谷淑燕 田枫 刘斌 高晓明
单位：郭长占 韩文龙 高晓明(北京大学基础医学院免疫学系)；潘秀芳 刘斌(北京大学人体解剖学与组织胚胎学系)；周为民 谷淑燕(北京大学中国预防医学科学院病毒学研究所)；田枫(北京大学实验动物科学部，北京 100083)
关键词：抗原；病毒；基因表达；小鼠，转基因；基因；BLLF1；淋巴细胞
北京医科大学学报000412 [摘 要] 目的：分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达。方法：EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只，尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位。结果：4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达，表达部位在细胞浆中和细胞膜上。结论：表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.11 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0326-02
Expression of Epstein-Barr virus BLLF1 gene in transgenic mice
GUO Chang-Zhan
(Department of Immunology)
HAN Wen-Long
(Department of Immunology)
PAN Xiu-Fang
(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)
, 百拇医药
ZHOU Wei-Min
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
GU Shu-Yan
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
TIAN Feng
(Department of Laboratory Animal Science, Peking University, Beijing 100083, China)
LIU Bin
(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)
, http://www.100md.com
GAO Xiao-Ming
(Department of Immunology)
ABSTRACT Objective:
To analyze the expression of Epstein-Barr virus (EBV) BLLF1 gene expression in peripheral lymphocytes of transgenic founder mice. Methods: BLLF1 expression in peripheral lymphocytes was analyzed by flow cytometry and the localization of expressed products in the lymphocytes was determined by confocal microscopy. Results: BLLF1 gene expression was detectable in two of the four transgenic founders. The expression products localise in the cytoplasm and on the surface of lymphocytes. Conclusion: Transgenic mice harboring EBV BLLF1 gene could be used as a model in pathogenesis of EBV.
, 百拇医药
KEY WORDS Herpesvirus 4, human; Antigens, viral; Gene expression; Mice, transgenic; Gene, BLLF1; Lymphocytes
(J Beijing Med Univ, 2000,32:326-327)
EB病毒是人群中普遍感染的病毒，大多数人可能终生潜伏感染。EB病毒在感染宿主细胞时，首先是病毒外膜上的膜抗原(membrane antigen, MA)与宿主细胞膜上的受体CR2 (CD21)结合，然后经胞饮进入宿主细胞。EB病毒MA是相对分子质量约为22 000～34 000的糖蛋白，CR2是主要表达于B细胞、T细胞和某些上皮细胞膜上的补体 C3d受体，因此EB病毒主要感染B细胞、T细胞以及部分上皮细胞，大量研究表明，EB病毒感染与自身免疫病、淋巴瘤以及某些粘膜恶性变有关[1，2]。EB病毒MA在复制型感染时表达，潜伏感染的EB病毒在体内外因子的刺激下可多次活化从而表达MA。另有研究表明灭活的EB病毒在体外亦可以活化淋巴细胞，显然MA与宿主细胞受体的结合在淋巴细胞的活化中具有重要意义，为了探讨EB病毒感染和人类免疫系统疾病的关系，特别是EB病毒膜抗原在这一过程中的作用，我们用EB病毒膜抗原BLLF1基因制备了转基因小鼠[3]。本文进一步研究BLLF1基因在转基因小鼠体内的表达。
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1 材料与方法1
1.1 转基因小鼠
昆明种小鼠(KM)，用显微注射的方法将BLLF1基因导入单细胞期受精卵，再植入假孕母鼠的输卵管发育，共获得转基因首建鼠4只，分别命名为KM-Tg-EBV1、KM-Tg-EBV2、KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5。其中KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV2为雌性，KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5为雄性。
1.2 MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析[4]
小鼠眼眶静脉丛采血200 μl，肝素抗凝，分装两管(对照管和实验管),加入用正常小鼠脾细胞吸收过的混合正常人血清60 μl作为一抗,对照管加等量PBS，4℃反应30 min。用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450×g离心，5 min)，去掉上清，加入FITC记的羊抗人IgG 60 μl(北京北方同正生物技术公司产品，效价1∶20)，4℃反应30 min。加入1.0 ml红细胞裂解液，室温作用10 min，450×g离心，5 min，去掉上清，用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450 ×g离心，5 min)，细胞重悬于0.5 ml荧光保存液中，上机(Becton Dikinson FACS scan)检测。
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1.3 MA在外周血淋巴细胞中表达的激光扫描共聚焦显微镜分析[5]
淋巴细胞悬液制备方法同1.2，加400 μl 100%(体积分数)甲醇固定，-20 ℃ 30 min，然后加2%(体积分数)的NP-40室温作用5 min以增加细胞膜的通透性。用PBS洗细胞两次，细胞复悬于100 μl PBS(pH 7.4)中，MA表达染色方法同1.2，激光共焦显微镜为Leica TCS NT型。共聚焦系统由Leica公司提供的软件控制，FITC激发波长488 nm，步进马达控制显微镜聚焦旋钮，图像采集镜头为PIANNE-OFLUAR 40×油镜，数值孔镜(NA)为1.25，图像存贮为512×512像素类型，激光功率0.9～1 mW。
2 结果
2.1 BLLF1基因在外周血淋巴细胞中的表达
BLLF1是切去3′末端穿膜序列的EB病毒MA基因，表达的MA可分泌到细胞外，也可以结合在细胞膜上。分泌到细胞外的MA为糖基化完全的MA，而结合在细胞膜上的被认为是糖基化不完全的MA。流式细胞仪检测两只首建鼠(KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5)外周血淋巴细胞MA表达阳性。从图1A、1B可以看出实验管与阴性对照管相比，细胞平均荧光强度增加，表明MA在KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5小鼠外周血淋巴细胞中表达。另外两只首建鼠(KM-Tg-EBV2和KM-Tg-EBV4)外周血淋巴细胞中MA表达阴性(图1C)。
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A， KM-Tg-EBV1； B， KM-Tg-EBV5； C， KM-Tg-EBV4；
Ⅰ， result with the second antibody only；
Ⅱ， result with both the first anti-MA polyclonal antibody
and the second anti-human immunoglobulin antibody.
图1 MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析结果
Figure 1 MA expression in peripheral lymphocytes, cells were stained
, 百拇医药 by indirect immunofluorescence method and analyzed by flow cytometer
2.2 BLLF1基因在外周血淋巴细胞表达部位
激光扫描共焦显微镜不但能对单个细胞细胞膜荧光染色进行观察，还可以提高分辨率并可进行断层扫描以确定抗原表达部位。图2为同一个淋巴细胞的荧光染色图像(a)及断层扫描图像(b)。从图2b可以看出，MA表达在细胞膜上及细胞浆中。
a, a lymph node cell fluorescently stained with FITC labled antibody under
a laser scan confocal microscope; b, layered scan of the same cell.
, http://www.100md.com
图2 MA在外周血淋巴细胞中的表达部位
Figure 2 Localization of MA expressed in peripheral lymphocytes
under a laser scan confocal microscope.
3 讨论
EB病毒的基因组长172 kb，有84个开放读码框架，在EB病毒转化的淋巴细胞中至少可编码9种蛋白。但因EB病毒在自然状态下不能感染小鼠，因此用常规方法不能建立EB病毒感染的小鼠模型。EB病毒BLLF1转基因小鼠的建立为研究EB病毒感染的致病机制解决了这一难题。
自然感染的EB病毒在人体内处于潜伏感染状态时表达潜伏蛋白，有核蛋白(EB virus nuclear antigen, EBNA ) 和潜伏膜蛋白 ( latent membrane protein, LMP)，在活化感染状态时还表达膜抗原。而这些蛋白在致病中各自都起什么作用用常规的动物模型较难确定。BLLF1转基因小鼠外周血淋巴细胞中表达MA，为探讨MA在EB病毒感染中的致病作用提供了一个新的动物模型。多年来人们在研究EB病毒感染与人类疾病的关系时，注意力多集中在EBNA和LMP上，而对MA研究甚少。我们认为既然MA在介导EB病毒感染中起到一种桥梁的作用，那么其在该病毒致病中的作用就更为重要，所以这一小鼠模型的建立具有重要的意义。
, 百拇医药
外源基因在转基因动物体内表达水平受多种因素的影响，主要有：(1)外源基因的整合部位，即所谓的位点效应(site effect)。(2)外源基因的整合拷贝数。(3)细胞因素，一般来说在转基因动物中，不同的组织表达水平是不一样的，有的甚至完全不表达。我们所得4只转基因首建鼠有两只可在外周血淋巴细胞中表达MA，这证明转基因小鼠的构建是成功的，也表明该转基因小鼠模型具有了实用价值。
参考文献
1，Tsoukas CD, Lambris JD. Expression of EBV/C3d receptor on T cell: biological significance[J]. Immunol Today,1993,14(2):56-59
2，Crawford DH, Epstein MA, Bornkamm GW, et al. Biological and Biochemical observations on isolates of EB virus from the malignant epithelial cells of two nasopharyngeal carcinomas[J]. Int J Cancer，1979, 24: 294-302
, 百拇医药
3，郭长占, 周为民, 潘秀芳,等. EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠的制备[J]. 基础医学与临床， 1999, 19(4): 30-32
4，Boos H, Stoehr M, Santer M, et al. Flow cytometric analysis of Epstein-Barr Virus (EBV) latent membrane protein expression in EBV-infected Raji cells[J]. J Gen Virol， 1990, 71: 1811-1815
5，李 楠, 尹 岭, 苏振伦. 激光扫描共聚焦显微术[M]. 北京: 人民军医出版社, 1997. 37-46
(2000-04-01收稿), 百拇医药
单位：郭长占 韩文龙 高晓明(北京大学基础医学院免疫学系)；潘秀芳 刘斌(北京大学人体解剖学与组织胚胎学系)；周为民 谷淑燕(北京大学中国预防医学科学院病毒学研究所)；田枫(北京大学实验动物科学部，北京 100083)
关键词：抗原；病毒；基因表达；小鼠，转基因；基因；BLLF1；淋巴细胞
北京医科大学学报000412 [摘 要] 目的：分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达。方法：EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只，尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位。结果：4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达，表达部位在细胞浆中和细胞膜上。结论：表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.11 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0326-02
Expression of Epstein-Barr virus BLLF1 gene in transgenic mice
GUO Chang-Zhan
(Department of Immunology)
HAN Wen-Long
(Department of Immunology)
PAN Xiu-Fang
(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)
, 百拇医药
ZHOU Wei-Min
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
GU Shu-Yan
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
TIAN Feng
(Department of Laboratory Animal Science, Peking University, Beijing 100083, China)
LIU Bin
(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)
, http://www.100md.com
GAO Xiao-Ming
(Department of Immunology)
ABSTRACT Objective:
To analyze the expression of Epstein-Barr virus (EBV) BLLF1 gene expression in peripheral lymphocytes of transgenic founder mice. Methods: BLLF1 expression in peripheral lymphocytes was analyzed by flow cytometry and the localization of expressed products in the lymphocytes was determined by confocal microscopy. Results: BLLF1 gene expression was detectable in two of the four transgenic founders. The expression products localise in the cytoplasm and on the surface of lymphocytes. Conclusion: Transgenic mice harboring EBV BLLF1 gene could be used as a model in pathogenesis of EBV.
, 百拇医药
KEY WORDS Herpesvirus 4, human; Antigens, viral; Gene expression; Mice, transgenic; Gene, BLLF1; Lymphocytes
(J Beijing Med Univ, 2000,32:326-327)
EB病毒是人群中普遍感染的病毒，大多数人可能终生潜伏感染。EB病毒在感染宿主细胞时，首先是病毒外膜上的膜抗原(membrane antigen, MA)与宿主细胞膜上的受体CR2 (CD21)结合，然后经胞饮进入宿主细胞。EB病毒MA是相对分子质量约为22 000～34 000的糖蛋白，CR2是主要表达于B细胞、T细胞和某些上皮细胞膜上的补体 C3d受体，因此EB病毒主要感染B细胞、T细胞以及部分上皮细胞，大量研究表明，EB病毒感染与自身免疫病、淋巴瘤以及某些粘膜恶性变有关[1，2]。EB病毒MA在复制型感染时表达，潜伏感染的EB病毒在体内外因子的刺激下可多次活化从而表达MA。另有研究表明灭活的EB病毒在体外亦可以活化淋巴细胞，显然MA与宿主细胞受体的结合在淋巴细胞的活化中具有重要意义，为了探讨EB病毒感染和人类免疫系统疾病的关系，特别是EB病毒膜抗原在这一过程中的作用，我们用EB病毒膜抗原BLLF1基因制备了转基因小鼠[3]。本文进一步研究BLLF1基因在转基因小鼠体内的表达。
, http://www.100md.com
1 材料与方法1
1.1 转基因小鼠
昆明种小鼠(KM)，用显微注射的方法将BLLF1基因导入单细胞期受精卵，再植入假孕母鼠的输卵管发育，共获得转基因首建鼠4只，分别命名为KM-Tg-EBV1、KM-Tg-EBV2、KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5。其中KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV2为雌性，KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5为雄性。
1.2 MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析[4]
小鼠眼眶静脉丛采血200 μl，肝素抗凝，分装两管(对照管和实验管),加入用正常小鼠脾细胞吸收过的混合正常人血清60 μl作为一抗,对照管加等量PBS，4℃反应30 min。用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450×g离心，5 min)，去掉上清，加入FITC记的羊抗人IgG 60 μl(北京北方同正生物技术公司产品，效价1∶20)，4℃反应30 min。加入1.0 ml红细胞裂解液，室温作用10 min，450×g离心，5 min，去掉上清，用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450 ×g离心，5 min)，细胞重悬于0.5 ml荧光保存液中，上机(Becton Dikinson FACS scan)检测。
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1.3 MA在外周血淋巴细胞中表达的激光扫描共聚焦显微镜分析[5]
淋巴细胞悬液制备方法同1.2，加400 μl 100%(体积分数)甲醇固定，-20 ℃ 30 min，然后加2%(体积分数)的NP-40室温作用5 min以增加细胞膜的通透性。用PBS洗细胞两次，细胞复悬于100 μl PBS(pH 7.4)中，MA表达染色方法同1.2，激光共焦显微镜为Leica TCS NT型。共聚焦系统由Leica公司提供的软件控制，FITC激发波长488 nm，步进马达控制显微镜聚焦旋钮，图像采集镜头为PIANNE-OFLUAR 40×油镜，数值孔镜(NA)为1.25，图像存贮为512×512像素类型，激光功率0.9～1 mW。
2 结果
2.1 BLLF1基因在外周血淋巴细胞中的表达
BLLF1是切去3′末端穿膜序列的EB病毒MA基因，表达的MA可分泌到细胞外，也可以结合在细胞膜上。分泌到细胞外的MA为糖基化完全的MA，而结合在细胞膜上的被认为是糖基化不完全的MA。流式细胞仪检测两只首建鼠(KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5)外周血淋巴细胞MA表达阳性。从图1A、1B可以看出实验管与阴性对照管相比，细胞平均荧光强度增加，表明MA在KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5小鼠外周血淋巴细胞中表达。另外两只首建鼠(KM-Tg-EBV2和KM-Tg-EBV4)外周血淋巴细胞中MA表达阴性(图1C)。
, http://www.100md.com
A， KM-Tg-EBV1； B， KM-Tg-EBV5； C， KM-Tg-EBV4；
Ⅰ， result with the second antibody only；
Ⅱ， result with both the first anti-MA polyclonal antibody
and the second anti-human immunoglobulin antibody.
图1 MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析结果
Figure 1 MA expression in peripheral lymphocytes, cells were stained
, 百拇医药 by indirect immunofluorescence method and analyzed by flow cytometer
2.2 BLLF1基因在外周血淋巴细胞表达部位
激光扫描共焦显微镜不但能对单个细胞细胞膜荧光染色进行观察，还可以提高分辨率并可进行断层扫描以确定抗原表达部位。图2为同一个淋巴细胞的荧光染色图像(a)及断层扫描图像(b)。从图2b可以看出，MA表达在细胞膜上及细胞浆中。
a, a lymph node cell fluorescently stained with FITC labled antibody under
a laser scan confocal microscope; b, layered scan of the same cell.
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图2 MA在外周血淋巴细胞中的表达部位
Figure 2 Localization of MA expressed in peripheral lymphocytes
under a laser scan confocal microscope.
3 讨论
EB病毒的基因组长172 kb，有84个开放读码框架，在EB病毒转化的淋巴细胞中至少可编码9种蛋白。但因EB病毒在自然状态下不能感染小鼠，因此用常规方法不能建立EB病毒感染的小鼠模型。EB病毒BLLF1转基因小鼠的建立为研究EB病毒感染的致病机制解决了这一难题。
自然感染的EB病毒在人体内处于潜伏感染状态时表达潜伏蛋白，有核蛋白(EB virus nuclear antigen, EBNA ) 和潜伏膜蛋白 ( latent membrane protein, LMP)，在活化感染状态时还表达膜抗原。而这些蛋白在致病中各自都起什么作用用常规的动物模型较难确定。BLLF1转基因小鼠外周血淋巴细胞中表达MA，为探讨MA在EB病毒感染中的致病作用提供了一个新的动物模型。多年来人们在研究EB病毒感染与人类疾病的关系时，注意力多集中在EBNA和LMP上，而对MA研究甚少。我们认为既然MA在介导EB病毒感染中起到一种桥梁的作用，那么其在该病毒致病中的作用就更为重要，所以这一小鼠模型的建立具有重要的意义。
, 百拇医药
外源基因在转基因动物体内表达水平受多种因素的影响，主要有：(1)外源基因的整合部位，即所谓的位点效应(site effect)。(2)外源基因的整合拷贝数。(3)细胞因素，一般来说在转基因动物中，不同的组织表达水平是不一样的，有的甚至完全不表达。我们所得4只转基因首建鼠有两只可在外周血淋巴细胞中表达MA，这证明转基因小鼠的构建是成功的，也表明该转基因小鼠模型具有了实用价值。
参考文献
1，Tsoukas CD, Lambris JD. Expression of EBV/C3d receptor on T cell: biological significance[J]. Immunol Today,1993,14(2):56-59
2，Crawford DH, Epstein MA, Bornkamm GW, et al. Biological and Biochemical observations on isolates of EB virus from the malignant epithelial cells of two nasopharyngeal carcinomas[J]. Int J Cancer，1979, 24: 294-302
, 百拇医药
3，郭长占, 周为民, 潘秀芳,等. EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠的制备[J]. 基础医学与临床， 1999, 19(4): 30-32
4，Boos H, Stoehr M, Santer M, et al. Flow cytometric analysis of Epstein-Barr Virus (EBV) latent membrane protein expression in EBV-infected Raji cells[J]. J Gen Virol， 1990, 71: 1811-1815
5，李 楠, 尹 岭, 苏振伦. 激光扫描共聚焦显微术[M]. 北京: 人民军医出版社, 1997. 37-46
(2000-04-01收稿), 百拇医药