慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T辅助细胞1、2型因子的表达
作者：姜荣龙 卢桥生 骆抗先 富宁
单位：姜荣龙 卢桥生 骆抗先(510515 广州，第一军医大学南方医院感染内科)；富宁(第一军医大学免疫学教研室)
关键词：肝炎病毒，乙型；白细胞介素-4；干扰素-γ
中华传染病杂志000108【摘要】目的 了解慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+T细胞内T辅助细胞1、 2型(Th1/Th2)因子、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的表达情况，以测定Th0 /Th1/Th2细胞 的百分数，探明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离PBMC，在佛波二酯(PMA)、Ionomycin、Monensin的刺激下 ，采用流式细胞检测仪(FACS)对慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ表 达进行分析。结果 正常对照组，2.3%～18.6%的CD4+T细胞为Th1细胞，0.9%～9.2%为Th2细胞；在慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞中，以Th0细胞居多；而Th1细胞则随 着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而明显增多，在炎症活动明显的慢性乙型肝炎，其Th1 百分数明显高于炎症活动呈静止状态的慢性乙型肝炎；Th2细胞在慢性HBV感染的不同阶段则 较为恒定，但明显高于对照组。结论 Th1细胞与炎症活动呈正相关，Th2细胞可能与HBV感染的慢性化相关 联。
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Thelper 1,2 phenotype cytokines expression in perip heral blood of the patients with chronic hepatitis Bvirus Infection
JIANG Ronglong LU Qiaosheng LUO Kangxian et al.
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Me dical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】Objective The composition of T helper 0,1,2 cell(Th0/Th1/Th2) in chronic hepatitis B virve (HBV) infected individuals was investig ated by determining the expression of IL-4/IFN-γ in a single CD4+T cell iso late from periphesal blood mononuclear cell (PBMC), and the role of Th1/Th2 cy tokines in chronic HBV-infection was analyzed. Methods PBMCs from chronic HBV infected individuals were separa ted routinely, stimulated by phorboe-12-myristate-13-asetate (PMA)/Ionomyci n/Monensin, and the produ ction of interleukin-4 (IL-4) interferon-γ (INF-γ) by CD4+T cells in PBM C was determined by fluorescence activated call sorting (FACS) analysis. Results The percentage of IFN-γ-producing T cells and IL-4-p roducing T cells ranged from 2.3% to 18.6% and from 1.1% to 8.7% respectively in CD4+T cells from non-infected individuals. The majority of CD4+T cells fro m PBMCs in chronic HBV-infected individuals were Th0 cells. The percentage of T h1 cells increased significantly with the increasing of hepatic inflammation act ivity. The per centage of Th1 cells in advanced period of chronic hepatitis B was higher than t hat in stable period of chronic hepatitis B. The percentage of Th2 cells in CD4+T cells from HBV-infected individuals did not differ significantly in dif ferent stages, but higher than that of controls. Conclusions The results indicated that Th1 phenotype cytokines were associated with hepatic inflammatory activity of chronic hepatitis B and Th2 cel ls may be associated with the chronicity of HBV infection.
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【Key words】Hepatitis B virus; Interleukin-4; Interferon-γ
小鼠T细胞克隆性分析将T辅助细胞(Th)分为Th1、Th2。Th1细胞以分泌白细胞介素-2(Inter l eukin-2, IL-2)、干扰素-γ(Interferon-gamma, IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(Tumor necrosis factor-beta, TNF-β)为特征，主要参与细胞介导的免疫反应并在抵御病毒等 细胞内致病因子方面起着重要作用，而Th2细胞以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10为特征 ，主要调节体液免疫反应并在抵御细胞外致病因子方面发挥作用，并与细胞内病原所致的进 展性疾病相关联[1～3]。
在乙型肝炎病毒(HBV)感染中，病毒对感染的肝细胞并没有直接的致细胞病变作用，与HBV感 染相关的急慢性肝炎被认为是免疫介导性疾病，而且对自肝脏分离的T细胞克隆的研究认为T 细胞介导的细胞毒性可引起肝细胞的损伤。体外实验也已证实，通过识别肝细胞上HBV编码 的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以HLA-1类限制的 方式损伤肝细胞。但其确切机制尚未阐明[4]。Th1/Th2细胞在宿主抵御病毒感染 中的作用近来备受关注[5]，为阐明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采 用流式细胞检测仪(FACS)对慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)中单个Th1/Th2细胞内IL -4和IFN-γ的产生进行分析。
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材料与方法
一、病例
本研究所有病例为第一军医大学南方医院感染内科1998年6～12月门诊及住院患者。按照199 5年(北京)传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案(试行)》的临床肝炎诊 断标准，选择34例慢性HBV感染者，分为三组，慢性HBV携带者(AsC)12例、慢性乙型肝炎(CH B)中度13例及重度9例；正常对照12例取自门诊健康体检者。46例受检者中女16例，男30例 ，年龄17～54岁(平均32.6岁)。慢性HBV感染者的HBV血清学检查：HBsAg均为阳性，抗 -HBs 阴性(酶免疫法)，25例HBeAg阳性，9例抗-HBe阳性；正常对照组除3例抗-HBs阳性外，其 余9例H BV血清标志全部阴性，所有受检者抗-HCV均阴性(第二代酶免疫法试剂盒)。除AsC外的所有 慢性HBV感染者均经肝组织活检证实。
二、细胞
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取新鲜肝素抗凝全血3 ml，常规密度梯度离心分离PBMC，以鼠抗人CD8+单克隆抗体(Beckm an Coulter Reagent, USA)及新鲜兔血清处理，去除CD8+ T细胞，制备无CD8+ T细胞的 PBMC。
三、FACS分析细胞内产生的细胞因子
参照Jung等[6]方法进行改进。新鲜分离的无CD8+T细胞的PBMC，在塑料培养皿 上贴附培养1.5 h后，移去贴附的单核细胞。以T细胞刺激剂佛波二酯PMA(Sigma)1 ng/ml、 钙离子导入剂Ionomycin 1 μmol(Sigma)、细胞内转移阻断剂Monensin 1 μmol(Sigma) 刺激细 胞37℃4 h；离心，去上清；以含0.5%(w/V)牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次，离心 ，去上清；以含4%多聚甲醛的PBS固定液处理细胞样品，10 min，以含10%皂素、0.5%牛血清 白蛋白及10%混合的人血清的PBS渗透液处理细胞样品10 min，避光冰浴；加入鼠抗人IFN- γ单克隆抗体(PE, Pharmingen Reagent, USA)、IL-4单克隆抗体(FITC,Pharmingen Reag ent, USA)45 min，4℃避光，以含0.5%(w/V)牛血清白蛋白PBS洗涤1次，离心，去上清，加5 00 μl PBS混匀细胞，用流式细胞仪检测(FACS)，获得产生IFN-γ、IL-4细胞的百分率。 所有病例均同步设一未加刺激剂的细胞样品作为对照。
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结果
一、细胞因子的细胞内染色
为了能测定慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ的Th1/Th2细胞百分率，我们根据文献 所述方法改进。通过放弃贴壁的单核细胞，纯化淋巴细胞，并以PMA和ionomycin刺激4 h， 固定后，采用对照IgG或鼠抗人IL-4单克隆抗体或IFN-γ单克隆抗体标记待测细胞样品， 以测定细胞内IL -4、IFN-γ的表达。培养液中未加任何刺激剂时，以任一单克隆抗体鉴定均未获得明 显的 荧光信号，表达IL-4或IFN-γ的细胞百分数分别仅为0.38%和0.67%；而在PMA和Ionom ycin 刺激下，表达IL-4或IFN-γ的细胞百分数分别为3.21%和28.86%，但对照IgG为阴性。 Mone nsin能促进新合成的蛋白质在高尔基复合体的聚集，未经PMA和Ionomycin刺激的细胞，在Mo nensin的作用下，仍未检测到这2种细胞因子的表达。
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二、慢性HBV感染者外周血中表达IL-4、IFN-γ的Th1/Th2细胞的百分率
正常对照组中2.3%～18.6%的细胞仅表达IFN-γ，为Th1细胞；0.9%～9.2%的细胞只表达IL -4，为Th2细胞。在所有实验组，均以正常对照作为内参照。经过方差分析，结果显示正常 对照组Th1细胞的百分率明显高于三组慢性HBV感染组(P<0.05)，而在三组慢性HBV感染 组中，Th1细胞随着肝组织炎症活动的加剧，其比例也明显增加(P<0.05)；而Th2细胞 的百分数，在不同类型的CHB中，差异无显著性(P>0.05)，但较之对照组明显增高(P <0.05)。
讨论
Th1/Th2细胞失调在慢性HBV感染中的作用日益受到人们的关注。HBV感染的慢性化一直来普 遍认为主要是人体细胞免疫功能降低所致，但其细胞免疫功能低下的机制尚未阐明。Th1/Th 2类细胞的不平衡似能较合理的解释这一机制。曾有文献报道[7]，急性自限性乙 型肝炎急性期产生Th1类细胞因子明显比对照组高，恢复期患者Th细胞属Th0，后者为Th1/Th 2的 前体细胞，同时分泌低水平Th1/Th2细胞因子。Th1细胞可增强机体的细胞免疫应答功能，有 利于清除病毒，但同时与肝细胞的炎症损伤相关联。在CHB，自肝组织分离的Th细胞克隆，7 5%为Th0细胞，25%为Th1细胞[8，9]。但是，自PBMC中，分析不同类型慢性HBV感 染Th0/Th1/Th2细胞分布则未见报道。本文结果提示：CHB外周血中，Th0占大多数，少部分 为Th2细胞，但是随着肝组织炎症活动的加剧，Th1类细胞比例则明显增加，提示Th1细胞与 肝组织损伤密切关联。我们假设在HBV感染期间是否存在Th0→Th1细胞的转换，使得Th1细胞 占主导地位，因而直接或间接地增强NK细胞、巨噬细胞、尤其是CTL细胞的活性，促进细胞 免疫反应，加重肝组织的炎症损伤。Th2细胞的百分数在不同类型的CHB中，无明显差异，但 较之对照组明显增高。提示Th2细胞与HBV感染的慢性化相关。
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参考文献
1，Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of l ym phokine secretion lead to different functional property. Ann Rev Immunol,1989,7: 145-173.
2，Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG, et al. IL-10 is produced by subse ts of human CD4+T cell clones and peripheral blood T cells. J Immunol, 1992,14 9:2378-2384.
3，Firestein GS, Roeder WD, Laxer JA, et al. A new murine CD4+T cell subset s with an unrestricted cytokine profile. J Immunol, 1989,143:518-525.
, 百拇医药
4，Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol , 1995,13:29-60.
5，Barnaba V, Franco A, Paroli M, et al. Selective expansion of cytotoxic T lymp hocytes with a CD4+ CD56+ surface phenotype and a T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus. J Immunol, 1994,152:3074-3087.
6，Jung T, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods, 1993,159:197-207.
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7，Penna A, Del Prete G, Cavalli A, et al. Predominant T helper 1 cytokine profi le of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited he patitis B. Hepatology, 1997,25:1022-1027.
8，Bertoletti A, D'Elios MM, Boni C, et al. Different cytokine profiles of intra hepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infection. Gastroen terology, 1997,112:193-199.
9，Vingerhoets J, Michielsen P, Vanham G, et al. HBV-specific lymphoproliferati ve and cytokine responses in patients with chronic hepatitis B. J Hepatol,1998,2 8:8-16.
收稿日期：1999-08-03, http://www.100md.com
单位：姜荣龙 卢桥生 骆抗先(510515 广州，第一军医大学南方医院感染内科)；富宁(第一军医大学免疫学教研室)
关键词：肝炎病毒，乙型；白细胞介素-4；干扰素-γ
中华传染病杂志000108【摘要】目的 了解慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+T细胞内T辅助细胞1、 2型(Th1/Th2)因子、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的表达情况，以测定Th0 /Th1/Th2细胞 的百分数，探明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离PBMC，在佛波二酯(PMA)、Ionomycin、Monensin的刺激下 ，采用流式细胞检测仪(FACS)对慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ表 达进行分析。结果 正常对照组，2.3%～18.6%的CD4+T细胞为Th1细胞，0.9%～9.2%为Th2细胞；在慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞中，以Th0细胞居多；而Th1细胞则随 着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而明显增多，在炎症活动明显的慢性乙型肝炎，其Th1 百分数明显高于炎症活动呈静止状态的慢性乙型肝炎；Th2细胞在慢性HBV感染的不同阶段则 较为恒定，但明显高于对照组。结论 Th1细胞与炎症活动呈正相关，Th2细胞可能与HBV感染的慢性化相关 联。
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Thelper 1,2 phenotype cytokines expression in perip heral blood of the patients with chronic hepatitis Bvirus Infection
JIANG Ronglong LU Qiaosheng LUO Kangxian et al.
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Me dical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】Objective The composition of T helper 0,1,2 cell(Th0/Th1/Th2) in chronic hepatitis B virve (HBV) infected individuals was investig ated by determining the expression of IL-4/IFN-γ in a single CD4+T cell iso late from periphesal blood mononuclear cell (PBMC), and the role of Th1/Th2 cy tokines in chronic HBV-infection was analyzed. Methods PBMCs from chronic HBV infected individuals were separa ted routinely, stimulated by phorboe-12-myristate-13-asetate (PMA)/Ionomyci n/Monensin, and the produ ction of interleukin-4 (IL-4) interferon-γ (INF-γ) by CD4+T cells in PBM C was determined by fluorescence activated call sorting (FACS) analysis. Results The percentage of IFN-γ-producing T cells and IL-4-p roducing T cells ranged from 2.3% to 18.6% and from 1.1% to 8.7% respectively in CD4+T cells from non-infected individuals. The majority of CD4+T cells fro m PBMCs in chronic HBV-infected individuals were Th0 cells. The percentage of T h1 cells increased significantly with the increasing of hepatic inflammation act ivity. The per centage of Th1 cells in advanced period of chronic hepatitis B was higher than t hat in stable period of chronic hepatitis B. The percentage of Th2 cells in CD4+T cells from HBV-infected individuals did not differ significantly in dif ferent stages, but higher than that of controls. Conclusions The results indicated that Th1 phenotype cytokines were associated with hepatic inflammatory activity of chronic hepatitis B and Th2 cel ls may be associated with the chronicity of HBV infection.
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【Key words】Hepatitis B virus; Interleukin-4; Interferon-γ
小鼠T细胞克隆性分析将T辅助细胞(Th)分为Th1、Th2。Th1细胞以分泌白细胞介素-2(Inter l eukin-2, IL-2)、干扰素-γ(Interferon-gamma, IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(Tumor necrosis factor-beta, TNF-β)为特征，主要参与细胞介导的免疫反应并在抵御病毒等 细胞内致病因子方面起着重要作用，而Th2细胞以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10为特征 ，主要调节体液免疫反应并在抵御细胞外致病因子方面发挥作用，并与细胞内病原所致的进 展性疾病相关联[1～3]。
在乙型肝炎病毒(HBV)感染中，病毒对感染的肝细胞并没有直接的致细胞病变作用，与HBV感 染相关的急慢性肝炎被认为是免疫介导性疾病，而且对自肝脏分离的T细胞克隆的研究认为T 细胞介导的细胞毒性可引起肝细胞的损伤。体外实验也已证实，通过识别肝细胞上HBV编码 的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以HLA-1类限制的 方式损伤肝细胞。但其确切机制尚未阐明[4]。Th1/Th2细胞在宿主抵御病毒感染 中的作用近来备受关注[5]，为阐明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采 用流式细胞检测仪(FACS)对慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)中单个Th1/Th2细胞内IL -4和IFN-γ的产生进行分析。
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材料与方法
一、病例
本研究所有病例为第一军医大学南方医院感染内科1998年6～12月门诊及住院患者。按照199 5年(北京)传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案(试行)》的临床肝炎诊 断标准，选择34例慢性HBV感染者，分为三组，慢性HBV携带者(AsC)12例、慢性乙型肝炎(CH B)中度13例及重度9例；正常对照12例取自门诊健康体检者。46例受检者中女16例，男30例 ，年龄17～54岁(平均32.6岁)。慢性HBV感染者的HBV血清学检查：HBsAg均为阳性，抗 -HBs 阴性(酶免疫法)，25例HBeAg阳性，9例抗-HBe阳性；正常对照组除3例抗-HBs阳性外，其 余9例H BV血清标志全部阴性，所有受检者抗-HCV均阴性(第二代酶免疫法试剂盒)。除AsC外的所有 慢性HBV感染者均经肝组织活检证实。
二、细胞
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取新鲜肝素抗凝全血3 ml，常规密度梯度离心分离PBMC，以鼠抗人CD8+单克隆抗体(Beckm an Coulter Reagent, USA)及新鲜兔血清处理，去除CD8+ T细胞，制备无CD8+ T细胞的 PBMC。
三、FACS分析细胞内产生的细胞因子
参照Jung等[6]方法进行改进。新鲜分离的无CD8+T细胞的PBMC，在塑料培养皿 上贴附培养1.5 h后，移去贴附的单核细胞。以T细胞刺激剂佛波二酯PMA(Sigma)1 ng/ml、 钙离子导入剂Ionomycin 1 μmol(Sigma)、细胞内转移阻断剂Monensin 1 μmol(Sigma) 刺激细 胞37℃4 h；离心，去上清；以含0.5%(w/V)牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次，离心 ，去上清；以含4%多聚甲醛的PBS固定液处理细胞样品，10 min，以含10%皂素、0.5%牛血清 白蛋白及10%混合的人血清的PBS渗透液处理细胞样品10 min，避光冰浴；加入鼠抗人IFN- γ单克隆抗体(PE, Pharmingen Reagent, USA)、IL-4单克隆抗体(FITC,Pharmingen Reag ent, USA)45 min，4℃避光，以含0.5%(w/V)牛血清白蛋白PBS洗涤1次，离心，去上清，加5 00 μl PBS混匀细胞，用流式细胞仪检测(FACS)，获得产生IFN-γ、IL-4细胞的百分率。 所有病例均同步设一未加刺激剂的细胞样品作为对照。
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一、细胞因子的细胞内染色
为了能测定慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ的Th1/Th2细胞百分率，我们根据文献 所述方法改进。通过放弃贴壁的单核细胞，纯化淋巴细胞，并以PMA和ionomycin刺激4 h， 固定后，采用对照IgG或鼠抗人IL-4单克隆抗体或IFN-γ单克隆抗体标记待测细胞样品， 以测定细胞内IL -4、IFN-γ的表达。培养液中未加任何刺激剂时，以任一单克隆抗体鉴定均未获得明 显的 荧光信号，表达IL-4或IFN-γ的细胞百分数分别仅为0.38%和0.67%；而在PMA和Ionom ycin 刺激下，表达IL-4或IFN-γ的细胞百分数分别为3.21%和28.86%，但对照IgG为阴性。 Mone nsin能促进新合成的蛋白质在高尔基复合体的聚集，未经PMA和Ionomycin刺激的细胞，在Mo nensin的作用下，仍未检测到这2种细胞因子的表达。
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二、慢性HBV感染者外周血中表达IL-4、IFN-γ的Th1/Th2细胞的百分率
正常对照组中2.3%～18.6%的细胞仅表达IFN-γ，为Th1细胞；0.9%～9.2%的细胞只表达IL -4，为Th2细胞。在所有实验组，均以正常对照作为内参照。经过方差分析，结果显示正常 对照组Th1细胞的百分率明显高于三组慢性HBV感染组(P<0.05)，而在三组慢性HBV感染 组中，Th1细胞随着肝组织炎症活动的加剧，其比例也明显增加(P<0.05)；而Th2细胞 的百分数，在不同类型的CHB中，差异无显著性(P>0.05)，但较之对照组明显增高(P <0.05)。
讨论
Th1/Th2细胞失调在慢性HBV感染中的作用日益受到人们的关注。HBV感染的慢性化一直来普 遍认为主要是人体细胞免疫功能降低所致，但其细胞免疫功能低下的机制尚未阐明。Th1/Th 2类细胞的不平衡似能较合理的解释这一机制。曾有文献报道[7]，急性自限性乙 型肝炎急性期产生Th1类细胞因子明显比对照组高，恢复期患者Th细胞属Th0，后者为Th1/Th 2的 前体细胞，同时分泌低水平Th1/Th2细胞因子。Th1细胞可增强机体的细胞免疫应答功能，有 利于清除病毒，但同时与肝细胞的炎症损伤相关联。在CHB，自肝组织分离的Th细胞克隆，7 5%为Th0细胞，25%为Th1细胞[8，9]。但是，自PBMC中，分析不同类型慢性HBV感 染Th0/Th1/Th2细胞分布则未见报道。本文结果提示：CHB外周血中，Th0占大多数，少部分 为Th2细胞，但是随着肝组织炎症活动的加剧，Th1类细胞比例则明显增加，提示Th1细胞与 肝组织损伤密切关联。我们假设在HBV感染期间是否存在Th0→Th1细胞的转换，使得Th1细胞 占主导地位，因而直接或间接地增强NK细胞、巨噬细胞、尤其是CTL细胞的活性，促进细胞 免疫反应，加重肝组织的炎症损伤。Th2细胞的百分数在不同类型的CHB中，无明显差异，但 较之对照组明显增高。提示Th2细胞与HBV感染的慢性化相关。
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1，Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of l ym phokine secretion lead to different functional property. Ann Rev Immunol,1989,7: 145-173.
2，Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG, et al. IL-10 is produced by subse ts of human CD4+T cell clones and peripheral blood T cells. J Immunol, 1992,14 9:2378-2384.
3，Firestein GS, Roeder WD, Laxer JA, et al. A new murine CD4+T cell subset s with an unrestricted cytokine profile. J Immunol, 1989,143:518-525.
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4，Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol , 1995,13:29-60.
5，Barnaba V, Franco A, Paroli M, et al. Selective expansion of cytotoxic T lymp hocytes with a CD4+ CD56+ surface phenotype and a T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus. J Immunol, 1994,152:3074-3087.
6，Jung T, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods, 1993,159:197-207.
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7，Penna A, Del Prete G, Cavalli A, et al. Predominant T helper 1 cytokine profi le of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited he patitis B. Hepatology, 1997,25:1022-1027.
8，Bertoletti A, D'Elios MM, Boni C, et al. Different cytokine profiles of intra hepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infection. Gastroen terology, 1997,112:193-199.
9，Vingerhoets J, Michielsen P, Vanham G, et al. HBV-specific lymphoproliferati ve and cytokine responses in patients with chronic hepatitis B. J Hepatol,1998,2 8:8-16.
收稿日期：1999-08-03, http://www.100md.com